廖德杰 曹善茂 童金茍 周 穎， 俞小牧 劉 陽 王 瀟

(1. 大連海洋大學遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心， 大連 116023； 2. 中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室， 武漢 430072； 3. 中國科學院大學， 北京 100049)

真核生物核糖體DNA是由高度串聯(lián)重復序列組成的多基因家族， 與其他蛋白編碼核基因不同，核糖體核DNA主要編碼核糖體RNA， 具有不同速度的進化區(qū)域， 如保守的編碼基因18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA等， 以及基因之間進化較快的轉錄間隔區(qū)域(ITSs)， 還包括獨立的5S rDNA[1]。其中， 核糖體內轉錄間隔區(qū)域(Internal transcribed spacer， ITSs)屬于非編碼區(qū)， 包括ITS1和ITS2兩個片段， 中間由5.8S rDNA隔開， 因其具有選擇壓力小、位點信息豐富、進化速度相對較快等特點[2]， 目前被廣泛應用于動物、植物、真菌等類群的系統(tǒng)發(fā)育與分類研究[3—7]。5S rDNA與其他核糖體基因相對獨立， 位于不同的轉錄單位[3]， 由高度保守的串聯(lián)重復序列組成， 每個重復單元包含編碼區(qū)和非轉錄間隔區(qū)(Non transcribed spacer， NTS)。編碼區(qū)具有高度保守性， 而NTS由于不發(fā)生轉錄， 導致物種在其進化過程中更容易積累其所發(fā)生的變異， 因而在不同物種間表現(xiàn)出明顯差異[8]。因此， 5S rDNA NTS多態(tài)性作為可靠的分子標記同樣廣泛應用于動植物的分子進化遺傳學和系統(tǒng)發(fā)育等相關研究[9，10]。

扇貝養(yǎng)殖是我國海水養(yǎng)殖業(yè)的主導產(chǎn)業(yè)之一，目前國內主要養(yǎng)殖的品種有北方的櫛孔扇貝(Chlamys farreri)、南方的華貴櫛孔扇貝(Mimachlamys nobilis)以及從美國引進的海灣扇貝(Argopecten irradians)和從日本引進的蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)。然而， 伴隨著扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展， 縱觀整個產(chǎn)業(yè)鏈條從苗種生產(chǎn)到成貝養(yǎng)殖均存在諸多問題， 如種質衰退嚴重、疾病災害頻發(fā)、死亡率升高、品質下降等[11]。因此， 新物種的引進可作為一種快速且有效的方法來應對目前扇貝養(yǎng)殖生產(chǎn)中所面臨的嚴峻問題。巖扇貝Rock scallop(Crassadoma gigantea)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectinidae)， 原產(chǎn)于北美太平洋沿岸， 具有個體大、生長速度快、抗逆性強、肉質鮮美等優(yōu)點， 在國際市場倍受青睞。因此， 大連海洋大學曹善茂教授于2012年開始從加拿大引進巖扇貝種貝， 并于2015年成功完成了全人工室內育苗試驗[12]， 目前處于養(yǎng)殖階段。然而， 有關巖扇貝的研究現(xiàn)主要集中在生理生態(tài)、生產(chǎn)養(yǎng)殖等方面[13—15]，其遺傳學背景的研究在國內外卻鮮見報道。作為外來引進新物種， 對其遺傳學及種質資源的評估資料仍處短缺狀態(tài)， 這將給生產(chǎn)應用和育種以及推廣帶來很大困擾。因此， 掌握品種資源的起源及其親緣關系， 是進行種質創(chuàng)新的基礎。

本研究擬通過對巖扇貝、蝦夷扇貝、櫛孔扇貝及海灣扇貝的核糖體ITS1序列和5S rDNA序列的測定， 分析其遺傳變異趨勢， 計算種間遺傳距離，并結合GenBank數(shù)據(jù)庫中其他扇貝的相應基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹， 從分子水平上探討巖山貝的遺傳背景及其系統(tǒng)進化地位， 以期為巖扇貝的種質資源保護及今后的遺傳育種研究工作提供部分基礎信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的巖扇貝、蝦夷扇貝、櫛孔扇貝及海灣扇貝樣品信息如表 1。所有個體經(jīng)形態(tài)學鑒定后取閉殼肌保存于無水乙醇中備用。GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的其他貝類的信息如表 2。

