英提扎爾·艾孜木江，阿依姑麗·艾合麥提，李 珊，艾力牙爾·吾不力，古麗杰克熱木·伊布拉音

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

野山杏(PrunusarmeniacaL.)屬薔薇科，落葉喬木，在我國分布廣泛，尤其在新疆的伊犁和哈密等地區(qū)分布更為豐富。研究證明，野山杏含有大量的膳食纖維和豐富的有機(jī)酸(如：檸檬酸、酒石酸、草酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸和抗壞血酸等[1-3])、黃酮類及多種礦質(zhì)元素[4-5]。有機(jī)酸是具有酸性的有機(jī)化合物，是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，研究表明有機(jī)酸具有抗炎癥反應(yīng)、抗血栓、抗氧化[6]、降血脂[4]、抗病毒、增加冠脈流量、抑制腦組織脂質(zhì)過氧化物生成以及保護(hù)血管內(nèi)皮等生理功能[7-8]。目前，課題組已完成了野山杏果肉總有機(jī)酸的體外抑制脂質(zhì)過氧化活性和清除自由基能力的作用[9-10]。本研究著重探討TOAWA對高脂血癥大鼠的體內(nèi)抗氧化活性及其保肝作用，為新疆野山杏果肉成分的進(jìn)一步研究、野山杏資源的開發(fā)利用以及提高野山杏產(chǎn)品的附加值提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 SK-1混勻器(常州國華電器有限公司)；UNICO-UV2000分光光度計(jì)(尤尼柯(上海儀器有限公司)；DG5033A酶標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)；恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)；CHA-S恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)；80-2型低速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)。

1.2試藥 野山杏成熟果實(shí)，產(chǎn)自新疆哈密伊吾縣葦子峽鄉(xiāng)，經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園林學(xué)院周桂林教授鑒定為薔薇科杏屬落葉喬木野山杏(PrunusarmeniacaL.)的果實(shí)，冷藏保存。血脂康膠囊(北京北大維信生物科技有限公司，批號20160108)；717型陰離子交換樹脂(上海山浦化工有限公司，批號20170407)；膽固醇(上海藍(lán)季生物科技發(fā)展有限公司，批號161020)；膽酸鈉(批號327021)，丙基硫氧嘧啶 (批號150525)，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司； MDA試劑測試盒(批號20170728)，SOD 試劑測試盒(批號20170805)，GSH-Px試劑測試盒(批號20170801)，TG試劑測試盒(批號20170515)，TCH試劑測試盒(批號20170516)，LDL-C試劑測試盒(批號20170518)和HDL-C試劑測試盒(批號20170515)，均由南京建成生物工程研究所提供；其他試劑均為同產(chǎn)分析純。

1.3動(dòng)物 健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200±20 g，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)，許可證號：SCXK(新)2016-0003。

2 方法

2.1樣品溶液和高脂乳劑的制備 TOAWA的制備：取野山杏干粉，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇以料液比1∶10回流提取2次，合并濾液減壓濃縮并回收乙醇，濃縮液采用717型陰離子交換樹脂作為吸附柱，用稀鹽酸做洗脫液，收集洗脫液，減壓濃縮，濃縮的洗脫液再用正丁醇反復(fù)萃取，分離正丁醇相，減壓回收正丁醇，殘?jiān)稍锛吹玫厣目傆袡C(jī)酸純品，采用電位滴定法測定[11]含量為845.4 mg·g-1。實(shí)驗(yàn)前將總有機(jī)酸和血脂康用質(zhì)量濃度為5 g·L-1的羧甲基纖維素鈉配成所需質(zhì)量濃度的混懸液。

高脂乳劑按照文獻(xiàn)[12]方法配制(10 g膽固醇，20 g豬油，20 g·L-1膽酸鈉，1 g丙基硫氧嘧啶，1 mL吐溫-80；2 mL丙二醇)

