涂翰卿，趙金良，趙 巖，曹曉穎

(上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)是我國重要的淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，生長(zhǎng)速度快，抗逆性好，對(duì)鹽、堿具有較強(qiáng)的耐受性，具備一定的鹽堿水養(yǎng)殖潛能[11-14]。前期研究表明，堿脅迫下尼羅羅非魚血氨濃度升高，相關(guān)組織內(nèi)的谷氨酰胺合成酶、氨甲酰磷酸合成酶等氨代謝基因表達(dá)水平均與脅迫過程呈相應(yīng)變化，推測(cè)即兩種氨代謝途徑共同參與調(diào)節(jié)血氨水平調(diào)節(jié)[15-16]。在此基礎(chǔ)上，通過檢測(cè)兩種代謝途徑主要產(chǎn)物尿素與谷氨酰胺的濃度的變化，關(guān)鍵酶的活性與基因表達(dá)量的變化，確認(rèn)兩種氨代謝途徑的存在以及啟動(dòng)時(shí)序，為羅非魚堿性水環(huán)境適應(yīng)的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用尼羅羅非魚取自于上海海洋大學(xué)羅非魚種質(zhì)資源試驗(yàn)站，平均規(guī)格100 g，在室內(nèi)淡水水族箱(0.6 m×0.5 m×0.4 m)內(nèi)暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間正常喂食，定期換水，清理糞便，實(shí)驗(yàn)前3 d停食，排空糞便，挑選具有良好體征活力強(qiáng)的個(gè)體進(jìn)行急性堿脅迫實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)過曝氣過夜處理的自來水與NaHCO3(分析純)按比例配制，配制完成后放置1 d使用。使用便攜式HI83200多參數(shù)水質(zhì)分析儀測(cè)量修正堿度。

血氨測(cè)定試劑盒、尿素氮(BUN)測(cè)試盒(脲酶法)、谷氨酰胺測(cè)試盒購自南京建成生物公司；魚氨甲酰磷酸合成酶(CPS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、魚谷氨酰胺合成酶(GS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBR Premix ExTaq購自TaKaRa公司。熒光定量所用引物來自上海生工生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 急性脅迫實(shí)驗(yàn)

先對(duì)尼羅羅非魚進(jìn)行堿度耐受性的預(yù)實(shí)驗(yàn)，6 g/L堿以下尼羅羅非魚全部存活，所以設(shè)置了3個(gè)堿度組(2、4、6 g/L)，每個(gè)組放置20尾，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)期間對(duì)水體pH進(jìn)行調(diào)控維持在8.5左右，并保持溶氧在3 g/L以上。

1.2.2 樣品采集

分別于脅迫0、2、4、6、12、24、48、72 h，從3個(gè)堿度組各取3條魚，并采集水箱中的水樣4 ℃保存。通過擠壓魚腹部的方式收集尿液4 ℃保存。使用注射器從尾端靜脈抽血4 ℃靜置12 h后離心(3 000 r/min，4 ℃，10 min)取血清保存在-20 ℃冰箱。對(duì)魚進(jìn)行解剖，取出腦、鰓、肝、腎等組織后放置在-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.3 血氨、尿素、谷氨酰胺濃度測(cè)定

使用試劑盒分別檢測(cè)血液中的氨濃度，肝、腦、鰓谷氨酰胺濃度，肝、腎、鰓組織及血液、尿液、水體中尿素濃度進(jìn)行測(cè)定，使用Synergy H1酶標(biāo)儀(Bio-tek,USA)檢測(cè)其吸光值。

1.2.4 GS、CPS酶活性測(cè)定

分別取腦、肝，稱重(0.5～1 g)，按質(zhì)量(g)︰體積(mL)= 1︰9 比例加入生理鹽水，低溫勻漿，4 ℃條件下離心(3 000 r/min，15 min)，吸取上清液。使用試劑盒測(cè)定，用Synergy H1酶標(biāo)儀讀取吸光值，換算其含量。

