陳 冰，楊繼華,2，曹俊明，黃燕華，孫育平，王國(guó)霞

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動(dòng)物育種與營(yíng)養(yǎng)公共試驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣州 510640；2.廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司，廣東湛江 524094)

桑樹(shù)在我國(guó)廣泛種植，種植面積約100萬(wàn)公頃，桑葉的年產(chǎn)量高達(dá)1 000萬(wàn)噸，其含有多種營(yíng)養(yǎng)成分和天然活性物質(zhì)。黃酮類化合物是桑葉的主要功能性成分之一，占桑葉干物質(zhì)的1%～3%[1]，具有抗腫瘤、降壓、降血糖、抗氧化、抗衰老等生理功能[2]。一些研究發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮化合物能顯著清除DPPH自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化作用[3-4]。據(jù)報(bào)道，植物黃酮，如葛根總黃酮、槐屬植物黃酮，可以改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能、抗氧化能力及肉品質(zhì)[5-6]。曲培濱[7]發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮對(duì)犢牛的生長(zhǎng)、屠宰性能及肉品質(zhì)的提高有良好的效果；李法見(jiàn)等[8]指出，桑葉對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能、脂質(zhì)代謝和肌肉品質(zhì)有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)室早期研究結(jié)果表明，飼料中添加桑葉黃酮能夠顯著提高吉富羅非魚(yú)血清和肝臟抗氧化指標(biāo)及抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力[9]。目前，有關(guān)桑葉黃酮對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物肌肉抗氧化作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。

羅非魚(yú)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要品種，隨著羅非魚(yú)集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，各種氧化應(yīng)激因素不斷增加，造成羅非魚(yú)的抗氧化能力和抗病力下降。并且，抗生素類化學(xué)藥物的不規(guī)范使用，嚴(yán)重影響肉品質(zhì)及食用安全性。因此，利用天然植物生物活性物質(zhì)提高魚(yú)體的抗氧化性能，減少抗生素藥物的使用，改善肌肉品質(zhì)和安全性，對(duì)羅非魚(yú)健康養(yǎng)殖具有重要意義。因此，本試驗(yàn)在前期關(guān)于生長(zhǎng)性能和抗氧化能力研究[9]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了在飼料中添加不同水平的桑葉黃酮對(duì)吉富羅非魚(yú)(GIFT,Oreochromisniloticus)肌肉抗氧化性能和營(yíng)養(yǎng)組成的影響,以便為桑葉黃酮在羅非魚(yú)飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)飼料

基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加桑葉黃酮0、50、100、300、500、1 000 mg/kg(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工所提供，純度77.9%)，配制6種試驗(yàn)飼料。配制飼料時(shí)，先將桑葉黃酮溶于水，再加入到各組飼料原料混合物中。各種原料經(jīng)粉碎后過(guò)60目篩，稱重后混勻，少量的成分采用逐級(jí)擴(kuò)大法混合，用SLX-80型雙螺桿擠壓機(jī)(華南理工大學(xué)科技實(shí)業(yè)總廠生產(chǎn))、G-500型造粒機(jī)(華南理工大學(xué)科技實(shí)業(yè)總廠生產(chǎn))制成粒徑為1.5 mm的顆粒飼料，55 ℃烘干，冷卻后放入密封袋中于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diet air-dry basis,%

注：1)每千克維生素預(yù)混料含有：VA 3 200 000 IU,VD31 600 000 IU,VE 16 g,VK 4 g,VB14 g,VB28 g,VB64.8 g,VB1216 mg,泛酸鈣16 g,葉酸1.28 g,生物素64 mg,煙酸 28 g,肌醇 40 g。
2)每千克礦物質(zhì)預(yù)混料含有：Mg 9 g,K 36 g,Met-Cu 1.5 g,Fe 10 g,Zn 8 g,Ca 230 g,Co 250 mg,Mn 1.9 g,I 32 mg,Se 50 mg。
3)營(yíng)養(yǎng)水平為實(shí)測(cè)值。

