張秋秋，雷鐵池

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060）

臨床觀察發(fā)現(xiàn)用含有中藥蛇床子（Fructus cnidii）的內(nèi)服或外用制劑治療過敏性皮膚病有效[1]。近年來也有實(shí)驗(yàn)研究顯示這一傘形科植物可能因含有大量的香豆素類化合物蛇床子素（Osthole，7-甲氧基-8-異戊烯基-香豆素）發(fā)揮止癢和抗過敏活性[2-3]，但確切的分子機(jī)制仍不清楚。本研究用組織化學(xué)和透射電鏡技術(shù)觀察了蛇床子素對(duì)佛波脂（Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）誘導(dǎo)大鼠嗜堿性白血病RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒的影響，進(jìn)一步探討其抗過敏機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 蛇床子素購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院北京藥物所；RBL-2H3細(xì)胞、甲苯胺藍(lán)染料購(gòu)自武漢市百奧斯公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自南京恩晶生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；PMA（貨號(hào)：P8139）、4-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（PNAG，貨號(hào)：N9376）、Triton裂解液均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為市售化學(xué)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中對(duì)RBL-2H3細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿約80%培養(yǎng)瓶底面積時(shí)可進(jìn)行傳代，傳代比例為1∶3，2～3 d傳代1次。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔接種約104個(gè)細(xì)胞，于37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。用新鮮配制含有不同濃度 PMA（0.125、0.25、0.5、1、2 μmol/L）和蛇床子素（1、10、50、100、200、400 μmol/L）培養(yǎng)基換液。置細(xì)胞培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照。最后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光值。細(xì)胞存活率（%）＝（加藥細(xì)胞吸光值／對(duì)照細(xì)胞吸光值）×100%。

1.2.3 甲苯胺藍(lán)染色法測(cè)定脫顆粒率 將細(xì)胞接種至預(yù)置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板制備細(xì)胞爬片。過夜，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，用新鮮配制含有PMA和蛇床子素培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。棄上清，蓋玻片用臺(tái)氏液（135 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，5.6 mmol/L 葡 萄 糖 ，1.8 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，20 mmol/L HEPES，0.1%BSA）2～3 次。每孔加入500 μL甲苯胺藍(lán)染液，染色3 min，PBS洗3遍。待玻片干燥后，用中性樹膠封片，于Olympus正置顯微鏡油鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)顆粒并拍照。100個(gè)細(xì)胞中胞質(zhì)脫顆粒細(xì)胞數(shù)被作為脫顆粒率。

1.2.4 β-氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性測(cè)定 收集藥物處理細(xì)胞制備新鮮細(xì)胞裂解物。于96孔板每孔加含1 mmol/L PNAG酶底物的枸櫞酸緩沖液（pH＝4.5）50 βL，并與細(xì)胞裂解物 50 βL 混勻，37℃孵育1.5 h。加入堿溶液終止反應(yīng)。由于該酶隨著細(xì)胞脫顆粒被釋放，且能使底物PNAG分解產(chǎn)生黃色的p-硝基酚，酶活性與脫顆粒程度呈正相關(guān)。用多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkin Elmer公司）檢測(cè)405 nm吸光值。用以下公式計(jì)算β-氨基己糖苷酶釋放率：β-氨基己糖苷酶釋放率（%）＝上清液的吸光值/（上清液的吸光值+細(xì)胞裂解液的吸光值）×100%。

1.2.5 透射電鏡技術(shù)觀察細(xì)胞脫顆粒 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RBL-2H3細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁且長(zhǎng)滿瓶底后棄去培養(yǎng)液。設(shè)陰性對(duì)照組（等體積的臺(tái)式液）、陽(yáng)性對(duì)照組（0.5 μmol/L PMA）和實(shí)驗(yàn)組（50 μmol/L 蛇床子素+PMA），37℃共孵育1 h，棄上清，臺(tái)式液洗2～3遍，用柔軟細(xì)胞劃子輕輕刮起細(xì)胞呈細(xì)胞懸液，置于1.5 mL尖頭EP管中，1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min。2.5%戊二醛溶液固定細(xì)胞，環(huán)氧樹脂包埋制備超薄切片，經(jīng)枸櫞酸鉛及醋酸雙氧鈾電子染色后，用Tecnai G2 S-Twin F20透射電鏡顯微鏡（美國(guó)FEI公司）觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化并數(shù)碼相機(jī)攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMA誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒 CCK-8結(jié)果顯示用小于1 μmol/L PMA處理培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞存活率無明顯影響，見表1。隨后，筆者觀察了0.5 μmol/L PMA對(duì)細(xì)胞脫顆粒誘導(dǎo)。直接油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和甲苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)未處理組RBL-2H3細(xì)胞呈梭形，0.5 μmol/L PMA可導(dǎo)致細(xì)胞明顯變圓；胞質(zhì)內(nèi)嗜堿性染色（藍(lán)色）的顆粒物PMA處理組較對(duì)照組明顯減少，見圖1。透射電鏡證實(shí)未處理組胞質(zhì)內(nèi)充滿電子致密的圓形粗大的顆粒；經(jīng)PMA處理后，圓形顆粒減少或消失，且能在細(xì)胞膜表面觀察到較多囊泡被胞吐，見圖1，提示PMA能有效誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒。

