汪 洋 馮楊焜 吳 巖 徐新宇 于得水 董 堅(jiān) 馮寧翰 包文平

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院泌尿外科（江蘇無錫 214002）；2.江蘇省錫山高級(jí)中學(xué)；3.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院泌尿外科

前列腺癌是威脅男性健康的重要疾病。在美國，前列腺癌已經(jīng)超越肺癌，成為男性發(fā)病率第一的腫瘤[1]。在中國，雖然前列腺癌的發(fā)病率遠(yuǎn)低于歐美地區(qū)，但是近年來發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)[2]。目前前列腺癌主要依賴人前列腺特異性抗原（PSA）進(jìn)行早期診斷[3,4]。然而前列腺癌早期癥狀不明顯，缺乏特異性體征，導(dǎo)致患者就診時(shí)往往已經(jīng)進(jìn)展至中晚期，只能進(jìn)行內(nèi)分泌保守治療，多數(shù)患者病情進(jìn)一步惡化，最終轉(zhuǎn)為激素非依賴性腫瘤[5]，發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而預(yù)后不佳，迄今仍無有效的治療方法。

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）是存在于腫瘤細(xì)胞系或腫瘤組織中的一小群特殊的細(xì)胞，具有自我更新、多向分化以及高致瘤性等特點(diǎn)[6]，而且對(duì)化療以及放療具有高度抵抗[7,8]，不易被常規(guī)治療手段所根除，被認(rèn)為是腫瘤形成的母細(xì)胞并能維持腫瘤不斷生長，是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。起初，學(xué)者們認(rèn)為CD44、CD133以及整合素α2β1可以作為分離前列腺癌的特異性標(biāo)記物[9]，隨后人們又發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2（ABCG2）陽性的細(xì)胞具有前列腺癌干細(xì)胞特征[10]，因此本研究通過流式細(xì)胞儀篩選出ABCG2陽性的PC-3 側(cè)群（SP）細(xì)胞，利用體外功能實(shí)驗(yàn)研究SP細(xì)胞與NST細(xì)胞在生物學(xué)特征上的差異，探索SP細(xì)胞在前列腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和與復(fù)發(fā)中扮演的角色。但是，由于其在總體腫瘤細(xì)胞中所占比例極低[10]，實(shí)驗(yàn)研究中極難獲得足夠數(shù)量的前列腺癌干細(xì)胞，因此，尋找到簡便而高效地富集前列腺癌干細(xì)胞的方法具有重要科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

（一）細(xì)胞

人前列腺癌PC-3細(xì)胞系，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

（二）試劑

胎牛血清（F B S）、表皮細(xì)胞生長因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、無血清添加劑B27均購自美國GIBCO公司。牛血清白蛋白（BSA）、胰島素、Hoechst 33342細(xì)胞核染料、PI染料、維拉帕米購自美國Sigma公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司。實(shí)時(shí)定量 PCR試劑盒購自日本Takara公司。Anti-α-Tubulin MAb、Anti-VEGF mAb、 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠以及羊抗兔 IgG抗體購自美國Santa Cruz 公司。Anti-MMP7 mAb和Anti-ABCG2 mAb抗體購自美國Abcam公司。Transwell小室購自Millipore公司。Matrigel購自加拿大BD Biosciences公司。血管生成載玻片購自德國Ibidi公司。CCK8試劑盒購自日本同仁公司。

（三）儀器

流式細(xì)胞儀購自加拿大BD Biosciences公司，由南京醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心提供。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）PC-3細(xì)胞系懸浮聚球培養(yǎng)法

選擇常規(guī)貼壁培養(yǎng)的，處于對(duì)數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞株，用PBS 緩沖液洗滌2遍，隨后利用含有0.2g/L EDTA的 胰蛋白酶對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化，重懸于SFM培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×103/mL，然后接種于超低黏附的6孔板中，每個(gè)孔接種1×103個(gè)細(xì)胞，以SFM 培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每天搖動(dòng)6孔板數(shù)次以阻止細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞增殖形成顯著團(tuán)塊后，收集于離心管中，待自然沉降30 min后小心棄去一半量的陳舊上清液，加入等量新鮮SFM 并緩慢機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液，再次重懸于SFM，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種細(xì)胞后每隔3d在倒置顯微鏡下觀察懸浮細(xì)胞球數(shù)目及形態(tài)。

