郭子寒 杜瓊 戴賢春 劉瑩瑩 余波 翟青

摘 要 腫瘤是發(fā)病率和致死率最高的疾病之一，其發(fā)生發(fā)展與基因突變導致的機體局部組織細胞異常增生有關(guān)。對腫瘤相關(guān)基因進行檢測在腫瘤的診斷、預防和治療中具有重要意義。

關(guān)鍵詞 腫瘤 基因檢測 意義

中圖分類號：R730.5 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2018）05-0014-09

The significance of genetic testing for tumor precision medicine

GUO Zihan1，2，3， DU Qiong1，2，3， DAI Xianchun3， LIU Yingying3， YU Bo1，2，3， ZHAI Qing1，2，3*

（1. Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032， China； 2. Department of Pharmacy， Fudan University Shanghai Cancer Center， Shanghai 200032， China； 3. Proton and Heavy Ion Center， Fudan University Shanghai Cancer Center， Shanghai 201321， China）

ABSTRACT Tumor is one of the diseases with highest morbidity and mortality and its occurrence and development are related to the abnormal cell proliferation in the local tissues due to gene mutations. Genetic testing has important implications for the diagnosis， prevention and treatment of tumors.

KEY WORDS tumor； genetic testing； significance

基因是負載特定遺傳信息的DNA或RNA分子片段?；蛲蛔兪腔蛟诜肿咏Y(jié)構(gòu)上發(fā)生的堿基對的組成或排列順序的改變，包括點突變、移碼突變、缺失突變和插入突變四種?；驒z測是一種通過測序等手段對人體外周血、或組織中基因位點進行檢測。研究表明，腫瘤是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，腫瘤相關(guān)的基因突變后，其表達蛋白的量或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導致局部組織細胞異常增殖，從而形成腫瘤。通過對人體的腫瘤相關(guān)基因進行檢測，分析其基因突變情況，對腫瘤的篩查，臨床診斷、治療和預后的評估等具有重要意義。本文將對臨床常見腫瘤的基因檢測的現(xiàn)狀、意義做和檢測技術(shù)進行綜述。

1 肺癌

GLOBOCAN 2012年最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，肺癌的新發(fā)病例數(shù)約為180萬，占總病例的12.9%，死亡率約為19.4%，居惡性腫瘤死亡率的第一位[1-2]，研究表明肺癌的發(fā)生發(fā)展及耐藥可能與基因突變有關(guān)，如EGFR、KRAS、ROS1、c-MET等。

1.1 EGFR

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，位于細胞膜表面，通過與配體（EGF及TGFα）結(jié)合激活，從而引導下游通路（MAPK、AKT及JNK）磷酸化，誘導細胞增殖。許多實體腫瘤中，EGFR存在高表達或異常表達，這與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細胞凋亡的抑制有關(guān)[3]。

非小細胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC）患者中，最常見的EGFR突變是外顯子19缺失突變（占45%）及外顯子21點（L858R）突變（占40%）。上述兩種突變對小分子酪氨酸酶抑制劑（tyrosine kinase，TKIs）具有敏感性，也被稱為EGFR敏感突變[4]。EGFR敏感突變在NSCLC白種人患者中占10%，而在亞洲人中高達50%[5]。臨床上對EGFR敏感突變的NSCLC患者所使用的一線治療靶向藥物有厄洛替尼、吉非替尼及阿法替尼。與傳統(tǒng)化療比，靶向藥物療效顯著提高了，且副作用較輕[6]。一項回顧性研究表明，EGFR敏感突變的NSCLC患者使用厄洛替尼單藥治療后，客觀緩解率為80%、中位PFS為13個月[7]。研究表明EGFR-TKI耐藥后，50%會發(fā)生T790M突變[8]。奧希替尼（AZD9291）通過C797氨基酸共價鍵不可逆地結(jié)合EGFR的某些突變形式（L858R，外顯子19缺失和含有T790M的雙重突變體），抑制DNA合成和增殖。最新的AURA Ⅲ期研究比較奧西替尼和培美曲塞聯(lián)合順鉑治療在TM790陽性的肺腺癌療效的結(jié)果顯示，奧西替尼組無進展生存期（progression-free survival，PFS）顯著高于化療組（10.1個月vs 4.4個月），客觀緩解率（objective response rate，ORR）也顯著高于化療組（71% vs 31%）[9]。

EGFR的基因檢測在臨床上多采用直接測序法（測定外顯子18至219），聚合酶鏈式反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（single-strand conformation polymorphism，PCRSSCP），微數(shù)字PCR（microfluidics digital，PCR），探針擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）等[5]。

1.2 KRAS

鼠肉瘤病毒原癌基因同源體（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）是RAS家族與人類腫瘤相關(guān)的基因之一，位于12號染色體，參與胞內(nèi)信號傳遞。當KRAS突變時，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的RAS蛋白，導致胞內(nèi)信號傳導紊亂，細胞增殖失控癌變。數(shù)據(jù)顯示，KARS在北美腺癌患者的突變率為25%，是很常見的突變[10]。KRAS突變的發(fā)生與吸煙有關(guān)[11]。發(fā)生KARS突變的患者生存期較野生型KRAS患者短；因此KRAS突變是預后的分子標識[12]。值得注意的是，KRAS突變與EGFR-TKIs的療效相關(guān)，其出現(xiàn)預示著EGFR靶向治療的預后較差[10]。

1.3 ALK

間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）是受體分子中的一員。正常情況下，ALK接受外部信息后活化，傳遞信息至細胞內(nèi)并指導細胞有序生長增殖；由于某些異常（ALK重排等），長期處于過度活躍狀態(tài)，持續(xù)傳遞增殖信號，導致腫瘤發(fā)生。ALK基因重排率在NSCLC患者中約為2%～7%[13]。ALK基因重排的NSCLC患者其臨床特征與EGFR突變的患者相似（如病理組織為腺癌、非吸煙者或輕度吸煙者等），但是對EGFR-TKIs不敏感[14]。

