丁上書 霍涌瑋 張曉田 路 明周勁松 邢俊平 王麗蓉 張秋養(yǎng) 田 宏**

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（西安 710061）；2.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系；3.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心；4.美國杜蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)與細(xì)胞生物學(xué)系，美國 新奧爾良 70112-2699

精索靜脈曲張（varicocele，VC）被認(rèn)為是導(dǎo)致男性不育或生育力低下的最常見的且可手術(shù)矯正的病因[1]。據(jù)調(diào)查顯示35%～44%的原發(fā)性男性不育和45%～81%的繼發(fā)性男性不育皆可發(fā)現(xiàn)左側(cè)精索靜脈曲張病變[2,3]。在精索靜脈曲張導(dǎo)致男性不育或生育力低下的病理改變中，附睪的結(jié)構(gòu)功能紊亂扮演著重要的角色[4]。附睪黏膜所分泌的蛋白，如cathelicidins抗菌肽、防御素、胱蛋白[5]和精子結(jié)合蛋白11家族（sperm associated antigen SPAG 11）等，皆參與了精子在附睪中成熟的過程[6]，一旦附睪出現(xiàn)病理性變化，勢必造成精液質(zhì)量和精子相關(guān)功能的下降，從而影響男性生育力[7]。

奈斯的自我實(shí)現(xiàn)原則指出，生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性和共生能夠增加生物多樣性，而生物多樣性又能夠增加人類自我實(shí)現(xiàn)的潛能，[4]3保護(hù)野生動(dòng)物從根本上講是為了保護(hù)人類自身的健康生活和生存環(huán)境。

精索靜脈曲張的病理機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，精索靜脈曲張可致附睪質(zhì)量下降、附睪管腔直徑變窄、附睪上皮主細(xì)胞凋亡增多[8]和α-葡萄糖苷酶活力下降[9]，電鏡下發(fā)現(xiàn)附睪上皮主細(xì)胞中溶酶體變大增多、細(xì)胞器功能紊亂[10]，由其產(chǎn)生的附睪分泌蛋白在精索靜脈曲張時(shí)亦發(fā)生變化[11]，這將導(dǎo)致精子成熟微環(huán)境的改變，可能成為精索靜脈曲張致男性不育的原因。本研究試圖通過建立實(shí)驗(yàn)性左側(cè)精索靜脈曲張（experimental left varicocele, ELV） 大鼠模型，明確精索靜脈曲張是否引起精子結(jié)合抗原11C（SPAG11C ）和精子結(jié)合抗原11T（SPAG11T）的表達(dá)發(fā)生變化，為探究精索靜脈曲張導(dǎo)致男性不育的機(jī)制提供資料。

材料與方法

一、材料

（一）動(dòng)物分組及飼養(yǎng)

48只8周齡的健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，經(jīng)學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)），飼養(yǎng)于相對濕度25%、溫度23～25℃的無菌環(huán)境中，使用雙蒸水和動(dòng)物中心提供的大鼠飼料喂養(yǎng)，隨機(jī)平均分籠并標(biāo)記分為4組。A組：假手術(shù)2周組；B組：假手術(shù)4周組；C組：ELV造模2周組；D組：ELV造模4周組；每組均為12只大鼠。

三峽職院機(jī)制專業(yè)自實(shí)行“因材施教、分層培養(yǎng)、工學(xué)交替、強(qiáng)化技能”人才培養(yǎng)模式以來，學(xué)生就業(yè)率保持在95%以上，學(xué)生技能水平和創(chuàng)新能力得到較快提升，先后獲得湖北省大學(xué)生機(jī)械創(chuàng)新設(shè)計(jì)大賽一等獎(jiǎng)二次、二等獎(jiǎng)一次，獲得國家專利三項(xiàng)，參與企業(yè)技術(shù)開發(fā)多項(xiàng)。