2.2動(dòng)物的分組、造模與給藥 將60只大鼠按照表1隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半，除了空白對照組每天灌服羧甲基纖維素鈉外，其余5組上午灌服高脂乳劑，下午高脂模型組灌服羧甲基纖維素鈉，陽性對照組灌服血脂康，TOAWA高、中、低劑量組分別灌服不同劑量的TOAWA。實(shí)驗(yàn)周期為60 d，每3 d稱定體質(zhì)量1次，便于調(diào)整灌胃劑量，期間正常進(jìn)食、飲水。分組和給藥劑量見表1。

表1實(shí)驗(yàn)大鼠分組和給藥劑量

Tab.1 Experimental rats grouped and given doses

組別高脂乳劑/mL·kg-1·d-15g·L-1羧甲基纖維素鈉mL·kg-1·d-1血脂康/g·kg-1·d-1TOAWA/g·kg-1·d-1空白對照組—10——高脂模型組1010——陽性對照組10—0．2—TOAWA 高劑量組10——0．4 中劑量組10——0．2 低劑量組10——0．1

注：—表示未給藥或用生理鹽水灌胃。

2.3生化指標(biāo)的測定 于最后一次給藥后禁食12 h，不禁水，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，心臟采血，制備血清，用于測定血脂，脫臼處死大鼠，并快速取出肝臟、腎及腦組織，用4 ℃的生理鹽水清洗干凈，其中分離肝臟右小葉供制作病理切片，再分取一部分肝、腎和腦組織，分別加入9倍體積的生理鹽水，在4 ℃下分別制成質(zhì)量濃度為100 g·L-1肝、腎和腦組織的勻漿液，冷凍離心(3 000 r·min-1，10 min)，分離上清液，按照試劑盒說明書分別測定血清中的TG、TCH、LDL-C和HDL-C含量以及肝、腎和腦組織勻漿液中的MDA、SOD和GSH-Px等生化指標(biāo)。

2.4肝臟組織病理學(xué)檢查 取出肝右小葉用生理鹽水洗干凈，用100 mL·L-1中性甲醛溶液固定，制作病理切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，生物顯微鏡(100×和400×)觀察各組肝組織切片，觀察其病理學(xué)變化。

3 結(jié)果與分析

3.1TOAWA對高脂血癥大鼠血清的影響 見表2。

表2TOAWA對高血脂大鼠血清中血脂含量的影響

Tab.2 Effects of TOAWA on serum lipids in hyperlipidemia rats

注：高脂模型組與空白對照組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；高脂模型組與其余4組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；TOAWA高、中、低劑量組與陽性對照組比較▼P<0.05，▼▼P<0.01。

由表2可知，與空白對照組相比，高脂模型組TG、TC和LDL-C水平極顯著升高(P<0.001)，HDL-C水平顯著降低(P<0.01)，此結(jié)果表明，大鼠高脂血癥模型誘導(dǎo)成功。與高脂模型組比較，TOAWA高、中、低劑量組與陽性對照組均可顯著降低TC、TG 和 LDL-C水平(P<0.01)和升高HDL-C的水平(P<0.05)；與陽性對照組相比，TOAWA高劑量組呈現(xiàn)顯著的調(diào)節(jié)血脂作用(P<0.05)、中劑量組無顯著性差異、低劑量組調(diào)節(jié)血脂作用弱于陽性對照組。提示TOAWA能調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血脂水平，且高劑量組的作用更為明顯。

3.2TOAWA對高脂血癥大鼠肝、腎和腦組織中MDA含量的影響 見表3。由表3可知，模型組肝、腎和腦組織中的MDA水平與空白對照組相比有顯著的升高(P<0.01)，表明組織中過氧化脂質(zhì)蓄積；TOAWA高、中、低劑量組與陽性對照組對實(shí)驗(yàn)大鼠肝、腎和腦組織中的MDA水平有明顯降低(P<0.05)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中腎臟組織中MDA水平降低更為顯著(P<0.001)。與陽性對照組比較，TOAWA高、中、低劑量組對受試大鼠肝、腎和腦組織中的MDA水平的降低作用無明顯差異，作用影響與陽性對照組相當(dāng)。結(jié)果表明，TOAWA對受試大鼠的肝、腎和腦組織的MDA水平有不同程度的降低作用，且對腎臟與腦組織的作用更為明顯。