2.2 蛇床子素抑制PMA誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒 CCK-8結(jié)果表明 1～50 μmol/L蛇床子素對(duì)RBL-2H3 細(xì)胞存活率沒有影響，100～400 μmol/L 蛇床子素呈現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性。在無細(xì)胞毒性的蛇床子素 3 個(gè)濃度（1，10，50 μmol/L） 聯(lián)合 0.5 μmol/L PMA處理細(xì)胞，測(cè)定了RBL-2H3細(xì)胞的脫顆粒率和β-氨基己糖苷酶釋放率。結(jié)果顯示蛇床子素能劑量依賴地抑制脫顆粒，見表1。甲苯胺藍(lán)染色后觀察到陽(yáng)性對(duì)照組部分細(xì)胞呈空泡狀，細(xì)胞質(zhì)淡染，細(xì)胞周圍可見大量被釋放的藍(lán)紫色顆粒；經(jīng)蛇床子素處理后，RBL-2H3細(xì)胞形態(tài)逐漸清晰、完整，細(xì)胞內(nèi)可見大量藍(lán)紫色顆粒。電鏡下觀察到陰性對(duì)照細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量致密顆粒和一些稍擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，PMA刺激后可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒明顯減少及大量空泡狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)蛇床子素處理后細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，大部分顆粒尚且存在，見圖2。結(jié)果與β-氨基己糖苷酶釋放率結(jié)果一致，提示蛇床子素能劑量依賴地抑制PMA誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒。

圖1 PMA誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒

表1 蛇床子素與PMA單獨(dú)或聯(lián)合處理RBL－2H3細(xì)胞對(duì)細(xì)胞存活率、脫顆粒率和β－氨基己糖苷酶釋放率的影響 （%，±s）

表1 蛇床子素與PMA單獨(dú)或聯(lián)合處理RBL－2H3細(xì)胞對(duì)細(xì)胞存活率、脫顆粒率和β－氨基己糖苷酶釋放率的影響 （%，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與0.5 uM PMA組比較，**P<0.01。

組別 細(xì)胞存活率 脫顆粒率 β-氨基己糖苷酶釋放率空白對(duì)照組 97.47±3.25 16.16±1.48 6.01±0.16 0.5 μmol/L PMA 組 94.67±1.67 41.31±4.26* 9.99±0.17*50 μmol/L 蛇床子素 92.45±7.29 16.38±1.03** 6.30±0.06**1 μmol/L 蛇床子素+PMA 組 97.06±1.23 26.47±2.12** 7.95±0.33**10 μmol/L 蛇床子素+PMA 組 95.06±1.15 23.35±0.71** 6.67±0.25**50 μmol/L 蛇床子素+PMA 組 95.88±2.58 16.97±2.22** 4.87±0.23**F 1.048 80.077 269.205

3 討論

肥大細(xì)胞是分布于人體皮膚和黏膜下結(jié)締組織內(nèi)的一種固有免疫細(xì)胞，而嗜堿性粒細(xì)胞則分布在外周血液經(jīng)化學(xué)趨化被招募至變態(tài)反應(yīng)部位。這兩種細(xì)胞的表面均表達(dá)高親和力FcεRⅠ受體和胞質(zhì)中含有嗜堿性顆粒，被認(rèn)為是參與Ⅰ型超敏反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞[4]。然而，直接從人皮膚或黏膜組織中分離肥大細(xì)胞十分困難。來自大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞（Rat basophilic leukemia cell）RBL-2H3細(xì)胞株仍保留許多肥大細(xì)胞的生物學(xué)特征且能體外傳代培養(yǎng)，已被廣泛用作研究肥大細(xì)胞脫顆粒的替代細(xì)胞模型[5]。用二硝基苯酚交聯(lián)牛血清白蛋白（DNPBSA）作為抗原，與預(yù)先結(jié)合在肥大細(xì)胞表面的抗DNP-IgE（anti-DNP IgE）單克隆抗體結(jié)合是經(jīng)IgE-介導(dǎo)刺激肥大細(xì)胞脫顆粒的經(jīng)典方法[6]。也有學(xué)者用化合物48/80（Compound 48/80）直接刺激非IgE-介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化[7]。本研究結(jié)果顯示蛋白激酶C（PKC）激動(dòng)劑PMA，可直接刺激RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒；0.5 μmol/L PMA處理組與空白對(duì)照組相比，β-氨基己糖苷酶釋放率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。PKC信號(hào)通路活化，導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈磷酸化，繼而肌球蛋白/肌動(dòng)蛋白復(fù)合體解聚，加速胞質(zhì)內(nèi)顆粒囊泡運(yùn)動(dòng)；后者的質(zhì)膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合使顆粒內(nèi)組胺等生物活性介質(zhì)被釋放，即脫顆粒（Degranulation）[8]。

本研究筆者還著重觀察了蛇床子素對(duì)PMA誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒的影響。將無細(xì)胞毒性的3個(gè)濃度蛇床子素（1，10，50 μmol/L）與 0.5 μmol/L PMA聯(lián)合處理細(xì)胞，結(jié)果顯示蛇床子素能劑量依賴地抑制脫顆粒率和β-氨基己糖苷酶釋放率。透射電鏡結(jié)果也證實(shí)蛇床子素能明顯阻抑PMA誘導(dǎo)的顆粒囊泡釋放。蛇床子素是從中藥蛇床子、獨(dú)活等提取的一種香豆素類化合物。已有研究報(bào)道蛇床子素能抑制組胺-和非組胺-依賴性瘙癢，推測(cè)其作用機(jī)制可能是部分抑制了組胺介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒[2]。在過敏原未知的情況下，用蛇床子素直接抑制活化的肥大細(xì)胞脫顆粒有望成為治療過敏性皮膚病的一種新手段。

圖2 蛇床子素抑制PMA誘導(dǎo)細(xì)胞脫顆粒

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