1.2 試驗(yàn)魚(yú)和飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)吉富羅非魚(yú)由廣東羅非魚(yú)良種場(chǎng)提供。在水泥暫養(yǎng)池馴養(yǎng)2周，期間投喂基礎(chǔ)飼料。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，選取健康、活潑、初始體重為(1.51±0.02)g的吉富羅非魚(yú)840尾，隨機(jī)分為6組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)35尾魚(yú)。飼養(yǎng)試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所水產(chǎn)研究室室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。系統(tǒng)由24個(gè)玻璃纖維桶和兩個(gè)過(guò)濾池等部分組成，纖維桶容積均為350 L(直徑90 cm，高80 cm，水體容積300 L)，養(yǎng)殖水源為經(jīng)過(guò)活性炭、珊瑚石過(guò)濾后的自來(lái)水，流水速率為1.5 L/min，養(yǎng)殖過(guò)程中不斷充氧曝氣，溶氧>7.0 mg/L，pH 7.5～8.0，氨氮≤0.10 mg/L，亞硝酸鹽≤0.01 mg/L，水溫25～31 ℃。每天分別在8∶30和18∶00投喂1次，飽食投喂。試驗(yàn)時(shí)間為2015年8月29日—2015年10月23日，共56 d。

1.3 樣本采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，魚(yú)體饑餓24 h，每個(gè)重復(fù)取16尾魚(yú)，冰盤(pán)上解剖取其背肌，其中6尾用于測(cè)定抗氧化指標(biāo)，4尾用于測(cè)定滴水損失、肌肉膠原蛋白，6尾用于測(cè)定肌肉常規(guī)成分和氨基酸組成，樣品混合后于-80 ℃冰箱保存。

肌肉上清液制備：稱取一定質(zhì)量的肌肉樣品，加9倍體積的0.80%預(yù)冷生理鹽水，在冰水浴中進(jìn)行勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，于-20 ℃冰箱保存，用于測(cè)定肝臟抗氧化指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 抗氧化指標(biāo)

肌肉上清液用試劑盒進(jìn)行抗氧化指標(biāo)測(cè)定，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，具體測(cè)定方法參照試劑盒所附說(shuō)明書(shū)。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用羥胺法測(cè)定，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性采用比色法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用可見(jiàn)光法測(cè)定，總抗氧化能力(T-AOC)采用比色法測(cè)定，丙二醛(MDA)含量采用2-硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定。

1.4.2 營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)

肌肉常規(guī)成分測(cè)定：粗蛋白含量采用凱氏定氮法(GB/T6432-1994)、粗脂肪含量采用乙醚抽提法(GB/T6433-1994)、粗灰分含量采用550 ℃灼燒法(GB/T6438-1992)、水分含量采用冷凍干燥法(GB/T6435-1986)。

肌肉中膠原蛋白(羥脯氨酸)含量：羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中比例極少，其它蛋白中不存在。羥脯氨酸在氧化劑作用下產(chǎn)生的氧化物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，根據(jù)其深淺可以推算出其含量。具體方法見(jiàn)南京建成生物工程研究所羥脯氨酸測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)。

肌肉氨基酸：魚(yú)的背肌冷凍干燥(德國(guó) CHRIST 公司)后粉碎。采用6 mol/LHCl水解法，用安捷倫液相色譜儀(Agilent Technologies 1260 Infinity)衍生法測(cè)定。分析柱：安捷倫ZORBAX氨基酸分析柱，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm,柱溫：38 ℃，流速：1 mL/min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD,n=4)表示。采用 SPSS20統(tǒng)計(jì)軟件中 One-wayANOVA方差分析和 Duncan，s 均值多重比較法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性進(jìn)行分析處理，P<0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 6組吉富羅非魚(yú)肌肉的抗氧化指標(biāo)

各組吉富羅非魚(yú)肌肉SOD、GSH-Px、CAT活性、T-AOC及MDA含量見(jiàn)表2。100、300 mg/kg組肌肉SOD活性顯著高于其他組。肌肉GSH-Px、CAT活性各組間差異不顯著。500 mg/kg組肌肉T-AOC顯著高于對(duì)照組和1 000 mg/kg組，與其他組差異不顯著。肌肉MDA含量以50 mg/kg組最低，顯著低于對(duì)照組，但與其他組間差異不顯著。

表2 桑葉黃酮對(duì)吉富羅非魚(yú)肌肉中抗氧化指標(biāo)的影響Tab.2 Effects of mulberry leaf flavonoids on antioxidant indices in muscle of O.niloticus

注：表中同行數(shù)據(jù)后上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，同行數(shù)據(jù)后未標(biāo)注字母表示無(wú)顯著差異(P>0.05)。下同。