1.2 實驗方法

基因組DNA的提取參考Sambrook等[16]的酚/氯仿抽提法并略做修改。取溶解后的2 μL基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳， 檢測基因組DNA的完整性， 并取1 μL在NanoDrop 2000微量分光光度計上測定濃度， 最后稀釋成50 ng/μL的工作液于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

引物實驗所用引物由上海生物工程技術服務有限公司合成(武漢)。ITS1區(qū)域擴增引物序列參考丁小雷等[17]的引物序列， 正向引物F: 5′-GTTCC CCATGAACGAGGAATTCC-3′， 反向引物R: 5′-CGCATTTCGCTGCGTTCTTC-3′； 5S基因擴增引物序列參考José López-Pi?ón等[6]的引物序列， 包括2對引物， 分別為A (AF: 5′-AACACCGGTTCTCG TCCGATC-3′和AR: 5′-CAACGTGATATGGTC GTAGAC-3′)和B (BF: 5′-AGCCCGGTTAGT ACTTGG-3′和BR: 5′-CGACGTTGCTTAACTTCG-3′)。

表 1 扇貝樣品采集信息Tab. 1 Sample collection information of four scallops

表 2 從GenBank中獲得的其他物種序列的信息及GenBank登錄號Tab. 2 The information of related species and login numbers downloaded from the GenBank database

PCR擴增和測序PCR反應總體系為25 μL，包括1 μL模板DNA(50 ng/μL)， 2.5 μL 10×reaction buffer， 1.0 μL dNTP MIX (2.5 mmol/L)， 1.0 μL上下游混合引物(各10 μmol/L)， 0.2 μL 1 UTaqDNA聚合酶， 18.8 μL超純水； PCR反應條件是: 94℃預變性5min； 94℃變性35s， 50℃退火40s， 72℃延伸40s， 循環(huán)數(shù)為38； 最后72℃充分延伸10min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 經(jīng)BioSpin GelExtraction Kit純化回收后， 連接到pMD18-T載體上， 再轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α， 挑選陽性克隆送天一輝遠(武漢)生物科技有限公司進行雙向測序。

數(shù)據(jù)分析用BioEdit7.0進行序列拼接， 采用ClustalX 1.83 軟件進行編輯、校對和排序。單倍型數(shù)(h)、單倍型多樣性指數(shù)(Hd) 、核苷酸多樣性指數(shù)(π)、平均核苷酸差異數(shù)(k)等遺傳多樣性參數(shù)使用DNAsp4.10軟件進行分析計算， 使用MEGA5.1軟件計算種間遺傳距離， 并應用鄰接法Neighbor-Joining(NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹， 系統(tǒng)樹中節(jié)點的自舉置信水平應用Bootstrap(重復次數(shù)1000)。

2 結果

2.1 序列分析

四種扇貝ITS1序列分析4種扇貝的ITS1和部分18S的測序結果及GenBank登入號如表 3。首先， 通過PCR擴增測序， 4種扇貝均獲得長度為246 bp的部分18S序列和長度不等的ITS1全長序列。ITS1序列長度在229—277 bp， 其中海灣扇貝的序列最長， 而巖扇貝最短。其次， 堿基組成結果顯示， 4種扇貝部分18S序列的A+T含量均為48.4%， 低于G+C含量， 無種間差異； 而ITS1序列的A+T含量在54.5%—58.1%， 均高于G+C含量。此外， 4種扇貝ITS1序列的遺傳變異參數(shù)如表 4， 海灣扇貝、櫛孔扇貝、巖扇貝和蝦夷扇貝分別獲得2、6、2、5個單倍型， 4個種無共有單倍型； 核苷酸變異位點數(shù)分別為1、12、1、4， 其中櫛孔扇貝和蝦夷扇貝均含有2個插入/缺變異位點， 其余均為轉換和顛換變異；4種扇貝的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)以及平均核苷酸差異值分別在0.425—0.800、0.00081—0.00486以及0.366—2.442， 所有參數(shù)的最高值和最低值均分別為櫛孔扇貝和巖扇貝。