3.3TOAWA對高脂血癥大鼠肝、腎和腦組織中SOD值的影響 見表4。

由表4可知，與空白對照組比較，高脂模型組肝、腎和腦組織中的SOD活性明顯低于空白對照組(P<0.001)，表明高脂模型組大鼠組織中產(chǎn)生了過氧化損傷；與高脂模型組相比，TOAWA高劑量組和陽性對照組能顯著升高肝、腎和腦的SOD活性(P<0.05)，TOAWA中、低劑量組能不同程度地升高組織中的SOD活性；與陽性對照組比較，TOAWA高劑量組能升高肝、腎和腦組織中的SOD活性，其中腦組織升高作用較明顯(P<0.05)，中、低劑量組升高作用較弱，但差異不大。此結(jié)果表明，TOAWA能夠提高實(shí)驗(yàn)大鼠肝、腎和腦組織中的SOD活性，呈現(xiàn)良好的抗氧化能力，其中對腎和腦組織的作用更明顯。

表3TOAWA對大鼠肝、腎和腦組織中MDA(nmol·mgprot-1)含量的影響

Tab.3 Effects of TOAWA on the content of MDA(nmol·mgprot-1) in liver kidney and brain tissue of rats

注：高脂模型組與空白對照組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；高脂模型組與其余4組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；TOAWA高、中、低劑量組與陽性對照組比較▼P<0.05。

3.4TOAWA對高脂血癥大鼠肝、腎和腦組織中GSH-Px活性的影響 見表5。

表4TOAWA對大鼠肝、腎和腦組織中SOD(U·mgprot-1)活性的影響

組別 肝臟 腎臟 腦空白對照組485．47±67．63251．10±6．23209．13±55．06高脂模型組336．10±30．43▲▲202．19±25．31▲▲▲129．65±24．79▲▲▲陽性對照組442．91±141．59?245．84±14．65??179．29±43．19?TOAWA低劑量組382．77±84．15238．25±16．20??179．84±37．60?TOAWA中劑量組390．27±76．42214．94±15．73▼▼137．65±16．63▼▼TOAWA高劑量組447．04±66．11?256．24±17．56???201．10±27．39???▼

注：高脂模型組與空白對照組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；高脂模型組與其余4組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；TOAWA高、中、低劑量組與陽性對照組比較▼P<0.05，▼▼P<0.01。

由表5可知，高脂模型組與空白對照組相比，肝、腎和腦組織中的GSH-Px的活性顯著降低(P<0.001)，說明高脂模型組大鼠組織內(nèi)抗氧化能力明顯降低；與高脂模型組相比TOAWA高劑量組和陽性對照組能顯著提高肝、腎和腦組織的GSH-Px活性 (P<0.01)，TOAWA中、低劑量組可不同程度地提高實(shí)驗(yàn)大鼠肝、腎和腦組織中GSH-Px活性，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與陽性對照組相比，TOAWA高劑量組對肝、腎和腦組織中的GSH-Px活性的升高作用較強(qiáng)，其中肝臟組織作用較明顯(P<0.01)，TOAWA中、低劑量組比陽性對照組作用較弱。結(jié)果表明，TOAWA對實(shí)驗(yàn)大鼠肝、腎和腦組織均呈現(xiàn)不同程度的抗氧化作用。

表5TOAWA對大鼠肝、腎和腦組織中GSH-Px(U·mgprot-1)活性的影響

組別 肝臟 腎臟 腦空白對照組568．76±71．98361．73±58．9026．31±5．99高脂模型組426．49±51．99▲▲298．35±26．86▲▲14．09±2．96▲▲▲陽性對照組511．77±58．14?374．31±57．16??21．66±5．88??TOAWA低劑量組456．10±54．75329．49±30．18▼17．99±2．08TOAWA中劑量組469．57±93．27341．86±32．07?18．27±3．80TOAWA高劑量組537．67±58．89??▼▼392．26±19．24???24．72±3．80???