克唑替尼是治療發(fā)生ALK重排晚期NSCLC患者的首選藥物，包括在腦轉(zhuǎn)移患者中都具有較高（>60%）的緩解率[15]。一項3期臨床試驗比較了克唑替尼聯(lián)合或不聯(lián)合化療（培美曲塞+鉑類藥物），緩解率分別為74%和45%，中位無進展生存期（PFS）及生活質(zhì)量在聯(lián)合組都有顯著增加[16]。對于疾病進展（克唑替尼耐藥）的NSCLC患者，色瑞替尼和艾樂替尼是美國食品及藥物管理局（FDA）推薦的靶向藥物，其治療克唑替尼耐藥NSCLC患者的緩解率和中位PFS分別為56% vs 50%，7月 vs 11.2月[17-19]。

1.4 ROS1

原癌基因1酪氨酸激酶（c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1），是一種跨膜受體酪氨酸激酶基因。與ALK異常的原理類似，ROS1重排會使細胞長期處于增殖狀態(tài)，導致癌變。ROS1基因重排率在NSCLC患者中約為1%～2%；該重排傾向于在較年輕女性、非吸煙、腺癌患者與三陰性（EGFR突變、KRAS突變和ALK重排陰性）NSCLC患者中發(fā)生[20]。

用于治療ALK重排的克唑替尼對ROS1重排的NSCLC患者同樣有效，也是FDA推薦治療的藥物。一項研究表明，在發(fā)生ROS1重排的NSCLC患者中使用克唑替尼，緩解率達66%，中位PFS達18月[21]。

ALK與ROS1重排經(jīng)FDA批準用于臨床的標準檢測方法為熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）。除此以外，在儀器允許的情況下，免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）與高通量測序（next generation sequencing，NGS）也是可選的檢測方法[22]。

1.5 PD-1/PD-L1

程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）是一種免疫抑制分子，表達在T細胞表面，調(diào)控其在外周組織的活性。PD-1有兩種配體程序性死亡受體-配體（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）和PD-L2，它們在許多免疫效應細胞、抗原呈遞細胞和腫瘤細胞中均有表達。腫瘤細胞上的PD-L1通過結(jié)合PD-1產(chǎn)生一系列作用導致T細胞失活、增殖減少。

治療在于靶向針對PD-1或PD-L1從而阻斷NSCLC患者腫瘤細胞對免疫細胞的抑制。NCCN所推薦的免疫治療藥物有派姆單抗（pembrolizumab）和納武單抗（nivolumab）。臨床研究Checkmate 057顯示：納武單抗對比多西他賽治療晚期NSCLC患者的中位總生存期（Overall survival，OS）為12.2月 vs 9.4月[23]。另一項keynote 010顯示：派姆單抗對比多西他賽治療晚期NSCLC患者的中位OS為12.7月vs 8.5月[24]。PORLAR研究顯示：atezolizumab對比多西他賽治療晚期NSCLC患者的中位OS為12.6月vs 9.7月[25]。

美國加利福尼亞大學Garon等[24]報告，派姆單抗用于非小細胞肺癌患者療效的提高與PD-L1在腫瘤細胞中的表達超過50%相關(guān)，一項單臂Ⅱ期膀胱癌的臨床研究IMvigor 210顯示[26]，PD-L1陽性的患者使用PD-L1抑制劑（atezolizumab）緩解率為26%；而對于PD-L1陰性的患者，緩解率僅為9.5%。提示檢測PD-L1表達狀態(tài)可能有臨床指導意義。PD-L1的表達狀態(tài)主要是通過IHC方法檢測細胞表面受體數(shù)量來判定，主要的檢測抗體有Dako22C3、Dako28-8、 VentanaSP14，每種檢測所用到的抗體和具體技術(shù)都不同，且缺乏統(tǒng)一標準。PD-L1的表達水平是否可作為用藥的篩選依據(jù)，仍需要高質(zhì)量的臨床試驗加以驗證。

2 乳腺癌

基因檢測對于乳腺癌的預后判斷和治療方案選擇具有重要的參考意義，乳腺癌的基因檢測包括單基因檢測如雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、癌基因人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）/細胞增殖核抗原（nuclear-associated antigen Ki- 67，Ki-67）表達水平、乳腺癌1號基因（breast cancer 1，BRCA）和多基因檢測如MammaPrint、PAM50、OncotypeDX等。

2.1 ER、PR、Ki-67和HER2

乳腺癌中，HER2的陽性率達到15%～30%，絕經(jīng)前ER的陽性率為54%，絕經(jīng)后ER的陽性率高達73%[27]，ER陽性、HER2陰性常提示預后良好但可能對化療不敏感[28]，而細胞增殖標記物Ki-67的高表達則相反，常提示預后不良但對化療敏感。而不同的臨床病理學特征和基因檢測指標的預測能力存在不同程度的差別，如淋巴結(jié)陽性的預測能力強于HER2。同一個基因在不同的乳腺癌亞型的預測價值也不相同，如Ki-67對ER陽性乳腺癌預后和化療敏感性的預測能力強于三陰性乳腺癌。

FDA批準用于ER或PR陽性乳腺癌患者治療的藥物有選擇性雌激素受體調(diào)變劑：他莫昔芬、托瑞米粉和氟維司群，非甾體芳香化酶抑制劑：氨魯米特、來曲唑、阿那曲唑和甾體類芳香化酶抑制劑：福美司坦、依西美坦。用于晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌HER2陽性的藥物有：曲妥珠單抗、拉帕替尼和帕妥珠單抗，曲妥珠單抗反應率為50%[29]，拉帕替尼聯(lián)合卡培他濱的有效率為22%[30]。