2.2 6組吉富羅非魚(yú)肌肉的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分

如表3所示，吉富羅非魚(yú)肌肉的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和水分含量組間差異不顯著，其中50～500 mg/kg組粗蛋白含量高于對(duì)照組。添加組粗脂肪含量均高于對(duì)照組，但沒(méi)有顯著差異。

表3 桑葉黃酮對(duì)吉富羅非魚(yú)肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響Tab.3 Effects of mulberry leaf flavonoids on nutrients composition in muscle of O.niloticus %,wet matter

2.3 6組吉富羅非魚(yú)肌肉的膠原蛋白含量

如表4所示，500 mg/kg組的膠原蛋白最高，顯著高于其他組，其他添加組膠原蛋白含量均比對(duì)照組高，但差異不顯著。

表4 桑葉黃酮對(duì)吉富羅非魚(yú)肌肉膠原蛋白含量的影響(濕重)Tab.4 Effects of mulberry leaf flavonoids on collagen contents of O.niloticus(wet matter)

2.4 6組吉富羅非魚(yú)肌肉的氨基酸組成

由表5可知。50 mg/kg組肌肉所檢測(cè)的賴氨酸含量顯著高于對(duì)照組。100 mg/kg組肌肉丙氨酸含量顯著高于對(duì)照組。300 mg/kg組肌肉亮氨酸、蛋氨酸和谷氨酸含量顯著高于對(duì)照組。500 mg/kg組所檢測(cè)的15種肌肉氨基酸含量與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。1 000 mg/kg組肌肉組氨酸含量顯著高于對(duì)照組。添加組的必需氨基酸總量均高于對(duì)照組，但差異不顯著。100～1 000 mg/kg組風(fēng)味氨基酸含量高于對(duì)照組，但差異不顯著。

表5 桑葉黃酮對(duì)吉富羅非魚(yú)肌肉氨基酸組成的影響Tab.5 Effects of mulberry leaf flavonoids on muscle amino acids composition of O.niloticus %,dry matter

注：色氨酸未檢測(cè)。標(biāo)注*為風(fēng)味氨基酸.

3 討論

3.1 桑葉黃酮對(duì)吉富羅非魚(yú)肌肉抗氧化指標(biāo)的影響

活性氧(ROS)是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖調(diào)控的胞內(nèi)信使，而過(guò)多的活性氧會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起組織細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化[10-11]。活性氧在屠宰后的肌肉繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)氧化物質(zhì)而影響肉質(zhì)。有研究表明，可通過(guò)在飼料中添加抗氧化劑以增強(qiáng)肌肉抗氧化能力，因屠宰后肌肉SOD活性越高、MDA含量越低的肌肉，其系水力越高、肉色越好，即肉質(zhì)較好[12-13]。在魚(yú)飼料中添加適量抗氧化劑(VE)能抑制肌肉中脂肪的過(guò)氧化，降低肌肉MDA含量，改善肌肉品質(zhì)[14]。本試驗(yàn)中，桑葉黃酮能顯著提高肌肉SOD活性、T-AOC，降低MDA含量。這與本實(shí)驗(yàn)室前期研究中桑葉黃酮顯著提高羅非魚(yú)血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的結(jié)果類似[9]。這表明桑葉黃酮能夠提高羅非魚(yú)的抗氧化性能，改善肌肉品質(zhì)。宋瓊莉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，桑葉粉能顯著提高肌肉中SOD的活性，降低肌肉中MDA的含量，有效提高肌肉的抗氧化能力。根據(jù)以上研究結(jié)果推測(cè)，桑葉黃酮可能是存在桑葉中提高肌肉抗氧化能力的活性物質(zhì)之一。