注：高脂模型組與空白對照組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；高脂模型組與其余4組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；TOAWA高、中、低劑量組與陽性對照組比較▼P<0.05，▼▼P<0.01。

3.5大鼠肝臟組織的病理學(xué)觀察 見圖1。由圖1可知，空白對照組周邊肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心的放射狀排列，且規(guī)律、整齊、肝竇正常，未見細(xì)胞膨脹，無明顯的病理形態(tài)變化；高脂模型組肝細(xì)胞含有較多的白色脂肪油滴，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，可見肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞之間連接松散，發(fā)生脂肪變性；給予不同劑量TOAWA和血脂康后，TOAWA高、中、低劑量組的脂肪變性程度明顯改善，細(xì)胞形態(tài)開始恢復(fù)，其中高劑量組的脂肪病變減少更顯著，大部分細(xì)胞恢復(fù)接近正常形態(tài)，陽性對照組肝索和肝竇結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈周圍肝細(xì)胞恢復(fù)放射狀排列整齊，脂肪油滴明顯減少，肝臟切片基本恢復(fù)到正常狀態(tài)。

圖1TOAWA對大鼠肝臟組織的病理學(xué)變化的影響

A．空白對照組(×100)；B．空白對照組(×400)；C．高脂模型組(×100)；D．高脂模型組(×400)；E．陽性對照組(×100)；F．陽性對照組(×400)；G．TOAWA低劑量組(×100)；H．TOAWA低劑量組(×400)； I．TOAWA中劑量組(×100)；J．TOAWA中劑量組(×400)；K．TOAWA高劑量組(×100)；L．TOAWA高劑量組(×400)。

Fig.1 Effect of TOAWA on pathological changes of liver tissue in rats

A.control group(×100)； B.control group(×400)； C.model group(×100)； D.model group(×400)； E.positive control group(×100)； F.positive control group(×400)； G.TOAWA low dose group(×100)； H.TOAWA low dose group(×400)； I.TOAWA middle dose group(×100)； J.TOAWA middle dose group(×400)； K.TOAWA high dose group(×100)； L.high dose group(×400).

4 討論

隨著社會(huì)發(fā)展，高脂血癥發(fā)病率呈逐年升高趨勢，且患者發(fā)病年齡段趨于年輕化[13]。血脂異常與冠心病的發(fā)生和心血管疾病的死亡率密切相關(guān)[14-16]，在高脂血癥病理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞在脂蛋白的作用下產(chǎn)生大量的氧自由基導(dǎo)致血管內(nèi)膜受損與細(xì)胞功能障礙，降低抗氧化能力[17-18]?？寡趸镔|(zhì)可通過提高機(jī)體抗氧化能力，清除體內(nèi)自由基，降低脂質(zhì)過氧化損傷，抑制機(jī)體、組織和細(xì)胞的過氧化過程[19-20]，從而減輕自由基和過氧化脂質(zhì)對機(jī)體的損傷。因此，在降低血脂的同時(shí)，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，能更好地控制血脂異常導(dǎo)致的心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。

本研究以血脂康為陽性對照，通過測定TOAWA對高脂血癥大鼠的血清血脂水平與肝、腎和腦組織的抗氧化指標(biāo)，考察TOAWA對血脂水平的影響與對高血脂誘發(fā)的體內(nèi)過氧化損傷的影響，通過制作肝臟的病理切片，觀察TOAWA對肝功能的影響。研究結(jié)果表明，TOAWA能明顯調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂水平，顯著提升高脂血癥大鼠肝、腎和腦組織抗氧化活性，對高脂血誘發(fā)的體內(nèi)過氧化損傷有明顯的改善作用；TOAWA能使高脂血癥導(dǎo)致的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變和脂肪浸潤的現(xiàn)象得到顯著改善，肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，提示其具有一定的保肝作用。對TOAWA的體內(nèi)抗氧化活性和保肝作用需深入研究，為將其研發(fā)為安全、有效的天然抗氧化劑和功能性食品的添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 阿依姑麗·艾合麥提.野山杏不溶性膳食纖維的提取及其降血脂作用研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[2] 黃玉香，吳雅清，許瑞安.有機(jī)酸提取技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012，33(14):426-428,431.