ELV造模2周時(shí)，取模型鼠和假手術(shù)鼠雙側(cè)附睪，稱量記錄后分別置于Bouin's液和TRIzol液處理過的EP管中，完成附睪組織固定和低溫冷凍保存。

（一）Real-time PCR

1.引物設(shè)計(jì)合成：GenBank上查詢大鼠的SPAG11C（AY600145）、SPAG11T（AY600144）和β-肌動(dòng)蛋白（NM031144）mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，委托AuGCT基因公司合成。SPAG11C的上游引物5′-CCACAGCCATGAAACAGAGA -3′，上游引物5′-GAAGGGATGTAAGCAGCAGG -3′；SPAG11T的上游引物5′-TTTGTCAACCTCCTCCTTGC-3′，上游引物5′- CATGTGGGCTCCATATTTCC-3′；內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白的上游引物5′-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，上游引物5′- CTGGAAGGTGGACAGTGAG -3′。

2.總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄cDNA：從-80℃中取出TRIzol-EP管，將附睪標(biāo)本置于研磨器中，按照1mL Trizol:100mg 組織的比例加入TRIzol研磨成組織勻漿后，4℃，12 000×g，離心10min，將上清液移至DEPC（焦碳酸二乙酯，Sigma，美國）處理的EP管中，依次加入400μL氯仿、1mL 異丙醇后，取上清液， 4℃，12 000×g，離心10min后75%乙醇，洗滌2次。使用NanoDrop 2000型（Thermo， 美國）分光光度計(jì)測定RNA濃度及260/280nm比值。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，美國）按步驟獲取cDNA。

（二）動(dòng)物模型建立方法[12]

二、方法

使用乙醚吸入麻醉，左側(cè)中腹部1.0～1.5cm切口入腹腔，逐層暴露進(jìn)入腹膜后隙尋找到左腎靜脈，使用4-0無菌手術(shù)線聯(lián)合直徑0.5 mm細(xì)鐵絲進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎完成后，抽出鐵絲，關(guān)腹縫合。在ELV術(shù)后2周和4周時(shí)，將大鼠麻醉后剖腹觀察，以左精索靜脈直徑較術(shù)前擴(kuò)大2倍以上且雙腎質(zhì)量相似為標(biāo)準(zhǔn)成功建立ELV模型鼠。假手術(shù)只需分離暴露左腎靜脈，不行結(jié)扎術(shù)。

（三） 動(dòng)物器官取材及處理

大荔縣土地總面積1776.4km2，分為北部黃土臺(tái)塬區(qū)、中部洛灌區(qū)、東部黃河灘區(qū)和南部沙苑區(qū)，除沙苑區(qū)外，其他各區(qū)均適宜核桃生長，我們充分利用此類土地大力發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè)，促進(jìn)農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，帶動(dòng)群眾增收致富。

新鮮制備Bouin's 固定液，并標(biāo)記組別+左（右）側(cè)備用。取用40支滅菌滅酶EP管，分別標(biāo)記組別+左（右）側(cè)，滴加300μL TRIzol液（Invitrogen，美國）備用。

3.PCR擴(kuò)增：將假手術(shù)組的右側(cè)附睪樣本作為擴(kuò)增對照組，建立25μL反應(yīng)體系，模板cDNA 2μL（陰性對照不加模版，使用滅菌DEPC水），上下游引物各1μL， 2×SYBR Real-time PCR pre-mixture（百泰克，中國）12.5μL，滅菌DEPC水8.5μL。置于Real-time PCR儀TL988（Tianlong，中國）中，設(shè)置反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，40個(gè)循環(huán)中95℃變性15 s，57℃（SPAG11C）/58℃（SPAG11T）/56℃（β-肌動(dòng)蛋白）20 s。收集CT值，使用2-△△CT計(jì)算基因相對表達(dá)量。