（二）觀察PC-3 細(xì)胞兩種生長方式的轉(zhuǎn)化

當(dāng)PC-3 細(xì)胞在SFM 培養(yǎng)液中形成懸浮細(xì)胞球后， 收集并重懸于SSM 培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，待其呈單層細(xì)胞貼壁生長后，再次消化、收集并重懸于SFM培養(yǎng)液中，細(xì)胞可以再次形成懸浮細(xì)胞球。以上可重復(fù)多次。

（三）流式細(xì)胞學(xué)分選側(cè)群細(xì)胞

以PC-3懸浮成球細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)以含血清培養(yǎng)液（SSM）中單層貼壁培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞為對(duì)照組；分別將兩種細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL， 分別設(shè)實(shí)驗(yàn)管及對(duì)照管。實(shí)驗(yàn)管加入Hoechst 33342（終質(zhì)量濃度為5mg/L），對(duì)照管則先加入維拉帕米（終質(zhì)量濃度為50μmol/L）孵育30 min，然后再加入Hoechst 33342（終濃度為5mg/L），37 ℃避光孵育90min，期間每15min振蕩混勻1次，然后4℃低溫離心5min，棄上清液，4 ℃預(yù)冷，PBS緩沖液洗滌2遍， 重懸于含體積分?jǐn)?shù)為2% FBS 的PBS 中，加入PI 溶液（終質(zhì)量濃度為1mg/L），冰上孵育30min。采用FACS 流式細(xì)胞儀（激發(fā)光350nm，采集波長為450nm和675nm）檢測(cè)SP 細(xì)胞比率。

（四）Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP 細(xì)胞遷移能力

胰酶消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，用無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL。取細(xì)胞懸液100μL加入Transwell小室。在24孔板下室中加入600μL含20% 血清的完全培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12～24h，每隔6h收取24孔板中的Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30min，將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野觀察細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)，從而獲得兩種細(xì)胞的遷移情況。

（五）Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP 細(xì)胞侵襲能力

采用BD公司的Matrigel按照1:8稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃培養(yǎng)箱孵育30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。

胰酶消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗1～2遍，用無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL。取細(xì)胞懸液100μL加入Transwell小室。24孔板下室加入600μL含20% 血清的完全培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12～48h，每隔6h收取24孔板中的Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS緩沖液洗2遍，甲醇固定30min，將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS緩沖液洗3遍。400倍顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野觀察細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)，從而獲得兩種細(xì)胞的侵襲情況。

（六）分析SP 細(xì)胞促血管生成能力

實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4 ℃冰箱，使膠能過夜緩慢融化（同樣要準(zhǔn)備4 ℃預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）。開始實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。隨后取出血管生成載玻片。每孔中加入10 μL Matrigel后蓋上血管生成載玻片的蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱中，靜置30min左右，等待膠凝結(jié)。胰酶消化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），準(zhǔn)備密度為2×105/mL的細(xì)胞懸液，充分混勻。每孔加入50 μL的細(xì)胞懸液（即每孔種104個(gè)細(xì)胞）。放入37℃培養(yǎng)箱中孵育，每1h倒置顯微鏡下觀察微管形成情況并及時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行拍照，最后按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

公式中，“發(fā)芽細(xì)胞”表示單個(gè)細(xì)胞形態(tài)由圓形演變成帶尖角的細(xì)胞形態(tài)；“相連的細(xì)胞”指單個(gè)細(xì)胞相互接觸、呈串連接的細(xì)胞；“多角形”表示多個(gè)細(xì)胞相互連接圍成的多角形的管腔；分值“0”表示出現(xiàn)的多角形結(jié)構(gòu)的細(xì)胞只有 1 層；“1”表示出現(xiàn)的多角形結(jié)構(gòu)的細(xì)胞有 2～3 層；“3”表示出現(xiàn)的多角形結(jié)構(gòu)的細(xì)胞超過 4 層以上。

（七）CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP 細(xì)胞增殖能力

選擇對(duì)數(shù)期生長的單層貼壁生長的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后重懸于10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。調(diào)整細(xì)胞濃度，保證每孔100μL細(xì)胞懸液中含有2×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24h（37℃， 5% CO2的條件下）后，每24h檢測(cè)一塊培養(yǎng)板中細(xì)胞的增殖活性。向每孔加入10 mL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

