董校汝，王 賀，王 哲，吳明達(dá)，夏忠雪，周雁紅，王鑫鑫綜述,郝 峰審校*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院，2.北華大學(xué)，吉林 吉林 132013)

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)是一種依賴cAMP-ATP門控性氯離子通道，表達(dá)于氣道、消化道和生殖道等多部位上皮細(xì)胞的頂部質(zhì)膜中。囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)是白種人最常見的常染色體隱性遺傳性疾病之一，多是由于ΔF508缺失突變造成的。對CFTR基因的不斷研究使人們進(jìn)一步了解CF的發(fā)病機(jī)制。

1 CFTR基因與CF疾病

1.1 CFTR基因概述

1989年ROMMENS等成功克隆并鑒定了CFTR基因[1]。CFTR基因位于7q31，長度250 kb,包含27個(gè)外顯子，編碼一條長度1480個(gè)氨基酸的肽鏈。CFTR是一種cAMP依賴的氯離子通道蛋白，屬于ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中唯一的離子通道蛋白成員，分布于所有與分泌和吸收有關(guān)的組織上皮細(xì)胞頂膜，是液體分泌和細(xì)胞外堿化所需的氯化物和碳酸氫鹽通道。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以各種形式普遍分布，其基本功能單位是兩個(gè)核苷酸結(jié)合域(nucleotide binding domains,NBDs)和兩個(gè)跨膜域(transmembrane domains,TMDs)。NBD上的ATP水解作用推動了TMD的構(gòu)象變化，致使從細(xì)胞的內(nèi)部和外部交替進(jìn)入通道進(jìn)行單向傳輸穿過雙層脂質(zhì)膜。所有的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都有一個(gè)與核酸結(jié)合相關(guān)的LSGGQ區(qū)。隨著更多氨基酸序列信息的出現(xiàn)，人們認(rèn)識到這些ATP結(jié)合域的主要結(jié)構(gòu)是高度保守的，包含一個(gè)磷酸鹽結(jié)合環(huán)(P-loop or Walker A motif)和短序列LSGGQ。這種保守的結(jié)構(gòu)使得所有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在化學(xué)轉(zhuǎn)運(yùn)方面擁有很多共同的性質(zhì)。進(jìn)和出的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的，而大多數(shù)真核生物家族成員都是在運(yùn)出的方向上發(fā)揮作用的。同樣CFTR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白單一多肽鏈上含有2個(gè)NBDs和2個(gè)TMDs，共同構(gòu)成一個(gè)介導(dǎo)氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的通道。NBD2 WalkerA區(qū)域和NBD1 LSGGQ序列形成一個(gè)復(fù)合ATP結(jié)合位點(diǎn)用于水解核苷酸，然而NBD1 WalkerA區(qū)域和NBD2簽名區(qū)結(jié)合不能水解核苷酸。CFTR在兩個(gè)TMD-NBD盒之間包含一個(gè)大小為200個(gè)氨基酸的調(diào)節(jié)區(qū)R和NBD1 N-端插入30個(gè)不典型氨基酸殘基。在最初的結(jié)構(gòu)中，這30個(gè)插入殘余物和30個(gè)殘余物的擴(kuò)增物被定為非典型的NBDs,并且含有體外蛋白激酶A磷酸化的位點(diǎn)，前者監(jiān)管進(jìn)入后者監(jiān)管擴(kuò)增[2-4]。當(dāng)R區(qū)域被蛋白激酶磷酸化時(shí)，可以激活CFTR氯離子通道，ATP與CFTR-NBDs相互作用是激活該通道進(jìn)行門控的關(guān)鍵步驟。在生物體中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生理功能具有重要作用，如營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、排出毒素以及介導(dǎo)真核生物和細(xì)菌細(xì)胞間通訊等。

