張永剛，欒林林，任 海，葛慕湘，靳曉敏，葉仕根

(1.大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023；2.河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北昌黎 066600)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，特別是高密度養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病時(shí)有爆發(fā)，為魚(yú)類(lèi)疾病防治提出了新的問(wèn)題[1]。哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是一種革蘭氏陰性發(fā)光細(xì)菌，廣泛存在于海洋環(huán)境與水產(chǎn)動(dòng)物的體內(nèi)外[2]，是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的重要致病菌。該菌可感染魚(yú)、蝦和貝類(lèi)等重要水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物[3]，在澳大利亞、厄瓜多爾及中國(guó)等國(guó)家均有發(fā)生[4-6]，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

中草藥不僅具有綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生耐藥性及性能多樣化的優(yōu)點(diǎn)，還具有預(yù)防疾病發(fā)生和提高非特異性免疫力等功效[7]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，中草藥使用廣泛，對(duì)細(xì)菌性、病毒性、寄生蟲(chóng)性疾病都有相應(yīng)的配方并具有良好的效果[8-9]。因此，應(yīng)用中草藥防治魚(yú)病越來(lái)越受到人們的關(guān)注。本試驗(yàn)選取石榴皮、五倍子和大黃等18種常見(jiàn)中草藥開(kāi)展了哈維氏弧菌的體外抑菌作用，從中篩選出對(duì)哈維氏弧菌有較好抑制作用的中草藥，旨在為該菌引起的爆發(fā)性魚(yú)病的防治工作提供依據(jù)，并為開(kāi)發(fā)中草藥應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的疾病防控提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗(yàn)用菌(編號(hào)：HQ150310-1)由河北科技師范學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，分離自患病大菱鲆的肝臟，經(jīng)回歸感染試驗(yàn)確認(rèn)為其致病菌，經(jīng)形態(tài)特征、理化特性及16S rRNA基因序列測(cè)定鑒定為哈維氏弧菌，菌株于-80 ℃甘油中保藏。將該菌轉(zhuǎn)接于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h ，再用肉湯培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h后用無(wú)菌生理鹽水稀釋至1.5×108CFU/mL菌懸液備用。

1.1.2 試驗(yàn)用藥

用于實(shí)驗(yàn)的中草藥:五倍子(Rhuschinensis)、大黃(Rheumpalmatum)、魚(yú)腥草(Houttuyniacordata)、石榴皮(Pericarpiumgranati)、穿心蓮(Andrographispaniculata)、烏梅(Darkplumfruit)、沙棘(Hippophaerhamnoides)、公丁香(Syzygiumaromaticum)、辣蓼(Persicariahydropiper)、甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、陳皮(Pericarpiumcitrireticulate)、薄荷(MenthahaplocalyxBriq)、黃柏(Phellodendronchinense)、桉樹(shù)葉(Eucalyptusrobusta)、黃連(Coptischinensis)、石菖蒲(Acorustatarinowii)、馬齒莧(Portulacaoleracea)、蘇木(Caesalpiniasappan)。這18種中草藥均購(gòu)自安國(guó)市神禾中藥材飲片有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂(批號(hào)為140811)、肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)為CM106)，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 中草藥原液的制備

18種中草藥各取100 g，各加入500 mL 的蒸餾水浸泡1 h，加熱煮沸60 min，藥汁經(jīng)4層紗過(guò)濾后倒出藥液，將藥渣再各加入500 mL 的蒸餾水，加熱煮沸60 min，過(guò)濾后倒出藥液，將兩次藥液合并蒸發(fā)濃縮到100 mL 即制成藥物濃度為1 g/mL的中草藥原液。經(jīng)過(guò)高壓滅菌121 ℃15 min后，將無(wú)菌藥液置于冰箱中冷藏備用[10]。

1.2.2 藥敏紙片的制備

用打孔器將定量濾紙片制成直徑為6 mm的濾紙圓片，裝入直徑60 mm的平皿中，120 ℃干熱滅菌2 h后備用。將制備好的稀釋藥液注入有紙片的滅菌培養(yǎng)皿中(每個(gè)紙片的飽和吸水量按0.01 mL計(jì))，并翻動(dòng)紙片使各紙片充分浸透藥液，浸泡5～10 min后用無(wú)菌鑷子將紙片上的藥液在平皿上瀝干，平攤于無(wú)菌平皿內(nèi)，置37 ℃恒溫箱內(nèi)烘干約2 h，分別裝入青霉素小瓶?jī)?nèi)，同時(shí)在瓶上貼藥名標(biāo)簽，置于4 ℃冰箱內(nèi)備用[11]。