（八）反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）

提取細(xì)胞總RNA后通過反轉(zhuǎn)錄體系獲取cDNA，經(jīng)過實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)測(cè)得最終的Ct值。

（九）Western blot實(shí)驗(yàn)

收集處于對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞，經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌后加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用預(yù)先配好的10% SDS-PAGE電泳凝膠，將提取的蛋白樣品按照每孔30 μL加入各泳道。電泳分離后進(jìn)行電轉(zhuǎn)，使得蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，結(jié)束后將PVDF膜放入體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶中室溫封閉1h，將膜按照不同蛋白分子量進(jìn)行裁剪，分別用1:1000稀釋的Anti-Tubulin mAb、Anti-VEGF mAb、Anti-MMP7 mAb、Anti-ABCG2 mAb抗體孵育4℃過夜。孵育后的膜放入TBS-T中洗滌3次，用5%脫脂牛奶分別制備HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體和羊抗兔抗體作為二抗，分別在室溫度孵育1h，結(jié)束后用TBS-T洗滌3次。最后利用化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)。

結(jié) 果

一、PC-3 懸浮細(xì)胞球形成

PC-3腫瘤 細(xì)胞系在無血清替代培養(yǎng)液SFM 中懸浮培養(yǎng)48 h 后可見少量體積較小、松散的懸浮細(xì)胞球，第7天開始觀察到典型的PC-3 懸浮細(xì)胞球，直徑＞60μm。此后細(xì)胞球逐漸增大、增多，第14天時(shí)懸浮細(xì)胞球數(shù)量較第7天時(shí)數(shù)量顯著增多（P＜0.05），且形態(tài)大小各異。隨著時(shí)間延長，細(xì)胞球數(shù)量和體積繼續(xù)增大（圖1）。而用SSM 培養(yǎng)的PC-3 細(xì)胞系，則在接種后2 h 左右開始貼壁，不產(chǎn)生懸浮細(xì)胞團(tuán)。

二、PC-3 懸浮球細(xì)胞在有無血清的條件下其生長方式可以出現(xiàn)交替轉(zhuǎn)換

將PC-3 懸浮細(xì)胞球吹散、重懸為單細(xì)胞懸液后接種于SSM 中，12 h 后可以于顯微鏡下觀察到PC-3 成球細(xì)胞沉于培養(yǎng)皿的底部并貼壁生長，且逐漸形成單細(xì)胞層， 形態(tài)上與常規(guī)培養(yǎng)的PC-3NST細(xì)胞無明顯差異。經(jīng)胰蛋白酶消化、 重懸為單細(xì)胞懸液后，重新培養(yǎng)于SFM中，7～9d細(xì)胞仍懸浮存活并聚集成球狀（圖2）。重復(fù)以上過程，相同現(xiàn)象可以完全復(fù)制出現(xiàn)， 而且這種轉(zhuǎn)換能力并不會(huì)隨著傳代而減弱。

圖1 第14天時(shí)懸浮細(xì)胞球數(shù)量較第7天時(shí)數(shù)量顯著增多

圖2 前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3在不同細(xì)胞培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長形態(tài)比較

三、PC-3 懸浮球細(xì)胞中富集了SP 細(xì)胞

FACS 雙波長分析顯示，PC-3 懸浮球細(xì)胞中SP細(xì)胞比率為（0.768±0.101）%（圖3A）， 且保持相對(duì)穩(wěn)定，而在PC-3 NST細(xì)胞中SP細(xì)胞比率為（0.035±0.023）%（圖3B）。兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

四、Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP細(xì)胞遷移能力

我們利用Transwel小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，觀察到在6h時(shí)NST細(xì)胞和SP細(xì)胞遷移到小室底部的細(xì)胞數(shù)，分別為（82±14）個(gè)細(xì)胞/視野 和（105±18）個(gè)細(xì)胞/視野；12h時(shí)分別為（134±21）個(gè)細(xì)胞/視野和（244±31）個(gè)細(xì)胞/視野。與NST細(xì)胞相比較，SP細(xì)胞在6h和12h遷移到小室底部的細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4），這提示我們SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力。