1.2.5 GS、GLS2、CPS1基因mRNA表達(dá)

GS、GLS2、CPS1基因的特異擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[16]，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。鰓、肝、腎、腦組織在液氮中研磨碎，用Trizol提取總RNA，用RNase free ddH2O溶解，用OD-1000+分光光度計(jì)(Onedrop，國產(chǎn))檢測(cè)RNA濃度和A260/A280值，ABS值在1.8-2.1之間的樣本保留。以總RNA為模板，按PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 說明書操作反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增參照SYBR Premix ExTaq說明書進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性5 s，58～62 ℃ 退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 熔解10 s，65 ℃ 退火5 s。根據(jù)結(jié)果調(diào)整擴(kuò)增體系，使目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率都接近100 %。擴(kuò)增程序與標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增程序相同。最后采用2-ΔΔCt法對(duì)不同基因的表達(dá)量進(jìn)行比較分析。

表1 引物信息Tab.1 The information of the primers

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件分析，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，Duncan多重比較檢測(cè)各測(cè)量指標(biāo)的差異，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫下血氨濃度的變化

脅迫開始后，實(shí)驗(yàn)魚出現(xiàn)短時(shí)間不適反應(yīng)現(xiàn)象，后逐漸消失，實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)魚均保持存活。血氨濃度隨著堿度、脅迫時(shí)間變化而升高，12 h到達(dá)峰值，24 h后維持高于初始水平(圖1)。

2.2 堿脅迫下尿素濃度變化

堿脅迫下，血液尿素濃度0～6 h快速升高，于6 h達(dá)到峰值，12 h后維持高于初始水平(圖2-a)。肝尿素濃度0～6 h快速升高，于6 h達(dá)到峰值，12 h后維持高于初始水平(圖2-b)。鰓尿素濃度在0～2 h快速升高， 6～12 h再次升高，于12 h到達(dá)峰值，24 h后維持高于初始水平(圖2-c)。腎尿素濃度在0～6 h快速升高，在6 h到達(dá)峰值，12 h后維持略高于初始水平(圖2-d)。尿液尿素濃度在0～6 h升高，在6 h到達(dá)峰值，12 h后恢復(fù)初始水平，水體尿素濃度未發(fā)生明顯波動(dòng)(圖3)。

圖1 堿脅迫對(duì)尼羅羅非魚血氨濃度的影響Fig.1 Effect of alkalinity stress on ammonia concentration in serum of O.niloticus

2.3 堿脅迫下谷氨酰胺濃度變化

堿脅迫下，肝谷氨酰胺濃度0～6 h快速升高，于6 h到達(dá)峰值，24 h后維持高于初始水平(圖4-a)。腦谷氨酰胺濃度，在0～6 h快速升高后回落，12～72 h維持上升趨勢(shì)(圖4-b)。鰓谷氨酰胺濃度在0～2 h快速升高后回落， 6～24 h再次升高，于24 h到達(dá)峰值，48 h后維持高于初始水平(圖4-c)。

2.4 堿脅迫下CPS、GS活性變化

堿脅迫下，肝GS活性0～6 h快速升高，12 h后再次升高于24 h到達(dá)峰值(圖5-a)。鰓GS活性0～4 h快速升高，6 h后再次升高于24 h出現(xiàn)峰值(圖5-b)。肝CPS活性在0～2 h迅速升高，2 h到達(dá)峰值后回落，12 h后維持高于初始水平(圖5-c)。

圖2 堿脅迫對(duì)尼羅羅非魚血液(a)、肝(b)、鰓(c)和腎(d)中尿素濃度的影響Fig.2 Effect of alkalinity stress on urea concentration in blood(a),liver(b),gill(c)and kidney(d)of O.niloticus

圖3 堿脅迫對(duì)尼羅羅非魚尿液中尿素與水體中尿素濃度的影響Fig.3 Effect of alkalinity stress on urea concentration in urinary of O.niloticus and urea in water

