王麗，王強(qiáng)，裴洪利，程欣

（沈陽市第七人民醫(yī)院，遼寧沈陽 110003）

孢子絲菌病屬于深部真菌病，平均病程約為6個(gè)月，其發(fā)病機(jī)制和患者的免疫狀態(tài)尚不明確[1]。本試驗(yàn)應(yīng)用四色免疫流式細(xì)胞儀檢測52例孢子絲菌病患者和40例健康對照組的外周血淋巴細(xì)胞亞群，比較不同細(xì)胞亞群百分比和相對比的差異，探討孢子絲菌病患者的免疫狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組 孢子絲菌病患者組：2016年03月—2017年03月就診于沈陽市第七人民醫(yī)院門診和住院的患者，經(jīng)病史、體征、組織真菌培養(yǎng)臨床診斷為申克孢子絲菌病患者，共計(jì)52例。其中男 27例，女 25例，平均年齡（50.12±14.37）歲，病程在1個(gè)月內(nèi)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：心血管、嚴(yán)重肝腎功能損傷性疾病、內(nèi)分泌及風(fēng)濕免疫性疾病病史，近1個(gè)月內(nèi)系統(tǒng)應(yīng)用激素或免疫抑制劑，近1周內(nèi)系統(tǒng)應(yīng)用抗生素、生物制劑等藥物，肝腎功能異常者。

對照組:共計(jì)40例，男21例，女19例，平均年齡（49.72±13.27）歲，為我院體檢健康的醫(yī)護(hù)人員。2組人群在性別之比和年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法 ①每位測試對象取2支試管，分別編號為A和B，在每支試管中分別加入100 μL的EDTA抗凝的全血。②取20 μL CD3/CD8/CD45/CD4抗體加入到A管中，取20 μL CD3/CD16+56/CD45/CD19抗體加入到B管中，渦旋混勻，室溫避光放置20min。③取出各加入1mL的FACS溶血素，充分混勻，避光放置15min后，1500轉(zhuǎn)/min，離心5min。④去除上清，再各加入2 mL的磷酸鹽緩沖液，混勻，1 500轉(zhuǎn)/min離心5 min。⑤去除上清，加0.5 mL的磷酸鹽緩沖液，充分混勻，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示各項(xiàng)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分析，所以計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

患者組與對照組比較，其外周血淋巴細(xì)胞亞群CD8+T細(xì)胞百分比升高，CD4+T細(xì)胞百分比下降，CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD3+T細(xì)胞百分比、NK細(xì)胞百分比和B細(xì)胞百分比在2組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表1。

表1 患者組和對照組外周血淋巴細(xì)胞亞群

3 討論

孢子絲菌感染多見于免疫功能低下的患者如人類免疫缺陷病毒感染[2]，說明其和機(jī)體免疫狀態(tài)相關(guān)。本研究的分析結(jié)果與文獻(xiàn)[1]不同，原因是病程研究的長短不一樣。本研究發(fā)現(xiàn)在病程<1個(gè)月時(shí)，孢子絲菌病患者組對比對照組CD8+T細(xì)胞百分比升高，CD4+T細(xì)胞百分比下降和CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值下降；文獻(xiàn)中病程<6個(gè)月和病程>6個(gè)月時(shí)，孢子絲菌病患者組對比對照組均是CD8+T細(xì)胞百分比降低和CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值升高。

輔助性T淋巴細(xì)胞（CD4+）和抑制性T淋巴細(xì)胞（CD8+）在免疫體系中占有重要地位。正常情況下，兩者保持一定比例，兩者之間相互誘導(dǎo)、相互制約，對于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和維持免疫自穩(wěn)具有重要作用[3]，當(dāng)某一亞群發(fā)生改變，則平衡遭到破壞，引起免疫紊亂，發(fā)生一系列病理改變[4]。有研究表明，當(dāng)人體感染申克孢子絲菌后，申克孢子絲菌被樹突狀細(xì)胞捕獲，并將其抗原呈遞給淋巴細(xì)胞[5]，在共同刺激信號協(xié)同作用下，CD8+T細(xì)胞被激活，發(fā)揮特異性細(xì)胞毒效應(yīng)，釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)如穿孔素，和巨噬細(xì)胞一起殺傷申克孢子絲菌，有效地控制感染。但部分被吞噬細(xì)胞吞入的申克孢子絲菌酵母相細(xì)胞，不但能夠在溶酶體內(nèi)保持完整，甚至可以出芽繁殖，從而長期存在于吞噬細(xì)胞內(nèi)[6-7]。這種胞內(nèi)寄生菌的特征，不但可以保護(hù)申克孢子絲菌免受其他免疫機(jī)制的攻擊，還能影響抗真菌藥物的效果，是孢子絲菌病病程較長的原因。由此推斷，在孢子絲菌病的病程中，CD8+T細(xì)胞不斷被激活，參與機(jī)體抵抗胞內(nèi)菌的細(xì)胞毒性反應(yīng)，從而導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞百分比升高，相對CD4+T細(xì)胞百分比下降和CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值下降，這是機(jī)體防御感染的表現(xiàn)。

孢子絲菌病小鼠模型顯示B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫在感染早期階段同樣參與機(jī)體的抗孢子絲菌的保護(hù)性反應(yīng)[8]，NK細(xì)胞不依賴抗體、補(bǔ)體及預(yù)先致敏就可快速與單核細(xì)胞、粒細(xì)胞等協(xié)同，在感染早期升高，起到抗感染的免疫調(diào)節(jié)作用[9]。但本研究中患者外周血B細(xì)胞百分比、NK細(xì)胞百分比與對照組相比并無差異，這可能與患者病程時(shí)間較長，超過了體液免疫反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間，或是其他原因還有待于進(jìn)一步研究[8]。本研究表明治療時(shí)可根據(jù)患者外周血的淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)果，選用免疫調(diào)節(jié)劑[10]，為孢子絲菌病的診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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