表 3 四種扇貝18S-ITS1測序結果及GenBank登錄號Tab. 3 The sequencing results of 18S-ITS1 and GenBank accession No. of four scallops

表 4 四種扇貝ITS1序列的遺傳變異分析Tab. 4 Genetic variation analysis of the ITS1 sequences in four scallop

表 5 四種扇貝5S rDNA序列測序結果及GenBank登錄號Tab. 5 The sequencing results of 5S rDNA and GenBank accession No. of four scallops

四種扇貝5S序列分析4種扇貝5S序列的測序結果及GenBank登錄號如表 5。首先， 通過PCR擴增測序， 4種扇貝均獲得長度為120 bp的編碼區(qū)序列和長度不等的NTS全長序列。NTS序列總長度在350—421， 序列最長和最短的分別為海灣扇貝和蝦夷扇貝。其次， 堿基組成結果顯示， 4種扇貝的5S rDNA編碼區(qū)序列的A+T含量均為46.7%， 低于G+C含量； 而在NTS序列中的A+T含量在57.5%—63.7%， 均高于G+C含量。此外， 4種扇貝5S rDNA NTS序列的遺傳變異參數(shù)如表 6， 海灣扇貝、櫛孔扇貝、巖扇貝和蝦夷扇貝分別獲得5、5、2、3個單倍型， 4個種無共有單倍型； 核苷酸變異位點數(shù)分別為12、14、1、4， 所有變異位點均為轉換和顛換變異； 4種扇貝的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)以及平均核苷酸差異值分別在0.533—0.842、0.00108—0.01058、0.533—5.726，所有參數(shù)的最高值和最低值均分別為海灣扇貝和巖扇貝。

2.2 種間遺傳距離

利用獲得的所有ITS1以及5Sr DNA序列分別對4種扇貝進行種間遺傳距離計算， 結果如表 7。首先， 對角線上方的數(shù)值為基于5Sr DNA序列計算所得， 4種扇貝相互之間的遺傳距離在0.043—0.457，其中最大值為海灣扇貝與櫛孔扇貝之間的遺傳距離， 最小值為巖扇貝與蝦夷扇貝之間的遺傳距離，而巖扇貝與櫛孔扇貝和海灣扇貝的遺傳距離分別為0.096和0.413。其次， 對角線下方數(shù)值為基于ITS1序列計算所得， 4種扇貝相互之間的遺傳距離在0.040—0.131， 其中最大值為海灣扇貝與櫛孔扇貝之間的遺傳距離， 最小值為巖扇貝與蝦夷扇貝之間的遺傳距離， 而巖扇貝與櫛孔扇貝和海灣扇貝的遺傳距離分別為0.062和0.121?？傮w上看， 基于2種方法所得結果的趨勢較為一致。但也存在一定的差異， 如基于ITS1序列的結果顯示海灣扇貝與蝦夷扇貝間的遺傳距離(0.124)略微大于海灣扇貝與巖扇貝間的遺傳距離(0.121)， 而基于5S rDNA序列的計算結果卻與之相反， 但數(shù)值上同樣相差0.003。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究利用獲得的所有ITS1以及5S rDNA的單倍型序列， 并結合GenBank數(shù)據(jù)庫中其他扇貝的相應序列， 利用鄰接法Neighbor-Joining (NJ) 構建系統(tǒng)發(fā)育樹， 選取牡蠣科的兩個種作為外源群。目前GenBank數(shù)據(jù)庫中能夠獲得的扇貝科物種的相關數(shù)據(jù)較少， 本研究僅對獲得的部分數(shù)據(jù)進行分析。如圖 1和圖 2所示， 首先， 基于ITS1序列構建的系統(tǒng)進化樹結果顯示(圖 1)， 除外源群牡蠣科的兩個物種外， 扇貝科的10個物種明顯分為2個單系群， 置信度在90%以上， 其中1個單系群包括Patinopecten、Crassadoma、Chlamys以及Mimachlamys四個扇貝屬， 該單系群又分為2個分支， 其中本研究所得蝦夷扇貝的5個單倍型、巖扇貝的2個單倍型以及海灣扇貝的6個單倍型分別聚為一支， 蝦夷扇貝與巖扇貝聚類之后再與櫛孔扇貝聚類， 但Chlamys中的一個種卻與Mimachlamys中的2個聚為了另一支； 另一個單系群包括Argopecten、Pecten以及Aequipecten三個扇貝屬， 其中本研究所得海灣扇貝的2個單倍型與紫扇貝聚為一支， 再與女王扇貝聚類， 最后與歐洲扇貝聚為一個單系群。此外， 基于5S序列構建的系統(tǒng)進化樹結果顯示(圖 4)， 其不同扇貝屬間的聚類結果與基于ITS1序列構建的系統(tǒng)進化樹結果完全一致， 但置信度值存在一定差異。