HER2檢測的常用方法主要為IHC和FISH。IHC通過檢測細胞表面受體數(shù)量來判定HER2的表達狀態(tài)。目前通過FDA認證的2種檢測HER2表達情況的測試分別為Dako Hercep測試（使用多克隆抗體A085）及Ventana公司的Pathway（使用單克隆抗體4B5）。其檢測結(jié)果解讀[32]：①IHC陽性：+++；②IHC狀態(tài)可疑：++；③IHC陰性。FISH是指通過測定基因拷貝數(shù)量來測定HER2狀態(tài)。目前獲得FDA許可的分別是：INFORM HER-2 test（Ventana Medical Systems）、PathVysion HER 2FISH test（Vysis，Downers Grove，IL）、the PharmaDX HER- 2FISH- test（DAKO，Glostrup，Denmark）。結(jié)果解讀為[31]：①HER2陽性：FISH比率>2.2或HER2基因拷貝數(shù)>6.0；②HER2狀態(tài)可疑：FISH比率是1.8～2.2或HER2基因拷貝數(shù)在4.0～6.0之間；③HER2陰性：FISH比率<1.8或HER2基因拷貝數(shù)<4.0。

2.2 BRCA

BRCA是乳腺癌易感基因，研究表明家族性乳腺癌約有10%～20%存在BRCA突變，而且BRCA突變患者患癌風險增加，可達40%～80%[32]，且BRCA突變的乳腺癌更易擴散，預后不良。于突變患者可采?。杭訌姳O(jiān)測（乳房自檢、X光檢查和乳腺磁共振成像）、藥物預防（選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、芳香化酶抑制劑和激素避孕）及預防性手術(shù)[33]。多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑是BRCA突變的乳腺癌治療的一種選擇。rucaparib能有效延長BRCA突變的乳腺癌的生存期，口服rucaparib的有效率為15%[34]，F(xiàn)DA于2015年授予其突破性藥物認證。指南建議對乳腺癌高危人群進行BRCA基因篩查。常用的檢測手段有PCR-SSCP和NDA直接測序。

2.3 MammaPrint（70基因檢測）

MammaPrint是2002年由荷蘭癌癥研究院開發(fā)的基于cDNA高通量的乳腺癌多基因檢測系統(tǒng)[35]，是首個被FDA和歐盟批準的作為年齡<60歲、Ⅰ～Ⅱ期、淋巴結(jié)陰性或1～3陽性的乳腺癌多基因檢測輔助預后分析系統(tǒng)。采用新鮮組織樣本或固定石蠟包埋組織樣本進行檢測，依據(jù)檢測結(jié)果將患者分為低風險組和高風險組，高風險組臨床獲益更高。

2.4 Prosigna（50基因檢測）

Prosigna是采用逆轉(zhuǎn)錄多聚合酶鏈式反應檢測乳腺癌50基因的技術(shù)，2013年FDA批準用于乳腺癌術(shù)后風險評估[36]，這一多基因檢測系統(tǒng)主要用于估計Ⅰ～Ⅱ期ER陽性絕經(jīng)后乳腺癌患者接受輔助內(nèi)分泌治療的無遠處轉(zhuǎn)移生存期。它通過復發(fā)風險分數(shù)（ROR）將檢測結(jié)果分為低危、中危和高危組來預測患者預后。

2.5 Oncotype DX（21基因檢測）

Oncotype DX由美國Genomic Health公司研發(fā)，ER陽性乳腺癌患者預后多基因檢測方法，采用逆轉(zhuǎn)錄多聚合酶鏈式反應檢測乳腺癌21基因[37]。21基因含有16個腫瘤相關(guān)基因和5個參比基因，將5個參考基因的Ct均值與16個相關(guān)基因的Ct值差值代入公式，轉(zhuǎn)換為復發(fā)評分（RS）。依據(jù)分值可分為三組：低復發(fā)風險組，RS<18；中復發(fā)風險組，RS為18～31；高復發(fā)風險組，RS>31。高復發(fā)風險組可在化療中獲益[36]。中復發(fā)風險組能否在化療中獲益，尚在研究中。

3 胃癌

分子靶向藥用于胃癌的研究很多，如EGFR、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）、HER2、（血管內(nèi)皮細胞生長因子受體，vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）和免疫檢查點等，但目前為止NCCN指南中有明確推薦的僅有曲妥珠單抗和雷莫蘆單抗兩個藥物，分別靶向HER2和VEGFR。

3.1 HER2

胃癌中HER2的擴增率為7.1%～42.6%[38-42]，HER2基因的大量擴增會激活多種信號轉(zhuǎn)導途徑，使細胞大量增殖，易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，是預后不佳的指標[43]。

ToGA試驗[44]是第一項曲妥珠單抗用于HER2擴增的胃癌的大型Ⅲ期臨床試驗。在HER2擴增的患者中，順鉑-氟尿嘧啶聯(lián)合方案聯(lián)用曲妥珠單抗相比于單用化療，顯著提高中位OS（13.8月vs 11月，P=0.046）。

HER2檢測方法及結(jié)果解讀同乳腺癌。

4 結(jié)直腸癌

在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中，很多基因起到了至關(guān)重要的作用，其中KRAS/NRAS突變、BRAF 基因突變等已被列入NCCN等各大指南中。

4.1 KRAS

KRAS是EGFR信號傳導通路中一個重要的下游調(diào)控基因，KRAS突變通過自身激活啟動下游信號的轉(zhuǎn)導，使得EGFR介導的信號途徑持續(xù)激活，從而導致抗EGFR單克隆抗體治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌效果不佳，成為結(jié)直腸癌預后不良的指標[45-48]。國內(nèi)外的研究顯示，結(jié)直腸癌患者中KRAS基因突變頻率從27.4%～44.5%不等[47-49]。

KRAS突變往往提示腫瘤易感性、惡變或復發(fā)的高風險，另外KRAS突變還用于指導西妥昔單抗及帕尼單抗的治療。NCCN指南明確推薦所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應進行RAS基因檢測（KRAS第2外顯子和其他外顯子，NRAS），RAS基因突變者不推薦西妥昔單抗及帕尼單抗治療。