1.2 CF的病因

CF是由位于第7對染色體CF基因突變引起的常染色體隱性遺傳病。病人的同胞中半數(shù)帶有隱性基因，得病概率為1/4。研究顯示，CF患者分泌物變黏稠的主要原因可能是：上皮細(xì)胞氯離子通道調(diào)節(jié)缺陷，從而會阻礙呼吸道黏膜上皮的水、電解質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，黏液腺分泌物中酸性糖蛋白含量的增加，改變了黏液流變學(xué)的特性[3]。CF是一種“多向性”疾病，是指多個(gè)不同的不相關(guān)的臨床表型是由同一個(gè)基因控制的。CF是一種影響多系統(tǒng)器官的疾病，但是有證據(jù)已經(jīng)表明其中有一些的確與相應(yīng)的基因突變有關(guān)。例如DeltaF508以及其他的一些突變與胰腺功能缺陷和慢性支氣管擴(kuò)張有很明顯的相關(guān)性。到目前為止，已經(jīng)有約2000個(gè)CFTR突變被論述。然而，DNA序列中的分子改變不等于蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)或功能存在缺陷。有些CF疾病的基因型和表型之間尚未建立聯(lián)系，所以不可一概而論。

1.3 CFTR與CF的聯(lián)系

1.3.1CFTR基因突變導(dǎo)致離子通道異常

CFTR是一種存在于上皮細(xì)胞膜上的氯離子通道，它將氯離子運(yùn)出上皮，到達(dá)內(nèi)臟中各種通道的黏液中，正常情況下通道有維持黏液的正常流動的功能，在人體的各種管道都存在著CFTR。對于CF患者，鈉離子和氯離子分泌隨著異常的CFTR被阻斷，導(dǎo)致通道黏液異常黏稠，比如痰液變得黏稠。同樣，在皮膚的汗管，氯化鈉不能被重吸收，從而產(chǎn)生非常咸的汗液，如薯片味的汗液。CFTR基因影響氯離子通道功能導(dǎo)致上皮流體在輸送到肺、胰腺和其他器官功能失調(diào)，最終導(dǎo)致CF的突變[1,3]。CF會出現(xiàn)一系列的并發(fā)癥，最終導(dǎo)致慢性殘疾和壽命縮短，其中包括頻繁的呼吸道感染和胰腺功能不全引起的營養(yǎng)不良和糖尿病肺部黏液增厚。

1.3.2CFTR突變的類型

目前，已經(jīng)報(bào)道的導(dǎo)致CF的CFTR基因突變有2000多種。但目前基因型和表型關(guān)系尚不明確，有待進(jìn)一步研究。為更好理解基因型及表型關(guān)系，根據(jù)這些基因突變的分子機(jī)制及其產(chǎn)生后果將突變的CFTR基因分為以下6類，具體分類如下:Ⅰ類和Ⅱ類突變的主要特點(diǎn)是使CFTR在上皮細(xì)胞表達(dá)的數(shù)量減少。Ⅰ類突變是無意義的突變導(dǎo)致不穩(wěn)定mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)生成。對于這一類的突變導(dǎo)致“通讀”的分子使核糖體通過過早的終止密碼子繼續(xù)翻譯產(chǎn)生完整的CFTR蛋白,使正常的CFTR序列增加，如G542X、R553X等。Ⅱ類突變是CFTR蛋白折疊或成熟的缺陷，導(dǎo)致缺陷的CFTR在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被過早地降解而不能被正常運(yùn)輸至頂膜處發(fā)揮作用，此類型包括CF最常見突變ΔF508del，即第508位氨基酸密碼子突變。Ⅲ類和Ⅳ類突變表現(xiàn)為CFTR通道功能異常。Ⅲ類突變是門控突變，在膜表面調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)減少了負(fù)離子傳輸，CFTR的調(diào)節(jié)區(qū)破壞，CFTR被磷酸化從而與ATP不能正常結(jié)合，影響通道的激活，如G551D、G1349D等[5]。Ⅳ類突變的CFTR通道能正常打開及關(guān)閉，但其孔隙構(gòu)象異常，導(dǎo)致氯離子的轉(zhuǎn)運(yùn)異常，如R117H、R334W等。Ⅴ類突變是RNA剪接異常，正常功能的CFTR蛋白大量減少，例如A455E、P574H等[2-3,5]。Ⅵ類突變是最近發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞表面CFTR的穩(wěn)定性降低，周期增加。突變顯示多類的特征。例如，雖然F508del的主要是細(xì)胞處理異常，但也表現(xiàn)出門控缺陷和細(xì)胞表面半衰期減少。