表 6 四種扇貝5S rDNA序列的遺傳變異分析Tab. 6 Genetic variation analysis based on the sequences of 5S rDNA in four scallops

表 7 四種扇貝的種間遺傳距離(對角線下方為ITS1； 對角線上方為5S rDNA)Tab. 7 Genetic distance among four scallops(below diagonal is for ITS1； above diagonal is for 5S rDNA)

圖 1 應用鄰接法(NJ)構建基于ITS1序列的扇貝科系統(tǒng)進化樹Fig. 1 The Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree in Pectinidae constructed with the ITS1 sequences

圖 2 應用鄰接法(NJ)構建基于5S rDNA序列的扇貝科系統(tǒng)進化樹Fig. 2 The Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree in Pectinidae constructed with the 5S rDNA sequences

3 討論

3.1 四種扇貝ITS1序列特征

核糖體DNA轉錄間隔區(qū)ITS1， 具有變異較大、多態(tài)性較高等特點， 適合親緣關系較近的物種遺傳多樣性研究[18]， 同時已廣泛應用于物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究[19—21]。本研究通過測序， 獲得了4種扇貝部分18S rDNA序列和ITS1全序列。首先， 所得的18S rDNA序列經(jīng)Clustal X比對分析發(fā)現(xiàn)， 4種扇貝具有高度同源性， 且A+T含量均為48.37%， 低于G+C含量， 無物種間差異， 該研究結果與丁小雷等[17]對雙殼類的相關研究結論一致， 因此學者們普遍認為18S rDNA比較適合于動植物高級階元類的遺傳差異及系統(tǒng)發(fā)育等相關研究[4，22]。而4種扇貝ITS1序列的種間同源性較低， 有包括轉換、顛換以及插入/缺失在內的核苷酸變異， 且存在明顯的種間長度多態(tài)。有報道，ITS1序列最短的僅有70 bp(鹿茸珊瑚Acropora longicyathus)[23]， 而最長的達760 bp(克氏原螯蝦Procambarus clarkii)[24]， 因此許多學者認為ITS1可作為物種鑒定的有效分子標記[1，5]。此外， 本研究所得4種扇貝ITS1序列的堿基組成具有一定差異， 其A+T含量在54.48%—58.1%， 均高于G+C含量， 該趨勢與Insua等[6]在其他扇貝中的研究結果一致。Freire等[25]曾報道， 在雙殼類動物中，ITS1序列的A+T含量一般在34%—55%， 但在隨后相關研究卻表明雙殼類的A+T含量普遍接近該范圍的最高值， 甚至更高[6]。

