曾躍平 朱晨雨 陳程 賈倩楠 晉紅中

100730北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科 協(xié)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種慢性炎癥性皮膚病，臨床特征為嚴(yán)重瘙癢和復(fù)發(fā)性濕疹樣皮損［1］。AD發(fā)病機(jī)制主要包括表皮屏障結(jié)構(gòu)和功能異常以及免疫功能紊亂，在AD的發(fā)病過程中，二者存在相互作用、互為因果的聯(lián)系［2］。本課題組的前期研究證實，白介素13（IL?13）可以下調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中表皮屏障相關(guān)蛋白如絲聚合蛋白、兜甲蛋白和內(nèi)披蛋白的表達(dá)，而上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中microRNA?143（miR?143）的表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)IL?13對以上3種蛋白表達(dá)的影響［3］。我們擬在前期工作基礎(chǔ)上，探討miR?143是否可以影響IL?13誘導(dǎo)的組織激肽釋放酶7（kallikrein 7，KLK7）的表達(dá)，為miR?143在AD發(fā)病中的作用提供更多的理論依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞系、試劑和儀器

正常人皮膚原代角質(zhì)形成細(xì)胞（primary normal human epidermal keratinocytes，NHEK）、無血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基（德國Promo Cell公司），重組人IL?13蛋白（美國RD公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、超級ECL發(fā)光試劑盒（美國Thermo Fisher公司），Trizol RNA提取液、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），SYBR Green qPCR Mix（廣州東盛生物科技有限公司），miR?143 mimics、miR?NC（microRNA mimics陰性對照）（廣州銳博生物科技有限公司），Bradford蛋白濃度測定試劑盒、iQ5實時熒光定量PCR儀（美國Bio?Rad公司），抗KLK7抗體（美國Santa Cruz公司）、3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（天津三箭生物技術(shù)有限公司），天能Tanon 4200全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)和分組：NHEK常規(guī)復(fù)蘇成功后，用無血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞傳至3至5代時，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中（1×105/孔）,接受以下分組處理。①加入終濃度分別為0、2、10、50 μg/L的IL?13，繼續(xù)孵育24 h后終止培養(yǎng)；②加入50 μg/L IL?13，分別孵育0、6、12、24、48 h后終止培養(yǎng)。以上兩部分實驗每組設(shè)3個復(fù)孔，終止培養(yǎng)后收集細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA用于后續(xù)實驗。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：在轉(zhuǎn)染前1 d，用胰蛋白酶消化細(xì)胞后，以3 × 105個/孔接種于6孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞融合度為70%～80%。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，換新鮮無抗生素完全培養(yǎng)基，37℃孵育，轉(zhuǎn)染前拍照記錄。采用Lipofectamine 2000將miR?143 mimics和miR?NC分別轉(zhuǎn)染入NHEK，24 h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（熒光細(xì)胞比例超過80%認(rèn)為達(dá)到轉(zhuǎn)染要求），拍照記錄。NHEK分為4組，①NHEK組：不接受轉(zhuǎn)染或 IL?13刺激；②IL?13組：僅用50 μg/L IL?13處理；③miR?NC組：轉(zhuǎn)染microRNA mimics陰性對照 24 h 后用 50 μg/L IL?13 處理；④miR?143組：轉(zhuǎn)染miR?143 mimics 24 h后用50 μg/L IL?13處理，孵育24 h，每組設(shè)3個復(fù)孔。收集細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，用于后續(xù)實驗。

3.實時熒光定量PCR檢測KLK7基因mRNA水平：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照標(biāo)準(zhǔn)實驗流程將上述實驗中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR Green qPCR Mix試劑盒按說明書擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系如下：cDNA模板5 μl，正反向引物各0.5 μl，2 × SYBR Green qPCR Mix 10 μl，去離子水4 μl，最終反應(yīng)體積20 μl。引物序列：KLK7正向引物5′?GTGACTCAGGGGGACCGTT ?3′，反 向 引 物 5′?TCAGTGTGGCGTTAGCGAT?3′；β肌動蛋白正向引物5′?GCACCCAGCACAATGAAGA?3′，反向引物5′?AATAAAGCCATGCCAATCTCA?3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以β肌動蛋白為內(nèi)參照，記錄各實驗孔 Ct值，以 2?ΔΔCt表示目的基因的相對表達(dá)水平。

4.免疫印跡實驗檢測KLK7蛋白水平：采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定上述實驗中提取蛋白樣本濃度。制備聚丙烯酰胺凝膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜。采用封閉液室溫封閉PVDF膜1 h，用新鮮配制的封閉液稀釋一抗（抗體稀釋比例KLK7 1∶200，GAPDH 1∶3 000），4℃過夜孵育。洗膜后加入二抗（稀釋比均為1∶3 000），室溫孵育PVDF膜1 h。以GAPDH為內(nèi)參蛋白。洗膜后采用超級ECL發(fā)光試劑盒化學(xué)發(fā)光，在化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)中顯影。實驗重復(fù)3次。使用ImageJ 1.51k軟件測量目的蛋白條帶的灰度值，并與GAPDH蛋白條帶的灰度值對比，計算目的蛋白相對表達(dá)水平。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SAS 9.4統(tǒng)計軟件分析。計量資料服從正態(tài)分布者采用±s進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述。KLK7 mRNA的相對表達(dá)水平與IL?13處理濃度和處理時間的趨勢性采用線性趨勢檢驗。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較首先采用單因素方差分析，再采用LSD?t檢驗進(jìn)行兩兩間多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同濃度IL?13對NHEK中KLK7基因mRNA水平的影響

