陳子桂，王培培，覃俊奇，廖 愚，袁宗偉，曹壽雄

(廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)引育種中心，南寧 530031)

鯉(Cyprinuscarpio)屬鯉形目鯉科鯉屬，鯉是廣西水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要產(chǎn)業(yè)。上個(gè)世紀(jì)90年代，廣西引進(jìn)建鯉品種，由于經(jīng)過廣西當(dāng)?shù)囟啻酿B(yǎng)殖，一些繁育場(chǎng)忽略保種，沒有進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x育或提純復(fù)壯，加上近年來受生態(tài)破壞、水質(zhì)污染等因素影響，鯉種群的種質(zhì)資源嚴(yán)重受損，遺傳多樣性喪失，種質(zhì)嚴(yán)重退化，表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度慢，抗逆抗病性差，性成熟過早等經(jīng)濟(jì)性狀退化[1-3]。因此，進(jìn)一步了解廣西封閉水體鯉遺傳結(jié)構(gòu)，合理開發(fā)利用和保護(hù)廣西鯉種質(zhì)資源，對(duì)建鯉的繼續(xù)選育和種質(zhì)提純工作具有十分重要的意義。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記(SSR)因共顯性具有遺傳、可重復(fù)性好、高度多態(tài)性的特點(diǎn)，在魚類種質(zhì)分析中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。Reid等[4]利用SSR分析了虹鱒群體的遺傳多樣性，Wang等[5]對(duì)亞州海鱸進(jìn)行全同胞子代種質(zhì)鑒定，確定QTL的數(shù)量和位置，確定負(fù)責(zé)生長(zhǎng)相關(guān)性狀的個(gè)體基因，魯翠云等[6]利用SSR技術(shù)進(jìn)行鏡鯉家系構(gòu)建，進(jìn)一步避免了家系間的近交，孫效文等[7]對(duì)鏡鯉的遺傳結(jié)構(gòu)分析并確定了與性狀相關(guān)的等位基因，邢新梅等[8]對(duì)鏡鯉的體形性狀的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，其它研究人員對(duì)鯉遺傳結(jié)構(gòu)也做了諸多研究[9-14]。

該研究利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)相對(duì)封閉水域的廣西本地野生鯉和引進(jìn)廣西多年的建鯉進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析研究，以期把廣西本地野生鯉和當(dāng)?shù)亟巸?yōu)良性狀聚合，為合理開發(fā)利用廣西野生鯉種質(zhì)資源和對(duì)建鯉的繼續(xù)選育提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

該研究所用的試驗(yàn)材料由廣西水產(chǎn)引育種中心2015年從廣西天等縣較封閉的水域收集的本地野生鯉群體和2004年從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心引進(jìn)的并經(jīng)過第三代群體選育的建鯉，實(shí)驗(yàn)材料于2016年2月分別從以上兩個(gè)群體進(jìn)行采樣，每個(gè)群體取30尾魚作為樣本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)選取廣西本地鯉 (H1號(hào))和建鯉(H2號(hào))各30尾魚，抽取尾部靜脈血樣30 μL/尾，置于1 mL的EP管加入ACD抗凝溶液搖勻，血液基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，純化后的DNA保存液用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定完整性，稀釋至50 ng/μL備用。微衛(wèi)星引物為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所開發(fā)的鏡鯉微衛(wèi)星標(biāo)記的引物，詳見表1。(2)使用TAKARA Mighty Amp?DNA Polymerase Ver.2 (R071Q)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：25 μL 2×Mighty Amp Buffer Ver.2、1 μL PrimerF 10 μmol/L、1μL Primer R 10 μmol/L、1 μL Mighty Amp、DNA Polymerase、1 μL DNA、21 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，硝酸銀染色，用混合顯色液顯色，系統(tǒng)成像儀拍照。(4)根據(jù)50 bp DNA Step ladder分子標(biāo)記的清晰條帶和鯉PCR擴(kuò)增片段大小,分析各位點(diǎn)的等位基因。

1.3 數(shù)據(jù)處理

由群體遺傳學(xué)分析軟件Popgene 1.32分析數(shù)據(jù)，分析計(jì)算等位基因數(shù)(A)，有效等位基因數(shù)(Ne)，期望雜合度(He)，平均多態(tài)信息含量(PIC)等信息，用populations計(jì)算群體間遺傳距離(genetic distanceD)。

表1 10對(duì)引物的序列和退火溫度Tab.1 Sequences and annealing temperatures of 10 pairs of primers

2 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中10對(duì)微衛(wèi)星的電泳圖全部顯示出了清晰的條帶，從表2分析表明，10個(gè)位點(diǎn)均檢測(cè)出了等位基因，有效等位基因在1.167 5～1.520 3，平均為1.360 2；等位基因控制著數(shù)量性狀，數(shù)量多少?zèng)Q定遺傳多態(tài)性高低，等位基因的豐度越高，群體的生產(chǎn)性狀越具有多樣性，因而能更多適應(yīng)生態(tài)自然環(huán)境的自然選擇。觀測(cè)雜合度在0.397～0.762之間，平均為0.562 6，期望雜合度0.301～0.629之間，平均0.463 3，說明它們的遺傳變異度高，遺傳多樣性豐富，多態(tài)性信息含量(PIC)在0.289 7～0.685 0之間，平均多態(tài)信息含量0.438 8，為中度多態(tài)性。表明建鯉在廣西經(jīng)多年人工群選，由于經(jīng)過一定的人為選擇性，建鯉群體的雜合度比廣西本地野生鯉群體降低了，建鯉的遺傳多樣性數(shù)值低于廣西本地鯉，建鯉經(jīng)過廣西本地多年的適應(yīng)性養(yǎng)殖，其性狀趨于穩(wěn)定，遺傳多樣性降低，可進(jìn)一步選育的空間有所下降。