研究顯示，KRAS突變者和未突變者使用西妥昔單抗的腫瘤反應率分別為0%和40%，中位PFS分別為10.1周 vs 31.4周，中位OS分別為10.1月 vs 14.3月[45]。KRAS突變與否在帕尼單抗的獲益中也有顯著區(qū)別。在一個比較帕尼單抗和最佳支持治療用于晚期結(jié)直腸癌患者的Ⅲ期臨床試驗中，KRAS野生型患者在PFS、OS和反應率上均顯著優(yōu)于KRAS突變者。KRAS突變者和未突變者使用帕尼單抗的反應率分別為0%和22%。KRAS野生型患者中，帕尼單抗組vs最佳支持組，中位PFS為12.3周 vs 7.3周，中位OS為6.8 月 vs 1.9月；KRAS突變的患者中，帕尼單抗組vs最佳支持組，中位PFS為7.4周 vs 7.3周，中位OS為4.5月 vs 2月[50]。

KRAS基因檢測方法有PCR產(chǎn)物直接測序法、Taqman探針法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法（single strand conformation polymorphism，SSCP）、限制性片段長度多態(tài)性方法（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、焦磷酸測序方法、變性高效液相色譜法（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）、擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）和高分辨率熔解曲線分析法（high resolution melting，HRM）等。

4.2 BRAF

鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌性同源體B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因編碼的BRAF蛋白屬于RAF家族，參與RAS/RAF/MEK/ERK信號途徑，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡。BRAF蛋白是KRAS蛋白的重要效應器之一[51]，因此，BRAF基因發(fā)生突變和KRAS突變一樣，可使其編碼的蛋白激酶處于活性狀態(tài)而促進細胞異常增殖，導致腫瘤發(fā)生[52]。BRAF突變頻率為5%～15%，且90%的BRAF突變發(fā)生于核苷酸1 799位（腺苷酸取代胸腺嘧啶），最終谷氨酸替代600位的纈氨酸（V600E突變）[53]。

前期的研究提示BRAF基因突變是西妥昔單抗療效的獨立預測因素[54]。該回顧性研究顯示，在KRAS野生型的患者中，BRAF突變和未突變者使用帕尼單抗或西妥昔單抗的反應率分別為0%和32%；BRAF野生型患者PFS和OS的獲益也顯著高于BRAF突變者?；谏鲜鲅芯?，NCCN指南推薦所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進行BRAF突變檢測，指出V600E突變者不太可能對西妥昔單抗或帕尼單抗的治療產(chǎn)生應答。但PRIME試驗[55]的回顧性分析和CRYSTAL、OPUS試驗的匯總分析[56]均表明BRAF突變對帕尼單抗和西妥昔單抗的療效無預測作用，僅提示預后不良。

IHC利用特異性抗體VE1識別V600E突變蛋白進行檢測，是當前BRAF基因突變常用檢測方法[57]。其他可選方法包括Sanger測序、基于多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的檢測方法等。

4.3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

微衛(wèi)星是指人類基因組中的短串聯(lián)重復序列。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）是指與正常組織相比，腫瘤組織中的微衛(wèi)星由于重復單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長度的任何改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。

MSI是由錯配修復（mismatch repair，MMR）基因發(fā)生缺陷引起的，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。MSI在IV期腸癌中的發(fā)生率約為3.5%～5%[58-59]，在散發(fā)性結(jié)直腸癌中的發(fā)生率為10%～15%[60-61]。與無MSI特征的結(jié)直腸癌相比，MSI結(jié)直腸癌的發(fā)生、預后和藥物敏感性均不同。指南推薦所有<70歲或者Ⅱ期患者均應考慮進行錯配修復蛋白（MMR）檢測。具有MSI-H（高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定）的Ⅱ期患者可能預后較好，而且不能從5-FU的輔助化療中獲益[62]。

MSI檢測方法主要有PCR技術(shù)和IHC技術(shù)。PCR技術(shù)主要采用多重熒光PCR結(jié)合毛細管電泳進行檢測，MS位點經(jīng)過熒光標記的PCR擴增后經(jīng)遺傳分析儀毛細管電泳進行基因組掃描，通過檢測片段長度來判斷MSI[63]。IHC技術(shù)采用IHC檢測4種MMR基因的蛋白表達情況來明確是否存在MSI。正常情況下，可以檢測到4種蛋白的表達，如結(jié)果異常表明至少有一種蛋白沒能表達，可能存在相關(guān)MMR基因的突變。

5 白血病

白血病是一類源自造血干細胞的惡性克隆性疾病，克隆后的細胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻，可在骨髓和其他造血組織中惡性增生，使造血受抑制并浸潤其他組織。隨著白血病融合基因的發(fā)現(xiàn)及分子技術(shù)的進步，對其進行基因檢測在白血病的診斷中意義很大[64]。常見于臨床的白血病融合基因有以下幾種。

1）BCR-ABL融合基因 通過t（9；22）（q34；q11）形成。其編碼的BCR-ABL具有高酪氨酸激酶活性，通過激活下游多條信號通路促使細胞惡化并最終變成白血病。約95%以上的慢性髓細胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）患者和20%的急性淋巴細胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）患者表達BCR-ABL基因，因此BCR-ABL融合基因可用作慢性粒細胞白血病的分子診斷標志物[65]。

2）PML-RARA融合基因 通過t（15；17）（q22；q22）形成。PML-RARA可干擾RARA在核內(nèi)的分布和對分化的調(diào)控，使大量細胞處于早幼階段，引起早幼粒細胞白血?。ˋPL）。PML-RARA因此是APL的特異性分子標志[66]。

3）AML1-ETO融合基因 通過t（8；21）（q22；q22）形成?？梢种普ML1蛋白介導的功能，改變祖細胞更新及成熟過程，也可以產(chǎn)生異常增殖信號，引起白血病發(fā)生。AML1-ETO主要發(fā)生于M2型白血病，是其重要的分子標志[67]。

4）TEL-AML1融合基因 通過t（12；21）（p13；q22）形成。TEL-AML1可阻礙AML1編碼的CBRa進行轉(zhuǎn)錄，影響祖細胞的更新和分化。TEL-AML1是兒童前B-ALL最常見的染色體異常之一，陽性預示較好的預后[68]。