[3] 李珊，阿依姑麗·艾合麥提，孫鵬，等.RP-HPLC法同時(shí)測定新疆野山杏果肉中10種有機(jī)酸成分[J].食品工業(yè)科技，2017，38(20):250-255.

[4] 阿依姑麗·艾合麥提，戴小華，張華，等.野山杏總黃酮對高血脂大鼠降血脂及抗氧化作用的研究[J].西北藥學(xué)雜志，2014，29(3):258-261

[5] 姚健，羅俊富，張繼.野山杏果肉成分分析及對小鼠小腸蠕動(dòng)作用的研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2009，(1):18-20．

[6] 李娜，金敬紅，姜洪芳，等.宣木瓜總有機(jī)酸的純化及鎮(zhèn)痛抗炎作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(1):113-116，119.

[7] Zheng Y J，Duan Y T，Zhang Y F，et al.Determination of organic acids in red wine and must on only one RP-LC-column directly after sample dilution and filtration[J].Chromatographia，2009，69(11/12)：1391-1395.

[8] Liszt K，Walker J，Somoza V.Identification of organic acids in wine that stimulate mechanisms of gastric acid secretion[J].J Agric Food Chem，2012，(60)：7022-7030.

[9] 阿依姑麗·艾合麥提，李珊，英提扎爾·艾合買提，等.野山杏果肉總有機(jī)酸體外抑制脂質(zhì)過氧化活性研究[J].西北藥學(xué)雜志，2017，32(4):426-430.

[10]阿依姑麗·艾合麥提，李珊，英提扎爾·艾合買提，等.野山杏果肉總有機(jī)酸的分離純化及其清除自由基能力的研究[J].食品科技，2017，42(5):219-223.

[11]國家藥典委員會(huì).中國藥典:2015年版：四部[S].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2015：86.

[12]熊靜悅，周幀昊，趙璐，等.脂肪乳劑建立高脂血癥模型小鼠的比較研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24(8):1507-1508．

[13]閆小玲.洛伐他汀聯(lián)合復(fù)方丹參滴丸治療高血脂并冠心病療效分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2015，21(3):139-140.

[14]尹若熙，薛光輝，李樹民，等.沙棘黃酮與阿托伐他汀聯(lián)用對實(shí)驗(yàn)性高脂金黃地鼠高血脂相關(guān)指標(biāo)及肝臟形態(tài)的影響[J].西北藥學(xué)雜志，2013，28(6):599-602.

[15]王誼，呂昊宇，蔣建勤.藥物治療高脂血癥的作用機(jī)制[J].西北藥學(xué)雜志，2012，27(2):188-190.

[16]張華，李建瑛，阿依姑麗·艾合麥提.野山杏果肉的保肝作用及其對高脂血癥小鼠血脂的影響[J].華西藥學(xué)雜志，2011，26(4):333-335.

[17]陳修，陳維洲，曾貴云.《心血管藥理學(xué)》第二版簡介[J].Ball Med Res,2000，29(12)：18740.

[18]成龍，梁日欣，楊濱，等.紅花提取物對高脂血癥大鼠降脂和抗氧化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12(9)：25-27.

[19]陳君，楊光，劉文群.小鼠抗衰老實(shí)驗(yàn)及微生物抗衰老研究概況[J].中國釀造，2011，(6):13-16.

[20]胡文兵，趙靜，陳婷婷，等.青錢柳多糖對高脂血癥小鼠的降血脂作用及機(jī)制初探[J].現(xiàn)代食品科技，2015，31(11):39-44.