0、2、10、50 μg/L IL?13組KLK7 mRNA的相對表達(dá)水平分別為1.00±0.12、0.89±0.04、1.15±0.09、1.70 ± 0.10，線性趨勢檢驗發(fā)現(xiàn)，IL?13濃度與KLK7 mRNA相對表達(dá)水平之間有線性關(guān)系（F=92.48，P＜0.05），隨著IL?13濃度升高，KLK7 mRNA相對表達(dá)水平有上升趨勢。

二、IL?13處理NHEK不同時間對KLK7基因mRNA水平的影響

50 μg/L IL?13處理0、6、12、24和48 h后KLK7 mRNA相對表達(dá)水平分別為1.00±0.05、1.05±0.12、1.71±0.20、1.97±0.19、2.48±0.13。線性趨勢檢驗發(fā)現(xiàn)，IL?13處理時間與KLK7 mRNA的相對表達(dá)水平之間有線性關(guān)系（F=206.44，P＜0.05），隨著50 μg/L IL?13處理時間延長，KLK7 mRNA的相對表達(dá)水平有上升趨勢。

三、miR?143對NHEK中IL?13誘導(dǎo)的KLK7 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

1.轉(zhuǎn)染效率：轉(zhuǎn)染NHEK 24 h后，與明視場顯微鏡下對比，熒光顯微鏡觀察同一視野下熒光細(xì)胞比例大于90%，故認(rèn)為轉(zhuǎn)染成功。

2.KLK7 mRNA表達(dá)水平比較：見表1。與NHEK組相比，IL?13組KLK7 mRNA相對表達(dá)水平升高（t=7.12，P＜0.05）。單因素方差分析顯示，IL?13組、miR?NC組和miR?143組間KLK7 mRNA相對表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=26.89，P＜0.05），而IL?13組和miR?NC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.91，P＞0.05），miR?143組低于IL?13組和miR?NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.85、6.76，均P＜0.05）。

3.KLK7蛋白表達(dá)水平比較：見表1、圖1。與NHEK組相比，IL?13組KLK7蛋白相對表達(dá)水平升高（t=4.85，P＜0.05）。單因素方差分析顯示，IL?13組、miR?NC組和miR?143組間KLK7蛋白相對表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=13.26，P＜0.05），而IL?13組和miR?NC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.42，P＞0.05），miR?143組低于IL?13組和miR?NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.65、4.23，均P＜0.05）。

討 論

目前認(rèn)為，Th2型免疫反應(yīng)在AD免疫功能紊亂中發(fā)揮主導(dǎo)作用，其中Th2型細(xì)胞因子如IL?4和IL?13起關(guān)鍵作用［2］。針對IL?4和IL?13共同受體IL?4Rα的生物制劑Dupilumab，目前已在美國上市，成為首個獲批治療AD的生物制劑［4］，這也顯示IL?4和IL?13在AD發(fā)病中的核心作用。

表1 不同組別正常人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（NHEK）組織激肽釋放酶7（KLK7）基因mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平（±s）

表1 不同組別正常人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（NHEK）組織激肽釋放酶7（KLK7）基因mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平（±s）

注：n=3。a與NHEK組比較，P＜0.05；b與白介素13組比較，P＜0.05；c與miR?NC組比較，P＜0.05

組別NHEK組白介素13組miR?NC組miR?143組KLK7 mRNA 1.00±0.05 1.97±0.19a 2.08±0.15 1.26±0.10b c KLK7蛋白0.36±0.11 1.10±0.24a 1.05±0.06 0.56±0.03b c

圖1 miR?143對白介素（IL）13誘導(dǎo)正常人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（NHEK）組織激肽釋放酶7（KLK7）蛋白水平的影響 1：NHEK組；2：IL?13組；3：miR?NC組；4：miR?143組

KLK在皮膚中最主要的生理功能為促進(jìn)皮膚脫屑，通過降解橋粒芯糖蛋白1、橋粒芯膠蛋白1和角質(zhì)層鎖鏈蛋白來促進(jìn)淺層角質(zhì)形成細(xì)胞脫落，從而維持皮膚穩(wěn)態(tài)［5］。KLK7是第一個從角質(zhì)層中以活化形式鑒定出來的KLK，也是表皮中唯一的糜蛋白酶［5］。既往研究表明，KLK7轉(zhuǎn)基因小鼠模型可呈現(xiàn)AD的臨床特征［6］。與健康對照組比較，AD患者表皮KLK7蛋白表達(dá)水平升高，蛋白酶活性增強［7?10］。最新研究發(fā)現(xiàn)，若嬰兒出生時表皮KLK7酶活性升高，可能與其日后發(fā)生皮膚屏障功能損傷和AD相關(guān)［11］。以上研究提示，降低KLK7的表達(dá)或阻斷其過度活化的酶活性可作為AD的治療策略之一。