2.5 堿脅迫對(duì)尼羅羅非魚各基因在不同組織中的表達(dá)變化的影響

2.5.1 GS mRNA的相對(duì)表達(dá)變化

堿脅迫下，肝、腦GS基因的相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間的變化而升高，于24 h到達(dá)峰值，且不同堿度組間隨堿度提高而升高，其中6 g/L堿度組顯著高于其它堿度組(圖6)。

2.5.2 GLS2 mRNA的相對(duì)表達(dá)變化

堿脅迫下，鰓GLS2基因的相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間的變化而升高，于24 h達(dá)到峰值。不同堿度組間， 2～6 h差異不顯著，在12～24 h，6 g/L堿度組顯著高于其它組(圖7)。

2.5.3 CPS1 mRNA的相對(duì)表達(dá)變化

堿脅迫下，肝CPS1基因的相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間的變化而升高，于24 h到達(dá)峰值。在6 h、24 h，6 g/L堿度組顯著高于其它組，而其它時(shí)間點(diǎn)差異不顯著(圖8)。

3 討論

3.1 堿脅迫對(duì)血氨濃度變化的影響

圖4 堿脅迫對(duì)尼羅羅非魚肝(a)、腦(b)和鰓(c)中谷氨酰胺濃度的影響Fig.4 Effect of alkalinity stress on glutamine concentration in liver(a),brain(b)and gill(c)of O.niloticus

圖5 堿脅迫對(duì)尼羅羅非魚肝(a)、腦(b)中GS和肝中CPS(c)活性的影響Fig.5 Effect of alkalinity stress on GS activity in liver(a),brain(b)and CPS activity in brain(c)of O.niloticus

圖6 堿脅迫對(duì)尼羅羅非魚肝(a)和腦(b)GS基因的相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of carbonate alkalinity stress on relative expression of GS gene in liver(a)and brain(b)of O.niloticus注：標(biāo)字母相同者表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母者表示差異顯著(P<0.05)。

圖7 堿脅迫對(duì)尼羅羅非魚鰓中GLS2基因的相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.7 Effect of carbonate alkalinity stress on relative expression of GLS2 gene in gill of O.niloticus

圖8 堿度脅迫對(duì)尼羅羅非魚CPS1基因的相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.8 Effect of carbonate alkalinity stress on relative expression of CPS1 gene in liver of O.niloticus

3.2 堿脅迫下氨的尿素代謝途徑的啟動(dòng)

魚體內(nèi)的氨經(jīng)CPS催化產(chǎn)生氨甲酰磷酸等一系列生化反應(yīng)，最終產(chǎn)生尿素[10]，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)腎臟后排出體外，此外鰓也是重要的排泄尿素的器官，存在專門處理尿素轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白[22]，如太平洋盲鰻的尿素主要依靠尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ut從鰓中排出[23]。本研究中，脅迫開始后隨著血氨濃度的升高，尼羅羅非魚血液、肝、腎和鰓中尿素水平在0～6 h內(nèi)即出現(xiàn)明顯升高，在生化水平上驗(yàn)證了尼羅羅非魚體內(nèi)氨的尿素代謝途徑開始發(fā)揮了作用。肝中CPS酶活在0～2 h活性明顯提升，及肝中CPS1基因的表達(dá)量也出現(xiàn)升高，在24 h出現(xiàn)最大值，這也從另一個(gè)側(cè)面印證了尼羅羅非魚氨的尿素代謝途徑能在0～6 h內(nèi)迅速啟動(dòng)。

已有研究表明大部分硬骨魚在鹽堿性水中以氨氮形式排泄60%～95%的含氮廢物，其余基本以尿素氮形式排出[24]，如土耳其境內(nèi)凡湖中的塔氏卡拉白魚(Chalcalburnustarichi)[25]、美國金字塔湖中的美洲鮭(Oncorhynchusclarkihenshawi)[26]。本研究中，水體中尿素濃度未發(fā)現(xiàn)明顯的變化，且不同堿度脅迫的情況下，肝臟中尿素水平也非常接近，表明尿素途徑可能并非是尼羅羅非魚降氨的主要途徑，而是原先正常的排氨途徑受到抑制情況下的一種快速且有限的補(bǔ)救手段，在青海湖裸鯉上也有類似發(fā)現(xiàn)[27]。