5）E2A-PBX1融合基因 通過t（1；19）（q12；p22）形成。E2A在B細胞系A(chǔ)LL中占20%～30%，可作為ALL診斷的分子標志物，輔助預后判斷和治療指導[69]。

6）MLL重排形成的基因 AML中MLL基因經(jīng)常發(fā)生重排形成融合基因，種類較多，如t（11；4）（q23；q21）形成的MLL-AF4。通常情況下，涉及混合血統(tǒng)白血?。╩ixed lineage leukemia，MLL）基因重排的白血病惡性程度高，對常規(guī)化療不敏感，生存期短是預后不良的標志[70]。

白血病融合基因的檢測不僅能作為診斷的依據(jù)，同時也是BCR-ABL融合基因等靶點治療的參考。伊馬替尼是FDA批準用于治療頑固性或復發(fā)性Ph+（費城染色體陽性）ALL患者的一線藥物。一項臨床試驗表明，伊馬替尼在Ph+ ALL患者中的緩解率超過60%[71]。

目前白血病融合基因的檢測主要使用實時定量熒光PCR（RQ-PCR）技術(shù)[72]。除FISH、免疫印跡、流式細胞術(shù)（FCM）、基因芯片也有不同程度地使用。

6 黑色素瘤

惡性黑色素瘤進展迅速，預后不良，晚期黑色素瘤5年生存率不到6%[73]。近年來，人們逐漸認識到，黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展可能與某些基因的突變有關(guān)，且新的靶向藥物也相繼問世。

6.1 BRAF

BRAF是Raf家族的成員之一，BRAF突變會導致Ras/Raf/Mek/Erk通路異常，最終導致細胞增殖、生長等過程異常。晚期黑色素瘤中有50%會發(fā)生BRAF突變[74]，主要突變類型為V600E和V600K，其中V600E占總突變的80%左右，V600E即第15外顯子中第1 799位核苷酸胸腺嘧啶（T）突變?yōu)橄汆堰剩ˋ），導致蛋白質(zhì)產(chǎn)物中第600位的纈氨酸（V）被谷氨酸（E）替代[75]。目前FDA批準上市用于BRAF突變的晚期或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的藥物有：維羅非尼、達拉非尼膠囊、曲美替尼，有效率分別為53%[76]、59%[77]、69%[78]。

BRAF基因檢測方法包括ARMS[76-79]、測序法[80]、HRM[81]、RFLP[82]等。

6.2 NRAS

NRAS是RAS家族的成員之一，黑色素瘤中，NRAS突變率為20%[83]。當NRAS發(fā)生突變時，激活CRAF通路。就會促使非正常黑色素細胞增殖。NRAS突變的患者可能對MEK抑制劑敏感。如一項Ⅱ期臨床試驗顯示，NRAS突變黑色素瘤對MEK162（binimetinib）敏感，有效率為20%[84]。

6.3 c-KIT

c-kit原癌基因（c-kit proto-oncogene，c-KIT）活化可激活下游的JAK/STAT/MAPK/PI3K等通路，導致細胞生長失控。黑色素瘤中黏膜和肢端的突變率分別為38%和36%[85]。KIT基因異常可表現(xiàn)為KIT的突變和（或）擴增。以外顯子11和外顯子13突變最為常見。目前多使用以下四種方法檢測c-kit基因突變：①ARMS；②HRM；③雜交探針法；④DHPLC結(jié)合直接測序的方法。2013年美國國立綜合癌癥網(wǎng)建議通過基因檢測對合適患者進行靶向治療。有報道稱KIT突變抑制劑伊馬替尼對KIT突變的患者有效[54]。

6.4 CTLA-4

細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）表達于T細胞表面，當與其配體B-7（CD80/CD86）結(jié)合，通過抑制T細胞活化來抑制免疫應答，使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸[86]。2011年美國FDA批準伊匹單抗（ipilimumab）用于手術(shù)不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，其反應率為11%[87]，但對于如何篩選出適合伊匹單抗的優(yōu)勢人群，對預測標志物并未有統(tǒng)一的標準。

6.5 PD-1/PD-L1

目前FDA批準用于不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的PD-1抑制劑有派姆單抗和納武單抗，有效率分別為38%[88]、31%[89]。PD-L1抑制劑用于黑色素瘤的治療尚在研究中。其檢測方法同上述肺癌。

7 結(jié)語

腫瘤發(fā)生的分子機制非常復雜，隨著基因組學的深入研究以及基因檢測技術(shù)不斷的發(fā)展和完善，越來越多的腫瘤細胞基因結(jié)構(gòu)和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路被發(fā)現(xiàn)，以基因檢測為基礎(chǔ)的精準醫(yī)療將從早期預測、個體化診療、預后評估等方面使更多的患者受益。

參考文獻

[1] Torre LA， Bray F， Siegel RL， et al. Global cancer statistics， 2012[J]. CA Cancer J Clin， 2015， 65（2）： 87-108.

[2] Reck M， Heigener DF， Mok T， et al. Management of nonsmall-cell lung cancer： recent developments[J]. Lancet， 2013， 382（9893）： 709-719.

[3] Irmer D， Funk JO， Blaukat A. egfr kinase domain mutations— functional impact and relevance for lung cancer therapy[J]. Oncogene， 2007， 26（39）： 5693-5701.

[4] Langer CJ. Epidermal growth factor receptor inhibition in mutation positive non-small-cell lung cancer： is afatinib better of simply newer？[J]. J Clin Oncol， 2013， 31（27）： 3303-3306.

[5] Hirsch FR， Bunn PA Jr. EGFR testing in lung cancer is ready for prime time[J]. Lancet Oncol， 2009， 10（5）： 432-433.

[6] Mok Ts， Wu YL， Thongprasert S， et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma[J]. N Engl J Med， 2009， 361（10）： 947-957.

[7] Miller VA， Riely GJ， Zakowski MF， et al. Molecular characteristics of bronchioloalveolar carcinoma and adenocarcinoma， bronchioloalveolar carcinoma subtype， predict response to erlotinib[J]. J Clin Oncol， 2008， 26（9）： 1472-1478.