表2 微衛(wèi)星各位點(diǎn)及兩個(gè)群體的遺傳參數(shù)Tab.2 Microsatellite loci and genetic parameters of two populations

注：A為平均等位基因；Ne為有效等位基因；Ho為觀測(cè)雜合度值；He為期望雜合度值；PIC為多態(tài)信息含量

多態(tài)信息含量是檢驗(yàn)群體遺傳多樣性的指標(biāo)[15]，本地野生鯉的有效等位基因數(shù)1.562，大于建鯉的1.388，多態(tài)信息含量0.685，大于建鯉的0.424，廣西本地野生鯉的遺傳多樣性高于建鯉，建鯉經(jīng)過多年的群體選育，由于人為群體選擇，遺傳多樣性低于野生鯉，而本地野生鯉由于生存在相對(duì)封閉的水域，即使與早先引進(jìn)的建鯉存在一定的基因交流，由于沒有受到人工選擇的干擾，也能保持較高的遺傳多樣性，結(jié)果詳見表2。

群體間遺傳分化系數(shù)(GST)被認(rèn)為是度量群體間基因分化相對(duì)大小的一個(gè)較好指標(biāo)[16]，該研究通過分析H1號(hào)和H2號(hào)群體10個(gè)位點(diǎn)的基因分化系數(shù)(GST)和基因流(Nm)，存在顯著遺傳分化的位點(diǎn)有3個(gè)，極顯著遺傳分化的位點(diǎn)有1個(gè)，H1號(hào)和H2號(hào)群體平均基因分化系數(shù)為0.106 9，表明有10.69%的遺傳分化來自兩個(gè)不同群體之間，89.31%的遺傳分化來自整個(gè)鯉內(nèi)部個(gè)體之間，基因流平均為6.216 9(表3)。表明2個(gè)鯉群體間之間有明顯的遺傳分化，基因流Nm和基因分化系數(shù)GST是負(fù)相關(guān)的。

表3 10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因分化系數(shù)GST和基因流NmTab.3 Gene differentiation coefficient (GST) and gene flow (Nm) of 10 microsatellite loci

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來分析，廣西本地鯉與建鯉的遺傳距離為0.146 3，相似性系數(shù)為0.828 4(表4)。表明廣西本地野生鯉與人工選育品種建鯉之間存在一定的遺傳異質(zhì)性，在選擇育種過程中，為提高選擇效應(yīng)，獲得最大的遺傳增益，在建立選育基礎(chǔ)群體的時(shí)候可以進(jìn)行優(yōu)良性狀聚合。

表4 兩個(gè)鯉群體的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)Tab.4 Genetic distance and genetic similarity coefficient of two populations

注：0.146 3為遺傳距離；0.828 4為遺傳相似性系數(shù)

3 討論

3.1 鯉種群遺傳多樣性

等位基因是位于一對(duì)同源染色體的相同位置上控制同一性狀的不同形態(tài)的基因，數(shù)量越多，表明遺傳多態(tài)性高，控制不同性狀的基因座位越豐富，該試驗(yàn)中平均等位基因數(shù)5.3個(gè)，有效等位基因數(shù)平均為1.360 2，觀測(cè)雜合度平均為0.562 6，期望雜合度平均0.463 3，觀測(cè)雜合度較為接近期望雜合度，表明控制相對(duì)性狀的等位基因在兩個(gè)鯉群體均勻分布，兩個(gè)群體的基因頻率符合哈迪-溫伯格規(guī)律，群體間保持了足夠的有效群體數(shù)量。多態(tài)信息含量(PIC)是DNA變異程度高低的指標(biāo)，根據(jù)Botstein等[17]提出的衡量標(biāo)準(zhǔn)：0.25

3.2 親緣關(guān)系與遺傳分化

遺傳距離通常被用來衡量群體間遺傳關(guān)系，反映不同群體間的血緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，該研究根據(jù)Nei等[19]的方法對(duì)廣西本地野生鯉與建鯉的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，根據(jù)Thorp在1982年研究提出同種群體間遺傳在0.03～0.2之間，遺傳距離數(shù)值越大，表明鯉兩個(gè)群體控制相同性狀的基因頻率相差較大，來自相同祖先的機(jī)率越小，親緣關(guān)系就越遠(yuǎn)。該實(shí)驗(yàn)中廣西本地野生鯉與建鯉的遺傳距離為0.146 3，相似性系數(shù)為0.828 4，研究結(jié)果表明，雖然建鯉已在廣西推廣養(yǎng)殖多年，但由于該研究在廣西相對(duì)封閉的水域取樣，與其它開放性河流不同，野生鯉與建鯉的基因交流相對(duì)較少，兩者具有明顯的遺傳異質(zhì)性，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

由表3結(jié)果表明兩個(gè)鯉群體基因分化系數(shù)在0～1之間，平均為0.106 9，為中度遺傳分化水平，等位基因頻率在兩個(gè)鯉群體中分布有所差異，既有起源相同的遺傳性狀，又具有明顯遺傳分化，由于取樣的地理局限性，無法完全排除兩個(gè)群體之間的基因交流，基因流大于1，部分性狀趨于相同，但并不一定由基因交流影響，廣西西南地區(qū)斑塊化水生環(huán)境，選擇壓力可能起了主導(dǎo)作用。

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