五、Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP細(xì)胞穿膜侵襲能力

我們又對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行了Transwel小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，與常規(guī)培養(yǎng)的NST細(xì)胞相比較，在8h時(shí)NST細(xì)胞和SP細(xì)胞穿過Matrigel 膠到達(dá)小室底部的細(xì)胞數(shù)分別為（68±5）個(gè)細(xì)胞/視野和（87±8）個(gè)細(xì)胞/視野；16h時(shí)分別為（120±22）個(gè)細(xì)胞/視野和（222±25）個(gè)細(xì)胞/視野。SP細(xì)胞在8h和16h穿過Matrigel膠到達(dá)小室底部的細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5），提示SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力。

圖3 PC-3 懸浮球細(xì)胞中SP細(xì)胞比率顯著高于單層貼壁細(xì)胞

圖4 利用Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)比較SP細(xì)胞與NST細(xì)胞之間遷移能力

圖5 利用Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)比較SP細(xì)胞與NST細(xì)胞之間細(xì)胞侵襲能力

六、利用HUVEC血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP細(xì)胞的促血管生成能力

我們于不同時(shí)間段拍攝兩組HUVEC細(xì)胞在血管生成載玻片中的血管生成情況，3h時(shí)NST細(xì)胞和SP細(xì)胞血管生成指數(shù)分別為（2.36±0.17）/視野和（2.92±0.2）/視野，6h時(shí)分別為（3.33±0.11）/視野和（4.86±0.12）/視野；與NST細(xì)胞相比，SP細(xì)胞促血管形成速度快，同時(shí)生成血管數(shù)目多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6），說明SP細(xì)胞的促HUVEC血管生成能力強(qiáng)于NST細(xì)胞。

圖6 利用血管生成實(shí)驗(yàn)觀察SP細(xì)胞與NST細(xì)胞促HUVEC細(xì)胞血管生成情況的差異

七、CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP細(xì)胞增殖能力

利用CCK8實(shí)驗(yàn)連續(xù)測(cè)量兩組細(xì)胞1d、2d、3d、4d、5d、6d的細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示（圖7），與NST細(xì)胞相比，SP細(xì)胞的增殖能力相對(duì)較弱。

八、利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SP細(xì)胞中相關(guān)關(guān)鍵基因表達(dá)情況

圖7 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP細(xì)胞與NST細(xì)胞之間增殖能力的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

我們利用RT-qPCR檢測(cè)SP細(xì)胞與NST細(xì)胞之間與血管生成相關(guān)的VEGF家族以及與遷移、侵襲關(guān)系密切的MMP家族基因和缺氧誘導(dǎo)因子HIF家族基因的表達(dá)水平，觀察兩組細(xì)胞之間各個(gè)基因表達(dá)水平差異情況。結(jié)果顯示，SP細(xì)胞中HIF2α、VEGFA、VEGFR2、VEGFD、MMP7、MMP10等基因的表達(dá)量明顯高于NST細(xì)胞，分別有2.47、2.34、2.75、6.69、1.62以及4.51倍左右的升高（圖8）。

九、利用Western blot檢測(cè)SP細(xì)胞中關(guān)鍵基因蛋白水平表達(dá)情況

根據(jù)RT-qPCR結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了SP細(xì)胞與NST細(xì)胞之間差異表達(dá)明顯的一組關(guān)鍵基因，我們進(jìn)一步利用Western blot分別檢測(cè)兩組細(xì)胞在VEGF、MMP7 和HIF2α蛋白水平上的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，SP細(xì)胞中以上關(guān)鍵基因在蛋白水平上的表達(dá)量也顯著高于NST細(xì)胞，分別有2.87、1.29以及2.85倍左右的升高（圖9A、圖9B、圖9C）。與RT-qPCR結(jié)果相符。此外，我們還對(duì)兩種細(xì)胞內(nèi)的ABCG2蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示SP細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá)水平顯著高于NST細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖9D）。

圖8 RT-qPCR檢測(cè)SP細(xì)胞與單層貼壁細(xì)胞之間關(guān)鍵基因的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