3.2 四種扇貝5S rDNA序列特征

5S rDNA因拷貝數(shù)多且具有高度保守性， 以及在核基因組不同拷貝間趨于相近等特點， 通過FISH定位可水生生物類的染色體鑒別、倍性鑒定、遺傳標記開發(fā)等提供新的有效途徑， 目前在雙殼類中已有許多相關研究報道， 如Insua等[26]利用5S rDNA對歐洲土著的2種扇貝(Pecten maximus和Mimachlamys varia)進行了核型及染色體定位研究，Huang等[27—29]利用5S rDNA分別對櫛孔扇貝、蝦夷扇貝以及海灣扇貝進行了染色體定位等相關研究。此外， 5S rDNA NTS由于具有高度變異的特點，已作為可靠的分子標記被廣泛應用于動植物的遺傳進化及系統(tǒng)發(fā)育相關研究， 尤其在植物方面有大量的研究報道[10，30]。本研究通過測序， 獲得了4種扇貝的5S rDNA全序列， 其編碼區(qū)序列均為120 bp，序列經(jīng)Clustal X比對發(fā)現(xiàn)具有高度的種間同源性，同時與José López-Pi?ón等[9]獲得的4種歐洲扇貝5S rDNA編碼區(qū)序列也具有高度同源性。然而4種扇貝NTS序列的種間同源性較低， 同時具有轉換、顛換和插入/缺失變異， 且存在明顯的種間長度多態(tài)，該結果與José López-Pi?ón等[9]對其他扇貝的相關研究結果一致。堿基組成結果顯示， 4種扇貝NTS序列的A+T含量(57.5%—63%)明顯高于G+C含量， 該趨勢與其他扇貝的結果一致[9]， 但與謝明樹等[31]對魚類研究所得的結果卻相反， 在哺乳類中也存在類似的現(xiàn)象(G+C＞60%)[32，33]， 對于該現(xiàn)象的解釋， 至今尚未有學者進行詳細報道， 但筆者猜測這可能是不同物種通過對環(huán)境長期適應適應的機制而造成的差異。

3.3 四種扇貝ITS1和5S rDNA序列的遺傳變異分析

目前， 核苷酸多樣性指數(shù)(π)和單倍型多樣性指數(shù)(Hd)通常是評估種群遺傳多樣性的兩個重要指標， 它們反映了物種遺傳多樣性水平的高低[34]。但由于單個堿基的變異就能生成一種新的單倍型， 因此Hd值可在短時間內積累變異而快速提高， 但對π的影響卻很小，π值的提高需要長時間的積累， 因而π值在衡量種群遺傳多樣性時比Hd值更具有代表性[35]。首先， 本研究中基于ITS1序列的分析結果表明， 櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的Hd最高(均為0.800)， 巖扇貝最低， 并與海灣扇貝相差不大， 但蝦夷扇貝的π值明顯低于櫛孔扇貝。因此， 鑒于郝桂英等[35]的結論， 筆者認為本研究采樣區(qū)的4種扇貝中， 櫛孔扇貝的遺傳多樣性最高(0.00486)， 其次是蝦夷扇貝(0.00252)， 而巖扇貝的遺傳多樣性最低。而基于5S序列的分析結果顯示， 櫛孔扇貝的遺傳多樣最高(π=0.01058)， 其次海灣扇貝是(π=0.01040)， 但兩者的遺傳多樣性水平較接近， 而巖扇貝的遺傳多樣性依然最低(π=0.00108)。通常來說， 種群遺傳多樣性是種群活力的基礎， 是物種適應環(huán)境變化、維持生存和進化的重要保證[36]。綜合本研究中ITS1序列和5S rDNA序列的分析結果看， 盡管2種基因的分析結果存在一定的差異， 但筆者認為采樣區(qū)的海灣扇貝、蝦夷扇貝和櫛孔扇貝均表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性(π＜0.01)[36]， 將不利物種適應環(huán)境變化而維持生存， 這可能與實驗樣本均為養(yǎng)殖群體有關。至于造成2種基因的結果差異， 一方面原因可能是實驗樣本量不夠大以及采樣地區(qū)的限制， 另一方面則是不同基因的進化速度本身存在差異。而引進種巖扇貝則表現(xiàn)出更低的遺傳多樣性， 這可能是由于實驗樣本為F1代個體， 僅由少數(shù)幾個引進親本近交繁育而來， 其遺傳背景相對單一， 胡麗萍等[37]曾在其他扇貝中也報道了類似現(xiàn)象。