3.3 堿脅迫下氨的谷氨酰胺代謝途徑的啟動(dòng)

本研究脅迫開始后，隨血氨的升高，肝谷氨酰胺濃度0～6 h快速升高，肝GS酶活性0～6 h快速升高，肝GS基因表達(dá)量也隨脅迫開始升高，且均隨堿度的提高而明顯升高，表明將氨轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺的降氨機(jī)制開始啟動(dòng)，并應(yīng)對(duì)堿脅迫降氨作用中發(fā)揮了不同的效能。而鹽堿脅迫下GS基因表達(dá)量升高現(xiàn)象在青海湖裸鯉中也有發(fā)現(xiàn)[4]。谷氨酰胺對(duì)細(xì)胞膜具有很好的通透性，動(dòng)物體內(nèi)的氨即主要以谷氨酰胺的形式被運(yùn)送到排泄部位[28]，而魚體中谷氨酰胺會(huì)被運(yùn)送到鰓，經(jīng)由GLS重新分解成氨，沿血液-水的擴(kuò)散梯度從鰓上皮排出[22,29]，或借助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等載體排出[8]。在本研究中鰓GLS2基因的表達(dá)量隨時(shí)間的變化而升高，在24 h到達(dá)峰值，變化趨勢(shì)與肝中GS基因基本相似，則表明鰓將谷氨酰胺重新分解為氨排出體外的排氨機(jī)制也在迅速發(fā)揮作用。脅迫開始后腦GS基因的相對(duì)表達(dá)量的升高，腦GS酶活性的升高符合魚腦中具有高水平的GS活性，以保護(hù)其免受氨毒性的觀點(diǎn)[30]。馬加迪湖的羅非魚(Oreochromisalkalicusgrahami)在高氨氮環(huán)境中，能將體內(nèi)過多的氨合成為谷氨酰胺儲(chǔ)存起來或用于其他代謝活動(dòng)[31]在本研究腦谷氨酰胺濃度的持續(xù)升高的現(xiàn)象中得到印證。有的研究表明谷氨酰胺不僅是細(xì)胞外液中氨基酸的主要來源[32]，還具有改進(jìn)免疫細(xì)胞功能，提高應(yīng)激反應(yīng)能力等多種生理功能[33]，同時(shí)近來的研究表明，魚類氨中毒死亡與星狀膠質(zhì)細(xì)胞腫脹誘發(fā)的氧化損傷和免疫抑制有關(guān)[34]，所以尼羅羅非魚在堿脅迫0～6 h內(nèi)合成谷氨酰胺，可能并不只是為了降低體內(nèi)氨的毒性效應(yīng)，產(chǎn)生的谷氨酰胺還能夠參與調(diào)節(jié)尼羅羅非魚對(duì)脅迫的適應(yīng)能力，保證機(jī)體存活。

4 結(jié)論

本研究表明在6 g/L以下堿脅迫的環(huán)境中，尼羅羅非魚能夠通過自身體內(nèi)調(diào)節(jié)降低氨的濃度保證機(jī)體存活。在高堿脅迫下，原先通過鰓直接排氨途徑受到抑制，尿素代謝能力在0～6 h內(nèi)快速提升，在12 h時(shí)到達(dá)最大效能后很快回落，因?yàn)閴A度的提升而表現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)，表明提高尿素合成只是其中一種補(bǔ)償機(jī)制。谷氨酰胺代謝能力在0～6 h內(nèi)快速提升，在24 h到達(dá)最大效能，回落后依然持續(xù)在較高水平較長(zhǎng)時(shí)間，且表現(xiàn)出隨堿度提升而增長(zhǎng)，所以谷氨酰胺途徑應(yīng)是尼羅羅非魚在堿脅迫下主要的降氨途徑。

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