[8] Yu PP， Vose JM， Hayes DF. Genetic cancer susceptibility testing： increased technology， increased complexity[J]. J Clin Oncol， 2015， 33（31）： 3533-3534.

[9] Mok TS， Wu YL， Ahn MJ， et al. Osimertinib or platinum pemetrexed in EGFR T790M-positive lung cancer[J]. N Engl J Med， 2017， 376（7）： 629-640.

[10] Eberhard DA， Johnson BE， Amler LC， et al. Mutations in the epidermal growth factor receptor and in KRAS are predictive and prognostic indicators in patients with non-small-cell lung cancer treated with chemotherapy alone and in combination with erlotinib[J]. J Clin Oncol， 2005， 23（25）： 5900-5909.

[11] Slebos RJ， Hruban RH， Dalesio O， et al. Relationship between K-ras oncogene activation and smoking in adenocarcinoma of the human lung[J]. J Natl Cancer Inst， 1991， 83（14）： 1024-1027.

[12] Slebos RJ， Kibbelaar RE， Dalesio O， et al. K-ras oncogene activation as prognostic marker in adenocarcinoma of the lung[J]. N Engl J Med， 1990， 323（9）： 561-565.

[13] Kwak EL， Bang YJ， Camidge DR， et al. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer[J]. N Engl J Med， 2010， 363（18）： 1693-1703.

[14] Shaw AT， Yeap BY， Mino-Kenudson M， et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell cancer who harbor EML4-ALK[J]. J Clin Oncol， 2009， 27（26）： 4247-4253.

[15] Camidge DR， Bang YJ， Kwak EL， et al. Activity and safety of crizotinib in patients with ALK-positive non-small-cell lung cancer： updated results from a phase 1 study[J]. Lancet Oncol， 2012， 13（10）： 1011-1019.

[16] Solomon BJ， Mok T， Kim DW， et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer[J]. N Engl J Med， 2014， 371（23）： 2167-2177.

[17] Shaw AT， Kim DW， Mehra R， et al. Ceritinib in ALKrearranged non-small-cell lung cancer[J]. N Engl J Med， 2014， 370（13）： 1189-1197.

[18] Ou SI， Ahn JS， De Petris L， et al. Alectinib in crizotinib- refractory ALK-rearranged non-small-cell lung cancer： a phase Ⅱ global study[J]. J Clin Oncol， 2016， 34（7）： 661-668.

[19] Shaw AT， Gan dhi L， Gadgeel S， et al. Alectinib in ALKpositive， crizotinib-resistant， non-small-cell lung cancer： a single-group， multicentre， phase 2 trial[J]. Lancet Oncol， 2016， 17（2）： 234-242.

[20] Shaw AT， Ou SH， Bang YJ， et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer[J]. N Engl J Med， 2014， 317（21）： 1963-1971.

[21] Kazandjian D， Blumenthal GM， Luo L， et al. Benefit-risk summary of crizotinib for the treatment of patients with ROS1 alteration- positive， metastatic non-small cell lung cancer[J]. Oncologist， 2016， 21（8）： 974-980.

[22] Ali SM， Hensing T， Schrock AB， et al. Comprehensive genomic profiling identifies a subset of crizotinib-responsive ALK-rearranged non-small cell lung cancer not detected by fluorescence in situ hybridization[J]. Oncologist， 2016， 21（6）： 762-770.

[23] Borghaei H， Paz-Ares L， Horn L， et al. Nivolumab versus docetaxel in advanced nonsquamous non-small-cell lung cancer[J]. N Engl J Med， 2015， 373（17）： 1627-1639.

[24] Garon EB， Rizvi NA， Hui R， et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer[J]. N Engl J Med， 2015， 372（21）： 2018-2028.

[25] Fehrenbacher L， Spira A， Ballinger M， et al. Atezolizumab versus docetaxel for patients with previously treated nonsmall-cell cancer （POPLAR）： a multicentre， open-label， phase 2 randomised controlled trial[J]. Lancet， 2016， 387（10030）： 1837-1846.

[26] Bellmunt J， Balar A， M.D. Galsky， et al. IMvigor210： updated analyses of first-line （1L） atezolizumab （atezo） in cisplatin（cis）-ineligible locally advanced/metastatic urothelial carcinoma （mUC）[J]. Ann Oncol， 2016， 27（6）： 266-295.

[27] Burstein HJ. The distinctive nature of HER2-positive breast cancers[J]. N Engl J Med， 2005， 353（16）： 1652-1654.

[28] Slamon DJ， Clark GM， Wong SG， et al. Human breast cancer： correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene[J]. Science， 1987， 235（4785）： 177-182.

[29] Slamon DJ， Leyland-Jones B， Shak S， et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2[J]. N Engl J Med， 2001， 344（11）： 783-792.

[30] Geyer CE， Forster J， Lindquist D， et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer[J]. N Engl J Med， 2006， 355（26）： 2733-2743.

[31] Wolff AC， Hammond M E， Hicks DG， et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer： American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update[J]. Arch Pathol Lab Med， 2014， 138（2）： 241-256.

[32] Molina-Montes E， Perez-Nevot B， Pollan M， et al. Cumulative risk of second primary contralateral breast cancer in BRCA1/BRCA2 mutation carriers with a first breast cancer： a systematic review and meta-analysis[J]. Breast， 2014， 23（6）： 721-742.

[33] Bougie O， Weberpals JI. Clinical considerations of BRCA1-and BRCA2-mutation carriers： a review[J/OL]. Int J Surg Oncol， 2011， 2011： 374012. doi： 10.1155/2011/374012.

[34] Drew Y， Ledermann J， Hall G， et al. Phase 2 multicentre trial investigating intermittent and continuous dosing schedules of the poly（ADP-ribose） polymerase inhibitor rucaparib in germline BRCA mutation carriers with advanced ovarian and breast cancer[J]. Br J Cancer， 2016， 114（7）： 723-730.

[35] van TVL， Dai H， van de Vijver MJ， et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer[J]. Nature， 2002， 415（6871）： 530-536.