圖9 利用Western blot分別檢測(cè)兩組細(xì)胞間與細(xì)胞侵襲以及血管生成相關(guān)的蛋白表達(dá)水平

討 論

目前很多腫瘤干細(xì)胞并沒有明確的表面標(biāo)記物，這給篩選并分離出腫瘤干細(xì)胞提出了難題。Collins等[9]最早發(fā)現(xiàn)CD44、CD133以及整合素α2β1可以作為分離前列腺癌腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，然而隨后有文獻(xiàn)報(bào)道可以以CD44+/CD24-作為標(biāo)記物從DU145[11]以及LNCaP[12]細(xì)胞系中分選出具有多向分化潛能的細(xì)胞群。其他的標(biāo)記物類似乙醛脫氫酶（ALDH）[13-15]、轉(zhuǎn)錄因子Nanog[16-19]、OCT4[20]、Sox2[21]、CXCR4[22]、Sca-1[23,24]等也有報(bào)道可以作為前列腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物進(jìn)行應(yīng)用。學(xué)者們?cè)趯?duì)這些標(biāo)記物高表達(dá)的細(xì)胞群進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞也都具有干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能。然而，最近有研究表明[25]，作為前列腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物的CD133，當(dāng)表達(dá)陰性時(shí)依然擁有在小鼠內(nèi)成瘤的能力。利用免疫熒光染色技術(shù)分析DU145細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們表現(xiàn)為CD44+/CD24+/α2β1+，而不是之前發(fā)現(xiàn)的CD44+/CD24-[26]。這些結(jié)果與之前的發(fā)現(xiàn)相矛盾，說明根據(jù)特異性標(biāo)記物分選前列腺癌干細(xì)胞存在一定的困難，因此我們采用流式細(xì)胞儀側(cè)群分選的方法來分離得到側(cè)群細(xì)胞，通過研究前列腺癌側(cè)群細(xì)胞的生物學(xué)特征來探索前列腺癌干細(xì)胞。SP側(cè)群分選最初是Goodell等[27]提出，他們用Hoechst 33342細(xì)胞核染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式分選得出一部分染色較淡的細(xì)胞，稱為SP細(xì)胞。在后續(xù)的研究中，人們發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞也具有腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)特性，可以用來替代表面標(biāo)志物作為獲取腫瘤干細(xì)胞的新途徑，目前在膠質(zhì)瘤[28]、卵巢癌[29]和鼻咽癌[30]中SP細(xì)胞的存在和功能也得到了進(jìn)一步證實(shí)，因此人們認(rèn)為側(cè)群細(xì)胞可以作為腫瘤干細(xì)胞的一種進(jìn)行深入研究，而且相對(duì)于表面標(biāo)記物的復(fù)雜性，側(cè)群分選更加簡單易行。

腫瘤干細(xì)胞理論為前列腺癌發(fā)病機(jī)制和靶向治療的研究開辟了嶄新的方向，迅速成為研究熱點(diǎn)。但是由于腫瘤干細(xì)胞在總體細(xì)胞中所占的比例極為稀少，為進(jìn)一步深入研究設(shè)置障礙。因此，如何高效分離、富集和純化前列腺癌干細(xì)胞仍是目前學(xué)術(shù)界急待解決的難題。依靠表面特異性標(biāo)記物流式分選腫瘤干細(xì)胞，雖然一度被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但長期研究發(fā)現(xiàn)，此方法仍存在較多局限性。在本研究中，我們采用體外無血清懸浮聚球法對(duì)常規(guī)貼壁培養(yǎng)的人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3 細(xì)胞株進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并成功富集了具有前列腺癌干細(xì)胞特性的細(xì)胞群，方法簡便并且高效。置于SSM 和SFM 兩種培養(yǎng)液中交替培養(yǎng)后，我們發(fā)現(xiàn)PC-3 懸浮球細(xì)胞與NST細(xì)胞之間可以相互轉(zhuǎn)換，而且這種生長形式的相互轉(zhuǎn)換并不會(huì)隨著傳代而減弱，證明PC-3 懸浮球細(xì)胞具有自我更新、多向分化潛能和微環(huán)境依賴性，并且可以相對(duì)穩(wěn)定地遺傳。

同時(shí)，在本研究中，通過流式檢測(cè)技術(shù)得知PC-3 懸浮球細(xì)胞中SP 細(xì)胞比例顯著高于NST細(xì)胞中SP 細(xì)胞的比例，同樣證明通過懸浮聚球培養(yǎng)法可以從PC-3 細(xì)胞系中有效富集SP側(cè)群細(xì)胞。