突然，幾枝步槍啪啪地響起。不用說，是國軍的一支偵察小分隊(duì)，他們與這撥鬼子遭遇上了。槍聲一響，受了驚的大洋馬便嘶鳴著四散開去，不一會(huì)兒，有馬撞了地雷，轟轟作響。一匹馬朝陳大勇方向撞來，眼看要踩上了，陳大勇猛地站了起來，照著馬上的鬼子猛扣扳機(jī)。

（二）免疫組織化學(xué)染色

石蠟包埋各組別附睪組織，5μm切片，脫蠟至水，3% H2O2浸泡15min，1% Triton X-100（北京化學(xué)試劑廠，中國）穿透15min，5% 正常山羊血清封閉30min，滴加兔抗小鼠SPAG11C和SPAG11T一抗（1:1200，美國北卡羅萊納大學(xué)Susan教授惠贈(zèng)），4℃孵育過夜。次日恢復(fù)室溫40min，滴加生物素化山羊抗兔二抗37℃孵育60min，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素37℃孵育25min，滴加DAB顯色液3～5min，終止反應(yīng)。使用蘇木精染液復(fù)染細(xì)胞核1～3min，浸入自來水中返藍(lán)15min，脫水透明后，中性樹膠封片。以正常兔血清代替一抗作陰性對照。使用Olympus BX-1型數(shù)碼顯微鏡觀察鏡下并采集圖像。免疫組化圖像結(jié)果使用圖像分析軟件（Image Pro Plus5.1，美國）測量比較。每組至少選取5張不同個(gè)體來源的切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野區(qū)（×400）獲得陽性細(xì)胞的累積面積，并將計(jì)算所得的平均積分光密度（Integrated optical density, IOD）作為指標(biāo)，數(shù)值與免疫強(qiáng)度成正比。

串聯(lián)PHEV通常稱為增程式混合動(dòng)力汽車。串聯(lián)PHEV結(jié)構(gòu)原理如圖4所示。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為：純電動(dòng)＋增程器，汽車車輪僅由電動(dòng)機(jī)獨(dú)立驅(qū)動(dòng)，增程器可以是發(fā)動(dòng)機(jī)—發(fā)電機(jī)組，發(fā)動(dòng)機(jī)—發(fā)電機(jī)組發(fā)電直接供給電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)汽車，同時(shí)發(fā)出的多余電量給蓄電池包充電，增程器還可以是燃料電池等。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果輸入SPSS19.0軟件，各組別實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以±s表示，使用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)定為組間存在顯著性差異。

結(jié) 果

一、Real-time PCR

本研究采用目的基因的相對擴(kuò)增量作為指標(biāo)，分別比較ELV造模2周組和4周組左側(cè)附睪SPAG11C和SPAG11T mRNA 表達(dá)量與同期假手術(shù)對照組和右側(cè)附睪的變化以及ELV造模2周和4周組間其mRNA表達(dá)的差異。ELV造模2周時(shí)，造模鼠左側(cè)附睪的SPAG11C相對擴(kuò)增量較假手術(shù)組顯著性降低（P＜0.05，圖1A），且左側(cè)附睪低于右側(cè)附睪（P＜0.05，圖1A）。ELV造模4周，造模組左側(cè)附睪SPAG11C相對擴(kuò)增量較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.05，圖1A），左側(cè)附睪亦低于右側(cè)附睪（P＜0.05，圖1A）。 ELV造模4周組左側(cè)附睪SPAG11C mRNA較ELV造模2周組同側(cè)附睪顯著性減低（P＜0.05，圖1A）。ELV造模組SPAG11T mRNA的變化與SPAG11C相同（圖1B）。