[36] Sorlie T， Tibshirani R， Parker J， et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2003， 100（14）： 8418-8423.

[37] Paik S， Shak S， Tang G， et al. A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated， node-negative breast cancer[J]. N Engl J Med， 2004， 351（27）： 2817-2826.

[38] Takehana T， Kunitomo K， Kono K， et al. Status of c-erbB-2 in gastric adenocarcinoma： a comparative study of immunohistochemistry， fluorescence in situ hybridization and enzyme-linked immuno-sorbent assay[J]. Int J Cancer， 2002， 98（6）： 833-837.

[39] Tanner M， Hollmen M， Junttila TT， et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma： association with Topoisomerase IIalpha gene amplification， intestinal type， poor prognosis and sensitivity to trastuzumab[J]. Ann Oncol， 2005， 16（2）： 273-278.

[40] Risio M， De Rosa G， Sarotto I， et al. HER2 testing in gastric cancer： molecular morphology and storage time-related changes in archival samples[J]. Int J Oncol， 2003， 23（5）： 1381-1387.

[41] Ishikawa T， Kobayashi M， Mai M， et al. Amplification of the c-erbB-2 （HER-2/neu） gene in gastric cancer cells. Detection by fluorescence in situ hybridization[J]. Am J Pathol， 1997， 151（3）： 761-768.

[42] Hofmann M， Stoss O， Shi D， et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer： results from a validation study[J]. Histopathology， 2008， 52（7）： 797-805.

[43] Allgayer H， Babic R， Gruetzner K U， et al. c-erbB-2 is of independent prognostic relevance in gastric cancer and is associated with the expression of tumor-associated protease systems[J]. J Clin Oncol， 2000， 18（11）： 2201-2209.

[44] Bang YJ， Van Cutsem E， Feyereislova A， et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer （ToGA）： a phase 3， openlabel， randomised controlled trial[J]. Lancet， 2010， 376（9742）： 687-697.

[45] Lievre A， Bachet JB， Boige V， et al. KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab[J]. J Clin Oncol， 2008， 26（3）： 374-379.

[46] Etienne-Grimaldi MC， Formento JL， Francoual M， et al. K-Ras mutations and treatment outcome in colorectal cancer patients receiving exclusive fluoropyrimidine therapy[J]. Clin Cancer Res， 2008， 14（15）： 4830-4835.

[47] Tong JH， Lung RW， Sin FM， et al. Characterization of rare transforming KRAS mutations in sporadic colorectal cancer[J]. Cancer Biol Ther， 2014， 15（6）： 768-776.

[48] 劉偉， 王麗， 余英豪， 等. k-ras基因在中國結(jié)直腸癌患者中的突變狀態(tài)[J]. 世界華人消化雜志， 2011， 13（19）： 1367-1374.

[49] 孫毅， 艾尼瓦爾·艾木都拉， 古麗比也·沙比爾， 等. 結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中KRAS、BRAF基因突變觀察及分析[J]. 山東醫(yī)藥， 2014， 54（43）： 8-11.

[50] Amado RG， Wolf M， Peeters M， et al. Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer[J]. J Clin Oncol， 2008， 26（10）： 1626-1634.

[51] Thiel A， Ristim？ki A. Toward a molecular classification of colorectal cancer： the role of BRAF[J/OL]. Front Oncol， 2013， 3： 281. doi： 10.3389/fonc.2013.00281.

[52] Brandi G， Tavolari S， De Rosa F， et al. Antitumoral efficacy of the protease inhibitor gabexate mesilate in colon cancer cells harbouring KRAS， BRAF and PIK3CA mutations[J/ OL]. PLoS One， 2012， 7（7）： e41347. doi： 10.1371/journal. pone.0041347.

[53] Davies H， Bignell GR， Cox C， et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer[J]. Nature， 2002， 417（6892）： 949-954.

[54] Di Nicolantonio F， Martini M， Molinari F， et al. Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer[J]. J Clin Oncol， 2008， 26（35）： 5705-5712.

[55] Douillard JY， Oliner KS， Siena S， et al. PanitumumabFOLFOX4 treatment and RAS mutations in colorectal cancer[J]. N Engl J Med， 2013， 369（11）： 1023-1034.

[56] Bokemeyer C， Van Cutsem E， Rougier P， et al. Addition of cetuximab to chemotherapy as first-line treatment for KRAS wild-type metastatic colorectal cancer： pooled analysis of the CRYSTAL and OPUS randomised clinical trials[J]. Eur J Cancer， 2012， 48（10）： 1466-1475.

[57] 推進BRAF基因突變檢測提高臨床腫瘤診療水平[J]. 中國腫瘤臨床， 2016， 43（5）： 193.

[58] Koopman M， Kortman GA， Mekenkamp L， et al. Deficient mismatch repair system in patients with sporadic advanced colorectal cancer[J]. Br J Cancer， 2009， 100（2）： 266-273.

[59] Lochhead P， Kuchiba A， Imamura Y， et al. Microsatellite instability and BRAF mutation testing in colorectal cancer prognostication[J]. J Natl Cancer Inst， 2013， 105（15）： 1151-1156.

[60] Iacopetta B， Grieu F， Amanuel B. Microsatellite instability in colorectal cancer[J]. Asia Pac J Clin Oncol， 2010， 6（4）： 260-269.

[61] Yoon YS， Yu CS， Kim TW， et al. Mismatch repair status in sporadic colorectal cancer： immunohistochemistry and microsatellite instability analyses[J]. J Gastroenterol Hepatol， 2011， 26（12）： 1733-1739.

[62] Sargent DJ， Marsoni S， Monges G， et al. Defective mismatch repair as a predictive marker for lack of efficacy of fluorouracil-based adjuvant therapy in colon cancer[J]. J Clin Oncol， 2010， 28（20）： 3219-3226.

[63] Stevenson JB， Hymas WC， Hillyard DR. A novel capillary electrophoresis-based multiplex PCR assay for detection of respiratory pathogens[J]. Ann Clin Lab Sci， 2011， 41（1）： 33-38.