1.2.3 紙片法藥敏試驗(yàn)

用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，將含藥紙片均勻貼于瓊脂表面，每個(gè)培養(yǎng)皿貼6片，之后28 ℃培養(yǎng)24 h，用直尺測(cè)量抑菌圈直徑,每孔取不同方向測(cè)量4次，取其平均值，每種藥物3個(gè)平行。抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，直徑在15～20 mm之間為高敏；直徑在10～15 mm之間為中敏；直徑小于10 mm為低敏[12-13]。

1.2.4 最小抑菌濃度測(cè)定

最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥液最小濃度。采用二倍稀釋法測(cè)定這18種中草藥的藥物的最小抑菌濃度(MIC) 。將每種中草藥作為一組，一組13 個(gè)無(wú)菌試管，貼上標(biāo)簽，在無(wú)菌條件下配制13 組中草藥原液濃度梯度。用無(wú)菌微量移液器吸取50 μL菌液接種到各濃度梯度的試管中，每種藥物做3個(gè)平行。接種后將試管置于28 ℃恒溫振蕩器上振蕩培養(yǎng)24 h 后觀察，用無(wú)菌棉簽將每個(gè)不同濃度梯度的藥液接種于普通培養(yǎng)基上，每種藥物3個(gè)重復(fù)，置于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。肉眼觀察，藥物最低濃度無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為該藥的MIC[12]。同時(shí)設(shè)置不添加藥液的空白管作為對(duì)照。

1.2.5 最小殺菌濃度的測(cè)定

將各種藥物的MIC 和高于MIC 濃度的試管中，吸取0.1 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于牛肉膏瓊脂斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d 后觀察有無(wú)菌落形成，無(wú)菌落形成的相應(yīng)試管中的藥物濃度即為該種藥物對(duì)該菌株的最小殺菌濃度(MBC)[11]。

2 結(jié)果

2.1 18 種中草藥對(duì)哈維氏弧菌的抑菌效果

由所得的結(jié)果(表1)可見(jiàn)，在同種濃度下，蘇木、大黃、五倍子、烏梅、石榴皮五種中草藥對(duì)哈維氏弧菌的抑菌作用最明顯，藥效持久，為理想的抑制該菌藥物；黃連、馬齒莧、桉樹(shù)葉的抑菌作用明顯；公丁香、魚(yú)腥草、穿心蓮的抑菌效果中等，沙棘、黃柏、辣蓼、甘草、薄荷這5 種藥物抑菌直徑小，抑菌效果不明顯；而陳皮、石菖蒲則無(wú)抑菌現(xiàn)象出現(xiàn)。

表1 18種中草藥對(duì)哈維氏弧菌的抑菌效果Tab.1 Inhibitory effect of 18 kinds of Chinese herbal medicines to V.harveryi

2.2 中草藥對(duì)哈維氏弧菌的殺菌濃度

由表2 可見(jiàn)：蘇木、大黃、五倍子、烏梅、石榴皮的MIC 均<12.5 mg/mL ，從而得知蘇木、大黃、五倍子、烏梅、石榴皮的抑菌作用非常明顯。由表2和表3 可見(jiàn)，藥品最小殺菌濃度(MBC) 均> 最小抑菌濃度(MIC) ，在五倍子等18種中草藥中五倍子、石榴皮、蘇木在50 mg/mL 均表現(xiàn)出殺菌作用，大黃、烏梅在100 mg/mL 時(shí)表現(xiàn)出殺菌作用，黃連、馬齒莧、桉樹(shù)葉、公丁香、魚(yú)腥草、穿心蓮在25 mg/mL 時(shí)表現(xiàn)出殺菌作用，沙棘、黃柏、辣蓼、甘草、薄荷在500 mg/mL 時(shí)才表現(xiàn)出殺菌作用，其余藥物在500 mg/mL 沒(méi)有殺菌現(xiàn)象?？梢?jiàn)，五倍子、大黃、 石榴皮、蘇木、烏梅是較好用于防治哈維氏弧菌引起的疾病的中草藥。

表2 18種中草藥對(duì)哈維氏弧菌的抑菌濃度Tab.2 The inhibitory concentration of 18 kinds of Chinese herbs on V.harveryi