二、免疫組化

SPAG11C和T免疫組化陽性反應(yīng)呈棕褐色，且兩蛋白在附睪組織中的表達(dá)均呈現(xiàn)細(xì)胞特異性和區(qū)段特異性。SPAG11C和T均集中表達(dá)在附睪上皮的主細(xì)胞胞質(zhì)中（圖2A和圖2B），暈細(xì)胞、基細(xì)胞和亮細(xì)胞表達(dá)呈陰性。SPAG11C沿附睪體部近端表達(dá)逐漸減弱甚至消失（圖2A），而SPAG11T則在附睪頭部遠(yuǎn)端、體部近端和尾部表達(dá)較強(qiáng)（圖2B），在附睪頭部始段未見兩蛋白的表達(dá)。將積分光密度作為免疫強(qiáng)度的指標(biāo)，ELV造模2周組和4周組左側(cè)附睪SPAG11C和SPAG11T的表達(dá)與假手術(shù)組和同期右側(cè)組相比，均顯著降低（P＜0.05）；ELV造模4周組左側(cè)附睪兩蛋白的表達(dá)均較ELV造模2周組明顯減少（P＜0.05），余未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（表1和表2）。

圖1 SPAG11C和SPAG11T的mRNA在ELV造模2周組和4周組大鼠附睪組織中相對擴(kuò)增量的分析

圖2 ELV造模2周和4周時(shí)SPAG11C和SPAG11T在造模組和假手術(shù)組大鼠附睪組織中的表達(dá)

表1 ELV大鼠附睪組織中SPAG11C免疫組化積分光密度值測定結(jié)果（±s）

表1 ELV大鼠附睪組織中SPAG11C免疫組化積分光密度值測定結(jié)果（±s）

與同期假手術(shù)組比較，*：P＜0.05；與同期右側(cè)附睪組比較，#：P＜0.05；與2周造模組同側(cè)附睪組相比較，△：P＜0.05

組別 N SPAG11C ELV造模2周組左側(cè)附睪 6 102.34±1.79*#右側(cè)附睪 6 111.35±1.23假手術(shù)組 12 114.78±3.17 ELV造模4周組左側(cè)附睪 6 92.81±1.30*#△右側(cè)附睪 6 108.98±1.27假手術(shù)組 12 109.50±2.18

表2 大鼠附睪組織中SPAG11T免疫組化積分光密度值測定結(jié)果（±s）

表2 大鼠附睪組織中SPAG11T免疫組化積分光密度值測定結(jié)果（±s）

與同期假手術(shù)組比較，*：P＜0.05；與同期右側(cè)附睪組比較，#：P＜0.05；與2周造模組同側(cè)附睪組相比較，△：P＜0.05

組別 NSPAG11T ELV造模2周組左側(cè)附睪 6 100.39±1.37*#右側(cè)附睪 6 109.92±1.65假手術(shù)組 12 110.07±1.67 ELV造模4周組左側(cè)附睪 6 90.46±2.92*#△右側(cè)附睪 6 110.20±2.30假手術(shù)組 12 112.43±1.91