[64] Schürch CM， Riether C， Ochsenbein AF. Dendritic cellbased immunotherapy for myeloid leukemias[J/OL]. Front Immunol， 2013， 4： 496. doi： 10.3389/fimmu.2013.00496.

[65] Muddathir AM， Kordofani AA， Fadl-Elmula IM. Frequency of BCR ABL fusion transcripts in Sudanese patients with chronic myeloid leukemia using real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction[J]. Saudi Med J， 2013， 34（1）： 29-33.

[66] Dos Santos GA， Kats L， Pandolfi PP. Synergy against PMLRARa： targeting transcription， proteolysis， differentiation， and self-renewal in acute promyelocytic leukemia[J]. J Exp Med， 2013， 210（13）： 2793-2802.

[67] Breig O， Bras S， Martinez Soria N， et al. Pontin is a critical regulator for AML1-ETO-induced leukemia[J]. Leukemia， 2014， 28（6）： 1271-1279.

[68] Zaliova M， Meyer C， Cario G， et al. TEL/AML1-positive patients lacking TEL exon 5 resemble canonical TEL/AML1 cases[J]. Pediatr Blood Cancer， 2011， 56（2）： 217-225.

[69] Shiozawa Y， Pedersen EA， Taichman RS. GAS6/Mer axis regulates the homing and survival of the E2A/PBX1-positive B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia in the bone marrow niche[J]. Exp Hematol， 2010， 38（2）： 132-140.

[70] Chen YP， Lin HJ， Chen JS， et al. CDKN1A-mediated responsiveness of MLL-AF4-positive acute lymphoblastic leukemia to Aurora kinase-A inhibitors[J]. Int J Cancer， 2014， 135（3）： 751-762.

[71] Ottmann OG， Druker BJ， Sawyers CL， et al. A phase 2 study of imatinib in patients with relapsed or refractory Philadelphia chromosome-positive acute lymphoid leukemias[J]. Blood， 2002， 100（6）： 1965-1971.

[72] 黃賽， 楊華， 高麗， 等. 實時熒光定量PCR檢測急性髓系白血病患者MLL-AF9 融合基因表達的預后意義[J]. 中國實驗血液學雜志， 2013， 21（6）： 1453-1440.

[73] Siegel RL， Miller KD， Jemal A. Cancer statistics， 2016[J]. CA Cancer J Clin， 2016， 66（1）： 7-30.

[74] Zebary A， Omholt K， Vassilaki I， et al. KIT， NRAS， BRAF and PTEN mutations in a sample of Swedish patients with acral lentiginous melanoma[J]. J Dermatol Sci， 2013， 72（3）： 284-289.

[75] Chapman PB， Hauschild A， Robert C， et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation[J]. N Engl J Med， 2011， 364（26）： 2507-2516.

[76] Miller DM， Flaherty KT， Tsao H. Current status and future directions of molecularly targeted therapies and immunotherapies for melanoma[J]. Semin Cutan Med Surg， 2014， 33（2）： 60-67.

[77] Falchook GS， Long GV， Kurzrock R， et al. Dabrafenib in patients with melanoma， untreated brain metastases， and other solid tumours： a phase 1 dose-escalation trial[J]. Lancet， 2012， 379（9829）： 1893-1901.

[78] Long GV， Stroyakovskiy D， Gogas H， et al. Dabrafenib and trametinib versus dabrafenib and placebo for Val600 BRAFmutant melanoma： a multicentre， double-blind， phase 3 randomised controlled trial[J]. Lancet， 2015， 386（9992）： 444-451.

[79] Dote H， Tsukuda K， Toyooka S， et al. Mutation analysis of the BRAF codon 599 in malignant pleural mesothelioma by enriched PCR-RFLP[J]. Oncol Rep， 2004， 11（2）： 361-363.

[80] Marchant J， Mange A， Larrieux M， et al. Comparative evaluation of the new FDA approved THxID-BRAF test with high resolution melting and Sanger sequencing[J/OL]. BMC Cancer， 2014， 14： 519. doi： 10.1186/1471-2407-14-519.

[81] Ihle MA， Fassunke J， Konig K， et al. Comparison of high resolution melting analysis， pyrosequencing， next generation sequencing and immunohistochemistry to conventional Sanger sequencing for the detection of p.V600E and non-p. V600E BRAF mutations[J/OL]. BMC Cancer， 2014， 14： 13. doi： 10.1186/1471-2407-14-13.

[82] Pichler M， Balic M， Stadelmeyer E， et al. Evaluation of highresolution melting analysis as a diagnostic tool to detect the BRAF V600E mutation in colorectal tumors[J]. J Mol Diagn， 2009， 11（2）： 140-147.

[83] Milagre C， Dhomen N， Geyer FC， et al. A mouse model of melanoma driven by oncogenic KRAS[J]. Cancer Res， 2010， 70（13）： 5549-5557.

[84] Hodi FS， Friedlander P， Corless CL， et al. Major response to imatinib mesylate in KIT-mutated melanoma[J]. J Clin Oncol， 2008， 26（12）： 2046-2051.

[85] Curtin JA， Busam K， Pinkel D， et al. Somatic activation of KIT in distinct subtypes of melanoma[J]. J Clin Oncol， 2006， 24（26）： 4340-4346.

[86] Lee KM， Chuang E， Griffin M， et al. Molecular basis of T cell inactivation by CTLA-4[J]. Science， 1998， 282（5397）： 2263-2266.

[87] Hodi FS， ODay SJ， McDermott DF， et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma[J]. N Engl J Med， 2010， 363（8）： 711-723.

[88] Hamid O， Robert C， Daud A， et al. Safety and tumor responses with lambrolizumab （anti-PD-1） in melanoma[J]. N Engl J Med， 2013， 369（2）： 134-144.

[89] Topalian SL， Sznol M， McDermott DF， et al. Survival， durable tumor remission， and long-term safety in patients with advanced melanoma receiving nivolumab[J]. J Clin Oncol， 2014， 32（10）： 1020-1030.