3.2 桑葉黃酮對(duì)吉富羅非魚(yú)營(yíng)養(yǎng)組成的影響

魚(yú)類的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與肌肉粗蛋白含量密切相關(guān)，肌肉粗脂肪含量也會(huì)影響肌肉嫩度[16]。魚(yú)類肌肉的營(yíng)養(yǎng)成分主要受基因的影響，也受生長(zhǎng)環(huán)境、養(yǎng)殖方式、生長(zhǎng)階段等因素影響。人工養(yǎng)殖條件下的水產(chǎn)動(dòng)物肉品質(zhì)很大程度上由飼料的質(zhì)量決定，飼料的營(yíng)養(yǎng)水平會(huì)影響?zhàn)B殖水產(chǎn)動(dòng)物肌肉蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸和一些風(fēng)味物質(zhì)的含量[17]。本試驗(yàn)中，桑葉黃酮提高了吉富羅非魚(yú)肌肉粗蛋白含量，但影響不顯著，對(duì)粗脂肪含量也沒(méi)有顯著影響。有研究表明，一些黃酮類化合物可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)激素生成和釋放[18],從而加快細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，減少蛋白質(zhì)的降解[19]。這表明桑葉黃酮中可能含有能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)激素生成和釋放黃酮類化合物。有研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿黃酮對(duì)崇仁麻雞母雛胸肌和腿肌的蛋白質(zhì)含量沒(méi)有影響，但降低了腿肌脂肪的沉積[20]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這一報(bào)道有不一致的地方，究其原因可能是桑葉黃酮種類多樣、結(jié)構(gòu)豐富，禽類動(dòng)物與水產(chǎn)動(dòng)物生物學(xué)特性不同導(dǎo)致。

魚(yú)類肌肉中的膠原蛋白具有保持魚(yú)類肌肉完整性和韌性的作用，在一定程度上決定了肌肉的系水力和嫩度，在肌肉結(jié)構(gòu)和品質(zhì)等方面有重要作用[21]，羅非魚(yú)、草魚(yú)攝食蠶豆后肌肉膠原蛋白含量顯著提高，失水率降低，魚(yú)肉品質(zhì)得到改善[16]。本實(shí)驗(yàn)中，500 mg/kg桑葉黃酮添加組的羅非魚(yú)肌肉膠原蛋白含量較對(duì)照組顯著增加。其作用機(jī)制可能是黃酮類化合物可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)激素生成和釋放[18]，而生長(zhǎng)激素能提高肌肉、皮膚等組織中膠原蛋白含量[22-23]。這有待進(jìn)一步研究證明。

肌肉蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和質(zhì)量取決于蛋白質(zhì)的氨基酸組成和消化率等因素[24]。氨基酸組成和含量是肌肉品質(zhì)研究的關(guān)鍵指標(biāo)之一，肉的鮮味在一定程度上與一些游離的風(fēng)味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸)的含量有關(guān)，其中天冬氨酸和谷氨酸是呈鮮味的氨基酸，甘氨酸和丙氨酸是呈甘味的氨基酸。游離氨基酸不僅本身能夠呈現(xiàn)出一定的味道，且在肌肉熱加工過(guò)程中，游離氨基酸會(huì)與糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生大量的不同氣味的物質(zhì)，這些物質(zhì)決定了魚(yú)肉多樣性的風(fēng)味[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，肌肉營(yíng)養(yǎng)成分與飼料組成密切相關(guān)，桑葉能夠提高肉羊肌肉呈味氨基酸含量的水平[27]。在肉羊日糧中添加沙蔥黃酮后，羊肉總氨基酸和必需氨基酸的含量上升，天冬氨酸和谷氨酸含量均髙于對(duì)照組，說(shuō)明沙蔥黃酮可以提高肉的鮮味[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加桑葉黃酮提高了肌肉丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和谷氨酸含量。本實(shí)驗(yàn)室先前研究結(jié)果顯示，適量的桑葉黃酮能提高羅非魚(yú)的增重[9]。由此可知，桑葉黃酮在促進(jìn)羅非魚(yú)生長(zhǎng)同時(shí)也能改善肌肉氨基酸組成。肌肉中風(fēng)味氨基酸和必需氨基酸的含量一定程度上能提高肌肉風(fēng)味和品質(zhì)。桑葉黃酮對(duì)羅非魚(yú)肌肉風(fēng)味氨基酸含量及必需氨基酸含量有一定提高作用，但不明顯。而其他植物來(lái)源的黃酮可以顯著提高動(dòng)物肌肉必需氨基酸和風(fēng)味氨基酸。黃酮類化合物在不同類型動(dòng)物體內(nèi)作用的機(jī)制不同可能導(dǎo)致了這一現(xiàn)象的出現(xiàn)。

4 結(jié)論

添加適量的桑葉黃酮能夠提高吉富羅非魚(yú)肌肉抗氧化能力、膠原蛋白含量，改善肌肉營(yíng)養(yǎng)組成。綜合肌肉抗氧化性能、膠原蛋白含量和氨基酸組成的指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)，桑葉黃酮添加水平在300～500 mg/kg時(shí)效果較好。

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