3.4 四種扇貝的遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究通過獲得的所有ITS1序列和5S rDNA序列， 計算了4種扇貝相互之間的遺傳距離。首先， 基于ITS1序列的遺傳距離分析結果表明， 引進種巖扇貝與蝦夷扇貝間的遺傳距離最近(0.040)， 緊接著是櫛孔扇貝(0.062)， 與海灣扇貝之間的遺傳距離最遠(0.121)； 而其余3種扇貝則是蝦夷扇貝與櫛孔扇貝之間的遺傳距離最近(0.054)， 此部分結果與秦艷杰等[38]應用AFLP技術的研究結果一致。同時， 在本研究中基于5S序列的遺傳距離分析結果與基于ITS1序列的分析結果一致， 這進一步證實了4種扇貝間親緣關系的遠近。

此外， 本研究還利用獲得的所有ITS1和5S rDNA單倍型序列以及GenBank數(shù)據(jù)庫中其他扇貝的相應序列， 構建系統(tǒng)發(fā)育樹， 以探討不同扇貝間的親緣關系。結果顯示， 基于ITS1序列和5S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結果完全一致， 引進種巖扇貝先與蝦夷扇貝聚為一支， 再與櫛孔扇貝進行聚類，而海灣扇貝則與其他扇貝聚為另一個單系群。目前基于ITS1和5S rDNA序列在扇貝系統(tǒng)進化方面的研究鮮有報道， 僅有Insua等[6]和José López-Pi?ón等[9]對歐洲的4種扇貝進行了相關研究。大量文獻資料卻顯示， 扇貝系統(tǒng)發(fā)育及進化等相關的研究主要是基于線粒體基因序列進行開展(COI、16S、12S等)， 如Canapa 等[39]通過對6種扇貝16S序列的比較分析， 探討了這些扇貝物種的系統(tǒng)發(fā)生關系；Barucca等[40]利用16S和12S序列的比較分析， 構建了系統(tǒng)進化樹； Puslednik等[41]同時采用線粒體基因(16S和12S )以及核基因(H3 組蛋白)的部分序列構建了46種扇貝的系統(tǒng)進化樹， 包括引進種巖扇貝在內， 其結果表明蝦夷扇貝先與冰島扇貝(Chlamys islandica)聚為一個分支， 再與巖扇貝進行聚類， 而與海灣扇貝相距較遠， 但文中未對櫛孔扇貝(C. farreri)的親緣關系進行報道。

4 結論

綜上所述， 本研究通過測序獲得了巖扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝、櫛孔扇貝的核糖體內轉錄間隔區(qū)ITS1及5S rDNA的序列， 首先對其序列的堿基組成及遺傳多樣性進行了分析， 相比4種扇貝的分析結果看櫛孔扇貝的遺傳多樣性最高， 巖扇貝的遺傳多樣性最低， 但總體來看， 4種扇貝均表現(xiàn)出較低的多樣性水平； 其次， 利用獲得的所有ITS1序列和5S rDNA序列分別對4種扇貝之間的遺傳距離進行了計算， 2種方法的結果均表明巖扇貝與蝦夷扇貝的遺傳距離最近， 而與海灣扇貝的遺傳距離最遠；最后， 利用獲得的4種扇貝的單倍型序列以及Ge-Bank中其他扇貝的相應序列， 基于NJ法構建了系統(tǒng)進化樹， 基于ITS1序列和5S rDNA序列分別構建的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結果完全一致， 引進種巖扇貝先與蝦夷扇貝聚為一支， 再與櫛孔扇貝進行聚類， 而海灣扇貝則與別的扇貝聚為另一個單系群。該研究結果將為巖扇貝的引種與養(yǎng)殖以及今后的遺傳育種研究工作提供一些基礎數(shù)據(jù)。

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