討 論

SPAG11基因家族編碼的產(chǎn)物，根據(jù)種屬分類，又命名為Bin-1b（大鼠），附睪蛋白-2（靈長類），human epididymis-2（人類），承擔(dān)免疫和生殖的功能[13,14]。由于不同啟動(dòng)子和選擇性剪接機(jī)制至少生成了9個(gè)不同的剪切轉(zhuǎn)錄本，hSPAG11A- hSPAG11I在人類和黑猩猩中發(fā)現(xiàn)，恒河猴則出現(xiàn)了13個(gè)（m SPAG11B,C，E and m SPAG11J-S）[15-18]。SPAG11的蛋白同分體是由氨基末端的46個(gè)氨基酸耦合不同外顯子組合編碼的羧基末端組成。SPAG11C 是由外顯子1,2（不完全）和3組成，SPAG11T則是由外顯子1和2組成[19]。SPAG11是附睪上皮的分泌蛋白，證明與精子成熟密切相關(guān)。蛋白結(jié)構(gòu)中有6個(gè)似防御素的半胱氨酸的模序，與固有免疫相關(guān)，SPAG11C 在附睪、睪丸、大腦、腎臟、前列腺和卵巢都有表達(dá)，并在多系統(tǒng)產(chǎn)生抗菌作用。眾多研究表明，人類、恒河猴、牛、大鼠和小鼠的SPAG11蛋白和多肽主要通過穿透細(xì)胞膜和抑制大分子合成等機(jī)制，起到廣譜的抗菌作用[14,20,21]。SPAG11C蛋白的羧基末端的多肽并沒有抗菌作用，但可促進(jìn)對完全蛋白的正確折疊。大鼠SPAG11C蛋白的氨基末端起到重要的抗菌作用。在人類，SPAG11蛋白家族同分體包括一個(gè)類似弗林蛋白的前蛋白轉(zhuǎn)換酶模序（furin-like proprotein convertase motif RVKR）[22,23]。由于在RVKR裂隙形成的SPAG11多肽在附睪液中和體外精液及精子中存在[22]，且大鼠的SPAG11C 和SPAG11T有完全相同的RVKR結(jié)構(gòu)，由附睪上皮產(chǎn)生，釋放到管腔內(nèi)，所有釋放的SPAG11同分體在RVSK部位斷裂，并確定哪種同分體可以獲得有效的殺菌濃度[19]。SPAG11可以通過干擾細(xì)菌基本的代謝途徑，包括細(xì)菌的相關(guān)DNA、RNA和蛋白的合成起到殺菌作用[14]。在體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭笑?防御素和SPAG11基因表達(dá)可以由脂多糖刺激產(chǎn)生，同時(shí)受到TLR-介導(dǎo)的核因子κB（NF-κB） 活化和組蛋白甲基化、組蛋白乙?；虳NA的甲基化的表觀遺傳規(guī)則的調(diào)節(jié)[24,25]。SPAG11基因變異顯然是與男性生育表現(xiàn)密切相關(guān)的[26]。牛的SPAG11 基因變異對繁殖至關(guān)重要，已發(fā)現(xiàn)SPAG11C， E 和U的mRNA主要存在于成年雄牛的生殖管道[26]。SPAG11在精子成熟過程中起核心作用，特別是對精子的活動(dòng)力有重要的提升作用[27]。大鼠SPAG11C在30d左右開始表達(dá)，這發(fā)生在33～50d雄激素快速增長之前，表明SPAG11C可能輔助刺激青春前期的啟動(dòng)。SPAG11T在性成熟期雄性大鼠的附睪頭部密集表達(dá)，在60～90d的老年大鼠中，只表達(dá)在附睪的尾部，推知其與精子成熟密切相關(guān)[13]。而大鼠防御素BIN1B的研究[27]表明具有似防御素結(jié)構(gòu)的SPAG11同分體參與啟動(dòng)精子成熟，關(guān)于DEFB126的研究[28]則可解釋其在精子獲能中的相關(guān)作用?？傊鳛楦讲G上皮分泌蛋白之一的SPAG11各蛋白同分體參與精子成熟和生殖道的抗感染作用。

某抽水蓄能電站總裝機(jī)4×320 MW，其最高凈水頭502.7 m，輸水系統(tǒng)水平總長度2 449 m，其中中平洞襯砌后直徑為9.2 m，襯砌厚60 cm，靜水頭約300 m。中平洞存在長約40 m的V類圍巖洞段，該洞段發(fā)育有f24、f20和f80三條較大斷層。斷層均為全風(fēng)化構(gòu)造角礫巖，圍巖見高嶺土化，地下水多呈滲滴～線流狀，最大滲水量約5 L/min～6 L/min。斷層外圍巖裂隙發(fā)育，裂隙走向總體與斷層垂直。該洞段地質(zhì)平面展布圖見圖1。