2 CF的臨床癥狀

2.1 呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)

2.2 消化及營養(yǎng)不良

2.3 生殖系統(tǒng)和胰腺表現(xiàn)

CF在生殖系統(tǒng)方面也造成了一些困擾。CF患者宮頸黏液異常、無精癥和先天性輸精管缺失是導(dǎo)致女性生育能力下降和男性不育的主要原因?；颊唣こ淼姆置谝撼３枞B接睪丸和前列腺的管道即輸精管，會導(dǎo)致許多男性CF患者不育。女性患者與正常女性相比，CF患者的生殖能力也會下降[3,11]。在人類的外分泌胰腺中，CFTR主要分布在導(dǎo)管細(xì)胞的頂端質(zhì)膜上，并控制著由cAMP調(diào)節(jié)的碳酸氫鹽分泌到導(dǎo)管腔內(nèi)。在胰腺中，CFTR的主要作用是稀釋和使富含蛋白質(zhì)的腺泡分泌到管道腔內(nèi)，從而阻止蛋白質(zhì)栓的形成造成胰腺損傷。CFTR基因突變尤其是F508del，是患慢性胰腺炎的風(fēng)險(xiǎn)因子?？梢奀F患者全身多器官都會出現(xiàn)一些列臨床癥狀，影響人類正常生活。

3 針對CF癥狀和CFTR突變類型的治療方法

3.1 CF癥狀的治療

CF的治療目前主要是針對臨床表現(xiàn)和并發(fā)癥，并且主要是針對患者呼吸系統(tǒng)疾病。有以下幾種治療方法,但治療的主要目標(biāo)都是一致的：防止呼吸道感染，減少肺部黏液的分泌液量和黏稠度，改善呼吸，維持足夠的營養(yǎng)[12-13]。根據(jù)以上宗旨，現(xiàn)階段CF的治療可以概括為3種：1)針對CF患者的肺部易感特點(diǎn)，使用新一代的抗生素噴霧劑可以將藥物直接送到氣道發(fā)揮作用，更高效方便。然而，長時(shí)間的高劑量的氨基糖苷類抗生素會導(dǎo)致嚴(yán)重的腎毒性和耳毒性。并且長期使用抗生素的一個(gè)最大問題是細(xì)菌的抗藥性，使抗生素逐漸失去作用。因此，要合理使用抗生素。通過加用沙丁胺醇噴霧等支氣管擴(kuò)張藥物作用于患處，可以清除黏稠的痰液維持氣道的開放。2)針對消化不良的患者，由于CF會使消化所需的胰腺酶無法到達(dá)消化道，食物消化和吸收障礙，導(dǎo)致營養(yǎng)不良。因此患者應(yīng)該合理飲食,多補(bǔ)充高能量的營養(yǎng)素、脂溶性維生素，以及有效的胰腺酶，增加營養(yǎng)。3)針對嚴(yán)重肺部并發(fā)癥并且使用抗生素治療無效時(shí)，此時(shí)可以進(jìn)行肺移植。