注：“3”表示高度渾濁，“2”表示中度渾濁，“1”表示有菌生長(zhǎng)，“0”無(wú)菌生長(zhǎng)

表3 18種中草藥對(duì)哈維氏弧菌的殺菌濃度Tab.3 Bactericidal concentration of 18 kinds of Chinese herbal medicines of V.harveryi

注：“+ ”表示有菌生長(zhǎng)，“-”表示無(wú)菌生長(zhǎng)

3 討論

3.1 中草藥的抑菌效果

水產(chǎn)動(dòng)物疾病大多采用抗生素類(lèi)化學(xué)藥物控制,但存在不易降解、易在養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)富集和污染環(huán)境等問(wèn)題,長(zhǎng)期的使用還可能會(huì)導(dǎo)致許多魚(yú)類(lèi)病原細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性甚至多重耐藥性[12]。中草藥因其綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生耐藥性而受到關(guān)注。本試驗(yàn)挑選18種常用中草藥,以患病大菱鲆分離得到的哈維氏弧菌為試驗(yàn)菌,進(jìn)行抑菌藥物的篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明，中草藥水煎液對(duì)哈維氏弧菌的體外抑菌效果明顯，其中蘇木、大黃、五倍子、石榴皮、烏梅的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑均在20 mm以上，MIC為12.5～25 mg/mL，MBC分別為50～100 mg/mL。金珊等[14]研究了15種中草藥對(duì)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的鱸皮膚潰瘍病病原哈氏弧菌的抑菌效果發(fā)現(xiàn)15種中草藥均有一定抑菌作用，其中石榴皮、地榆、五味子抑菌效果最好，最小抑菌濃度分別為1∶640、1∶320、1∶320；梁利國(guó)等[15]用4種常用中草藥對(duì)病原弧菌(鰻弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、河口弧菌)體外抗菌效果作出了研究，其中蘇木、五倍子、地錦草、石榴皮4種中草藥具有較好的抑菌和殺菌作用，MIC和MBC分別為1.56～3.12 mg/mL和3.12～6.25 mg/mL。本試驗(yàn)抑菌效果較強(qiáng)藥物與其相類(lèi)似，但抑菌濃度卻是其10倍以上，可能是不同菌種間對(duì)藥物的敏感性有差異，這點(diǎn)從梁利國(guó)等[15]對(duì)四種弧菌的測(cè)定結(jié)果也有所證實(shí)；也可能由于試驗(yàn)方法、藥液的熬制方法不同，造成結(jié)果有所差異。關(guān)于中草藥原液的制備、藥敏紙片的制備目前尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)方法，試驗(yàn)方法尚處于摸索階段，所以在不同文獻(xiàn)中病原菌對(duì)同一種中草藥的敏感性存在差異。標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)方法還有待于進(jìn)一步規(guī)范。

3.2 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果在生產(chǎn)應(yīng)用中的局限性

目前，用中草藥防治水產(chǎn)動(dòng)物病害是一個(gè)研究熱點(diǎn)，但在實(shí)驗(yàn)室得出的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)時(shí)，效果并不一定十分理想。其原因是體外抗菌效果往往與體內(nèi)效果并不完全一致，中草藥的不同來(lái)源及其提取方法等都會(huì)對(duì)藥效產(chǎn)生影響。另外，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，除了考慮藥物的高效外，還應(yīng)考慮魚(yú)體對(duì)該藥物的耐受能力。正確用藥濃度范圍應(yīng)是既能有效抑制病原菌生長(zhǎng)又不至于超過(guò)魚(yú)體對(duì)該藥物的耐受力范圍。從結(jié)果來(lái)看，蘇木、大黃、五倍子、烏梅、石榴皮抑菌圈直徑最大(≥20 cm)，抑菌和殺菌效果較強(qiáng)。但本試驗(yàn)只進(jìn)行了中草藥的體外抗菌試驗(yàn)，其結(jié)果可作為防治哈維氏弧菌感染的依據(jù)，在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

當(dāng)今社會(huì)正在向著環(huán)保、健康、自然的方向發(fā)展，水產(chǎn)業(yè)也不例外。中草藥被作為“綠色藥品”日益廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖[16-18]。我們相信，隨著中醫(yī)理論與現(xiàn)代高科技的有效結(jié)合，中草藥在水產(chǎn)中的應(yīng)用必將再上一個(gè)新臺(tái)階，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)效益。

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