在附睪中SPAG11C和SPAG11T的轉(zhuǎn)錄是通過去勢和雄激素替代實(shí)驗(yàn)的證明，SPAG11C和SPAG11T的轉(zhuǎn)錄是雄激素依賴的[19]。大鼠SPAG11基因的-779到+17的上游區(qū)域包含著可以與雄激素受體、NF-κB、核因子-1（NF-1）、EST和活化蛋白2結(jié)合的位點(diǎn)[6]。在脂多糖刺激時(shí)，雄激素受體和NF-κB位點(diǎn)是最重要的調(diào)節(jié)位點(diǎn)[6]。歐洲泌尿協(xié)會(huì)關(guān)于男性不育的指南指出，在患有精索靜脈曲張的大齡不育患者出現(xiàn)血清雄激素的顯著降低[29]。精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)后，可以抑制雄激素的加速降低，或也許暫時(shí)提高，對雄激素基線較低的患者，恢復(fù)明顯[30]。研究表明，青春期ELV模型大鼠在手術(shù)后6～18周出現(xiàn)血清和睪丸內(nèi)的雄激素水平降低[31-33]，在成年大鼠手術(shù)模型2周后即出現(xiàn)睪丸內(nèi)雄激素降低，血清水平不變[34]，但手術(shù)造成了StAR mRNA的表達(dá)水平降低，干擾雄激素的合成，導(dǎo)致睪丸內(nèi)的雄激素水平降低[35]，同時(shí)促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，損傷大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)分泌功能[35]，導(dǎo)致雄激素的分泌降低。而在手術(shù)矯正后，雄激素水平得到有效提高[36]。另外，精索靜脈曲張可以導(dǎo)致雄激素受體的表達(dá)降低，雄激素受體的mRNA未見變化，主要與轉(zhuǎn)錄后修飾有關(guān)，諸如mRNA的穩(wěn)定性，蛋白翻譯，翻譯后修飾（磷酸化，泛素/蛋白酶體系統(tǒng)），蛋白穩(wěn)定性[37]，精索靜脈曲張可以通過蛋白激酶C的一種錨定蛋白R(shí)ACK1的表達(dá)增加，導(dǎo)致雄激素受體的磷酸化[38-40]。

本研究采用qPCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)，明確SPAG11C和SPAG11T在附睪組織中的表達(dá)定位，說明它們在附睪組織中的表達(dá)具有細(xì)胞特異性和區(qū)段特異性，參與構(gòu)成精子成熟的附睪微環(huán)境。由于實(shí)驗(yàn)性左側(cè)精索靜脈曲張病理模型的成功建立，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上證明患側(cè)附睪組織中SPAG11C和SPAG11T的表達(dá)均發(fā)生變化。在ELV術(shù)后2周和4周時(shí)，左側(cè)附睪中兩蛋白的表達(dá)均較假手術(shù)組和同期右側(cè)組呈顯著性的降低，且ELV造模4周組較2周組表達(dá)下降更顯著。而ELV后右側(cè)及假手術(shù)組附睪兩蛋白的表達(dá)未發(fā)生明顯變化，保持正常水平。這樣的結(jié)果表明，精索靜脈曲張導(dǎo)致SPAG11C和SPAG11T表達(dá)的降低，其可能通過較早地持續(xù)地影響SPAG11蛋白的表達(dá)而改變病側(cè)附睪微環(huán)境，繼而導(dǎo)致男性不育或生育力降低。我們前期實(shí)驗(yàn)[41]也已證明精索靜脈曲張時(shí)干擾患側(cè)附睪雄激素受體表達(dá)下降，所以可以推測精索靜脈曲張可能通過下調(diào)雄激素受體的表達(dá)導(dǎo)致SPAG11C和SPAG11T表達(dá)降低，從而影響到生殖道的抗感染能力、精子成熟和精子活動(dòng)力，從而導(dǎo)致生育力降低，而雄激素受體和SPAG11家族蛋白的功能相關(guān)路徑需要進(jìn)一步研究，以證明精索靜脈曲張致男性生育力降低的具體機(jī)制。

致謝：本試驗(yàn)研究中SPAG11C/T多克隆抗體（兔抗鼠）由美國北卡羅萊納大學(xué)生物研究所的Susan H.Hall 副教授無私提供，特此表示衷心感謝。

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