3.2 ΔF508del突變的治療

ΔF508del突變約存在于90%以上的CF患者中，是白種人最常見突變類型，屬于Ⅱ類突變。糾正ΔF508del突變相關(guān)的CFTR異常即Ⅱ突變是一個(gè)更大的挑戰(zhàn)。針對ΔF508del突變必須同時(shí)調(diào)節(jié)CFTR處理缺陷和門控缺陷。Orkambi是由lumacaftor和Ivacaftor組成，其中Lumacaftor(VX-809)是CFTR修正者，具有保護(hù)ΔF508del突變攜帶者的CFTR蛋白免遭降解的藥物[14]。Lumacaftor是CYP3A的強(qiáng)誘導(dǎo)者，相比組合療法Ivacaftor單療法意味著更大劑量的Ivacaftor，即CYP3A的底物，而這種組合療法較比Ivacaftor單療法需使用較少劑量的Ivacaftor即可達(dá)到臨床治療效果。體外研究表明，Lumacaftor的校正活性及選擇性均較高，現(xiàn)已進(jìn)入到臨床研究階段。實(shí)驗(yàn)采用單獨(dú)使用Lumacaftor和與Ivacaftor聯(lián)合使用治療CF。結(jié)果表明：Lumacaftor治療組的肺功能均較安慰劑組有顯著改善，且耐受性好，治療組的不良反應(yīng)發(fā)生情況與安慰劑組相似。600 mg VX-809與Kalydeco聯(lián)用治療的患者肺功能改善情況最佳。此外Lumacaftor系列新產(chǎn)品VX-661也進(jìn)入了Ⅲ期臨床。還有多款候選藥物還在進(jìn)一步開發(fā)，其中包括一款基因治療藥物[15-16]。對其單獨(dú)給藥以及替代Lumacaftor與CFTR增強(qiáng)劑聯(lián)合給藥對ΔF508del突變成年攜帶者的療效進(jìn)行評估,Ivacaftor可以幫助CFTR蛋白通道打開的時(shí)間更久一些，以使鹽分和水分更好地進(jìn)出細(xì)胞。CF患者終生與其疾病相伴，多因肺部感染而反復(fù)，疾病會變得日益嚴(yán)重。Lumacaftor和Ivacaftor的合劑代表了CF治療的一個(gè)跳躍性突破，因?yàn)樗軌蚪鉀Q該疾病的病因[17]。那些以復(fù)方藥物Orkambi治療的患者其肺功能經(jīng)歷了明顯的改善，肺部惡化程度降低。藥物QR-010是由ProQR開發(fā)的治療，它是單鏈反義RNA寡核苷酸序列，可以修復(fù)異常mRNA Phe508del突變的病人。