除此之外，在本研究中，我們通過Transwel小室遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與NST細(xì)胞相比較，SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移以及侵襲能力。微管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SP細(xì)胞無論在促血管生成的速度以及HUVEC血管生成的數(shù)目上都顯著高于NST細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞生長周期受到調(diào)控，相對(duì)于腫瘤中其他癌細(xì)胞生長緩慢，這是為了維持其自身的穩(wěn)定性，只有當(dāng)腫瘤組織癌細(xì)胞減少時(shí)，腫瘤干細(xì)胞才會(huì)進(jìn)行分裂，分化為癌細(xì)胞，補(bǔ)充損失的部分。因此，本次研究中CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SP細(xì)胞的增殖能力相對(duì)較弱，也驗(yàn)證了這一假說，這也從另一方面證實(shí)SP細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞之間存在必然的關(guān)聯(lián)。

缺氧誘導(dǎo)因子在腫瘤的能量代謝、血管生成和轉(zhuǎn)移中起到重要作用，但是目前關(guān)于HIF2α的研究尚少。最新報(bào)道指出HIF2α在腎癌中參與CXCR4的擴(kuò)增[31]以及VEGFA的表達(dá)調(diào)控[32]，而CXCR4是目前報(bào)道的前列腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物之一，說明HIF2α也可能參與了前列腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物的調(diào)節(jié)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)[33]HIF2α參與CCL5/HIF2α/AR通路的信號(hào)調(diào)控，對(duì)前列腺癌干細(xì)胞的增殖和前列腺癌的轉(zhuǎn)移起到重要作用。VEGF是主要的血管生成因子，而VEGFR2作為VEGF受體，兩者結(jié)合后能夠促進(jìn)腫瘤血管生成，引起腫瘤的增殖和侵襲。同時(shí)VEGF可能與HIF2α相互作用，共同調(diào)節(jié)前列腺癌中血管生成，但兩者之間是直接作用還是間接作用還需要進(jìn)一步研究?；|(zhì)金屬蛋白酶MMP家族與腫瘤形成密不可分，有研究證實(shí)MMP參與腫瘤的遷移侵襲過程，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，侵蝕破壞基膜，使得腫瘤穿過并進(jìn)入血管，轉(zhuǎn)移至繼發(fā)部位，MMP7和MMP10作為MMP家族中的成員，也被發(fā)現(xiàn)與前列腺癌轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)[34]。本次研究我們利用RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分別對(duì)與遷移、侵襲和血管生成可能相關(guān)的基因在mRNA、蛋白水平上進(jìn)行檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞中HIF2α、VEGF、MMP表達(dá)量無論在mRNA水平還是蛋白水平上都明顯高于NST細(xì)胞，這與體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，進(jìn)一步在分子水平上證實(shí)了SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移、侵襲以及促微管形成能力。

利用側(cè)群分選的方法避免了篩選前列腺癌標(biāo)記物的困難，但是分離出的SP細(xì)胞是否與前列腺癌干細(xì)胞的所有特征相一致需要進(jìn)一步去驗(yàn)證。本課題只對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞系進(jìn)行了探討，其他的細(xì)胞系中如DU145、LNCaP等也需要進(jìn)行同樣的研究。

綜上所述，前列腺癌SP細(xì)胞雖然在前列腺癌組織中含量很低，但是其對(duì)前列腺癌難以治愈提供了一種解釋，SP細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的自我更新以及多向分化潛能，它的遷移、侵襲以及促血管生成能力可能是晚期腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在，而較弱的增殖能力與其分裂周期長相關(guān)，大部分時(shí)間SP細(xì)胞都處于靜息狀態(tài)，能夠避免被作用于細(xì)胞周期的抗腫瘤藥物殺傷，這有可能是目前前列腺癌對(duì)臨床藥物治療不敏感的重要原因之一。在這些現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，下一步我們將進(jìn)一步深入研究調(diào)控前列腺癌SP細(xì)胞表達(dá)的基因，通過升高或者降低目的基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑制前列腺癌SP細(xì)胞的作用，希望借此能夠?qū)ふ业揭粭l治療前列腺癌的有效方案。

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