體外實驗表明，IL?4和IL?13可以誘導(dǎo)NHEK或HaCaT細(xì)胞中KLK7 mRNA和蛋白水平升高，酶活性增強［8，12?13］。提示在AD中，KLK7的表達(dá)和活性除了受蛋白酶抑制劑和各種理化因素影響外，還可能與機(jī)體的免疫功能紊亂，特別是Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)。但是，Th2型細(xì)胞因子調(diào)控KLK7表達(dá)的具體機(jī)制目前尚無報道。本研究結(jié)果顯示，隨著IL?13處理時間的延長和濃度升高，KLK7 mRNA表達(dá)均呈上升趨勢，提示在體外實驗中，KLK7表達(dá)與IL?13濃度和作用時間密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，在NHEK中過表達(dá)miR?143可逆轉(zhuǎn)IL?13對KLK7上調(diào)表達(dá)的效應(yīng)。由于IL?13Rα 1是IL?13的重要受體之一，結(jié)合本課題組前期工作可以推測，miR?143針對KLK7表達(dá)的上述效應(yīng)，也可能是通過直接負(fù)向調(diào)控IL?13Rα1來實現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)

［1］Weidinger S,Novak N.Atopic dermatitis［J］.Lancet,2016,387（10023）:1109?1122.doi:10.1016/S0140?6736（15）00149?X.

［2］Werfel T,Allam JP,Biedermann T,et al.Cellular and molecular immunologic mechanisms in patients with atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol,2016,138（2）:336 ?349.doi:10.1016/j.jaci.2016.06.010.

［3］Zeng YP,Nguyen GH,Jin HZ.MicroRNA?143 inhibits IL?13?induced dysregulation of the epidermal barrier?related proteins in skin keratinocytes via targeting to IL ?13Rα1［J］.Mol Cell Biochem,2016,416（1?2）:63?70.doi:10.1007/s11010?016?2696?z.

［4］Shirley M.Dupilumab:first global approval［J］.Drugs,2017,77（10）:1115?1121.doi:10.1007/s40265?017?0768?3.

［5］de Veer SJ,Furio L,Swedberg JE,et al.Selective substrates and inhibitors for kallikrein?related peptidase 7（klk7）shed light on KLK proteolytic activity in the stratum corneum［J］.J Invest Dermatol,2017,137（2）:430?439.doi:10.1016/j.jid.2016.09.017.

［6］Hansson L,B?ckman A,Ny A,et al.Epidermal overexpression of stratum corneum chymotryptic enzyme in mice:a model for chronic itchy dermatitis［J］.J Invest Dermatol,2002,118（3）:444?449.doi:10.1046/j.0022?202x.2001.01684.x.

［7］Komatsu N,Saijoh K,Kuk C,et al.Human tissue kallikrein expression in the stratum corneum and serum of atopic dermatitis patients［J］.Exp Dermatol,2007,16（6）:513 ?519.doi:10.1111/j.1600?0625.2007.00562.x.

［8］Morizane S,Yamasaki K,Kajita A,et al.TH2 cytokines increase kallikrein 7 expression and function in patients with atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol,2012,130（1）:259?261.e1.doi:10.1016/j.jaci.2012.03.006.

［9］Voegeli R,Rawlings AV,Breternitz M,et al.Increased stratum corneum serine protease activity in acute eczematous atopic skin［J］.Br J Dermatol,2009,161（1）:70?77.doi:10.1111/j.1365?2133.2009.09142.x.

［10］Voegeli R,Doppler S,Joller P,et al.Increased mass levels of certain serine proteases in the stratum corneum in acute eczematous atopic skin［J］.Int J Cosmet Sci,2011,33（6）:560 ?565.doi:10.1111/j.1468?2494.2011.00671.x.

［11］Chittock J,Cooke A,Lavender T,et al.Development of stratum corneum chymotrypsin?likeprotease activityand natural moisturizing factors from birth to 4 weeks of age compared with adults［J］.Br J Dermatol,2016,175（4）:713 ?720.doi:10.1111/bjd.14568.

［12］Hatano Y,Adachi Y,Elias PM,et al.The Th2 cytokine,inter?leukin?4,abrogates the cohesion of normal stratum corneum in mice:implications for pathogenesis of atopic dermatitis［J］.Exp Dermatol,2013,22（1）:30?35.doi:10.1111/exd.12047.

［13］Di ZH,Ma L,Qi RQ,et al.T helper 1 and T helper 2 cytokines differentially modulate expression of filaggrin and its processing proteases in human keratinocytes［J］.Chin Med J（Engl）,2016,129（3）:295?303.doi:10.4103/0366?6999.174489.