3.3 CF的其他治療方法

對CF的終極治療是基因療法，用正常CFTR基因代替突變的CFTR。Kalydeco(Ivacaftor)是全球首個(gè)CF靶向治療藥物，但適用人群較少。美國FDA批準(zhǔn)Kalydeco用于2～5歲患有囊性肺纖維化的兒童。這款藥物被批準(zhǔn)用于CF兒童，適用于擁有10個(gè)CFTR基因突變(G551D、G1244E、G1349D、G178R、G551S、S1251N、S1255P、S549N、S549R和R117H)之一的患者。Ivacaftor是一種新型的CFTR增強(qiáng)劑，通過增加CFTR蛋白質(zhì)的開放概率，增加了氯化物的運(yùn)輸。Ivacaftor的使用可以改進(jìn)報(bào)告病人的肺功能、體重和呼吸系統(tǒng)癥狀，減少了肺惡化的頻率，降低汗液氯化物濃度使之低于診斷閾值。PTC124(Ataluren)在結(jié)構(gòu)上與氨基糖苷類抗生素相似，但這種化合物沒有該類抗生素的化學(xué)性質(zhì)。最初PTC124在人類的肌肉細(xì)胞中促進(jìn)肌肉萎縮蛋白產(chǎn)生，在老鼠模型中表達(dá)肌萎縮蛋白無意義等位基因。隨后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PTC124可以抑制CF小鼠模型中G542X的無義突變，表達(dá)人類CFTR-G542X基因，恢復(fù)CFTR表達(dá)和功能。PTC124的藥理作用是阻止新出現(xiàn)的終止密碼子信號從而不影響正常終止密碼子，主要適用于Ⅰ類突變患者[14,17]。研究結(jié)果表明PTC124明顯改善肺功能，同時(shí)在CF疾病引起的咳嗽方面也有所改善。以寡核苷酸為基礎(chǔ)的藥物糾正DNA或RNA缺陷，從而產(chǎn)生正常的CFTR蛋白?；蛑委煹淖畲髢?yōu)勢是不受CFTR突變類型的限制,并且正常CFTR的cDNA進(jìn)入氣道可表達(dá)為功能正常的CFTR，因此基因治療在理論上可以治療所有CF患者的氣道疾病。研究顯示，治療方法耐受性很好，而且與安慰劑組的肺功能喪失相比肺功能也穩(wěn)定了。在這個(gè)領(lǐng)域進(jìn)行了20多年的研究，對于CF基因療法仍然需要更有效的載體將cDNA注入呼吸道細(xì)胞，這是一個(gè)至關(guān)重要的挑戰(zhàn)。體積調(diào)節(jié)性陰離子通道(volume regulated anion channel,VRAC)的研究已經(jīng)有20多年，但這個(gè)通道的分子實(shí)體直到最近才被發(fā)現(xiàn)[18]。除了穩(wěn)定細(xì)胞體積的作用外，VRAC還涉及許多其他的生理和病理生理過程，包括癌癥、缺血性腦水腫、細(xì)胞活力、增殖、血管生成、程序性細(xì)胞死亡和興奮性谷氨酸釋放。盡管VRAC在生物物理、藥理學(xué)和功能上都具有廣泛的生物特性，但它的分子特性一直備受爭議。直到最近才發(fā)現(xiàn)含有8A(LRRC8A)蛋白是富含VRAC蛋白質(zhì)，在多種細(xì)胞類型中是必需的，而且是VRAC形成的一個(gè)的子單元。2014年，在最后一次突破中，兩組獨(dú)立地確認(rèn)了LRRC8A是VRAC不可或缺的組成部分。低滲情況下細(xì)胞膨脹，通道被激活，當(dāng)電流電壓瞬時(shí)產(chǎn)生，體積敏感性氯離子通道普遍向外整流，膜電流達(dá)到興奮時(shí)產(chǎn)生更大的離子流，膜興奮狀態(tài)下，離子流隨時(shí)間推移逐漸減小，但在細(xì)胞更興奮的狀態(tài)下，通道會加速失活[19-20]。VRAC的研究進(jìn)展也對CFTR突變相關(guān)疾病的治療做出了參考。近年來其他方面如激動其他氯離子通道(TMEM16A)、ENaC抑制劑(阿米洛利、VX-371)等也有新藥物發(fā)現(xiàn)。

4 結(jié) 語

CF是一種累及全身多器官系統(tǒng)的惡性疾病，隨著對CF發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)的認(rèn)識及基因檢測技術(shù)等的進(jìn)步，CF的治療方法在不斷更新。CFTR基因突變的發(fā)現(xiàn)，使得糾正CFTR缺陷這一源頭問題的治療研究應(yīng)運(yùn)而生，雖然基因治療研究經(jīng)過多年后仍未實(shí)現(xiàn)，但藥物治療方面已取得了突破性的進(jìn)展。目前和未來的治療靶點(diǎn)主要集中在糾正CFTR蛋白的結(jié)構(gòu)和功能異常上。此外，一些有癥狀改善的藥物也在研究中。針對不同類型CFTR基因突變的治療為CF的治療不斷更新和變化。新型藥物Orkambi(lumacaftor/ivacaftor)，尤其是針對覆蓋90%F508del為主的CFTR突變，是目前公認(rèn)替代基因治療最有前途的治療策略。對于其他CFTR突變類型所致一整類疾病治療，新合成的氨基糖苷類藥物(包括NB54和NB84等)具有較慶大霉素藥效強(qiáng)、毒性作用低、給藥途徑方便等優(yōu)點(diǎn)，值得臨床推廣。值得一提的是，加強(qiáng)CFTR以外的氯離子通道也可有效緩解CF的癥狀，所以可以通過研究不同的氯離子通道來尋找更多的治療藥物。

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