李秋澤，趙成光

肺癌在所有惡性腫瘤發(fā)病率中占20%［1］，由于其能通過(guò)種種原因逃逸免疫機(jī)制監(jiān)視［2］，所以也是歷年來(lái)難以緩解、復(fù)發(fā)率最高的癌癥。常規(guī)治療肺癌的方法如化療、手術(shù)雖有一定成效［3，4］，但是多發(fā)患者隨治療時(shí)間增長(zhǎng)的獲得耐藥性與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移病灶無(wú)法根除等情況，總有效果并不如人意，肺癌患者三年以內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)80%［5］，五年以內(nèi)復(fù)發(fā)率為10%。調(diào)查患者生存曲線發(fā)現(xiàn)，肺癌患者三年生存率為 36%，五年生存率低至15%［6］，中位生存期穩(wěn)定在30個(gè)月［7］。為了解決這一狀況，免疫治療方法［8］逐漸進(jìn)入肺癌治療領(lǐng)域。T細(xì)胞為殺滅腫瘤細(xì)胞［9］主要參與者，腫瘤細(xì)胞表面 PD-L 分子［10］表達(dá)程度會(huì)影響T細(xì)胞的分化生成。所以筆者觀察PD-L1在肺癌細(xì)胞株表面表達(dá)情況，以及其對(duì)T細(xì)胞的影響程度，從而為肺癌的免疫治療方法提供有效可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECKMAN COULTER公司），用于流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分選；T細(xì)胞分選試劑盒（美國(guó)BECKMAN COULTER公司）用于分選人體外周靜脈血T淋巴細(xì)胞;24孔與96孔培養(yǎng)板（美國(guó)COSTAR公司）依次用于PHA與肺癌細(xì)胞株與Treg細(xì)胞共同培養(yǎng);倒置顯微鏡（中國(guó)OLYMPUS公司）觀測(cè)活化細(xì)胞、拍照，用于檢測(cè)最適PHA濃度；健康人的外周靜脈血SPCA-1、H1299、A549三種肺癌細(xì)胞株 （美國(guó) ATCC公司），熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞無(wú)污染后，用于肺癌細(xì)胞株與外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L1在肺癌細(xì)胞上的表達(dá)

選取三種肺癌細(xì)胞株生長(zhǎng)速率最高的時(shí)期，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收集外壁生長(zhǎng)的細(xì)胞株，用PBS（磷酸鹽緩沖液）離心洗滌2次后再用緩沖液將細(xì)胞重懸，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD-L1的表達(dá)水平。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 活化因子PHA最適濃度 通過(guò)常規(guī)分離Ficooll法［11］分離人體外周靜脈血單核細(xì)胞后再通過(guò)免疫磁珠法［12］分選出來(lái)的 T 淋巴細(xì)胞與 0、5、10、15、20（μg/ml）共 5個(gè)濃度梯度的 PHA 置于 24孔培養(yǎng)板共同培養(yǎng)，72 h后倒置顯微鏡觀察，通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與細(xì)胞團(tuán)數(shù)量進(jìn)行評(píng)定，得出最適濃度。

1.3.2 肺癌細(xì)胞株與外周血Treg細(xì)胞的共同培養(yǎng)

以TGF-β （轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β）與PD-L1抑制素、TGF-β抑制素的存在與否設(shè)置實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組別設(shè)置為 1、2、3。實(shí)驗(yàn) 1 組：肺癌細(xì)胞株 X、Treg細(xì)胞、活化因子PHA；實(shí)驗(yàn)2組：肺癌細(xì)胞株X、Treg細(xì)胞、活化因子PHA、TGF-β；實(shí)驗(yàn)3組：肺癌細(xì)胞株X、活化因子PHA、PD-L1抑制素與TGF-β抑制素。最后通過(guò)流式細(xì)胞法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組分化的Treg細(xì)胞所占的總體比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定最終統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)后，運(yùn)用Graph Prism 5.0統(tǒng)計(jì)專用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用x±s表示，比較運(yùn)用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌細(xì)胞株表面PD-L1分子表達(dá)水平運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)對(duì)SPCA-1、H1299、A549三種肺癌細(xì)胞株表面的PD-L1分子表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)并繪制圖像，詳見(jiàn)圖1。

觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各肺癌細(xì)胞株P(guān)D-L1分子表達(dá)程度有所差異。SPCA-1表達(dá)率最高為 （98.5±1.1）%；H1299 次之為 （91.0±3.2）%；A549 最低，為（20.1±6.4）%，三組分別相比都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。由于SPCA-1肺癌細(xì)胞株中PD-L1分子表達(dá)水平最高，將此細(xì)胞株與Treg細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)。

2.2 肺癌細(xì)胞株表面PD-L1分子表達(dá)水平對(duì)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化生成的影響

圖1 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖示（三種細(xì)胞株）

2.2.1 不同濃度活化因子PHA對(duì)外周血Treg細(xì)胞的活化程度 通過(guò)倒置顯微鏡觀察得知，活化因子濃度為0 μg/ml時(shí)Treg細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)為單個(gè)離散型；隨著濃度的升高，Treg細(xì)胞逐漸出現(xiàn)明顯增值，細(xì)胞團(tuán)數(shù)量增加等情況?；罨蜃覲HA濃超過(guò)10 μg/ml時(shí)，細(xì)胞大量增殖同時(shí)出現(xiàn)大面積覆蓋的細(xì)胞凋零聚集而成的黑色細(xì)胞團(tuán)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)可知，活化因子PHA的最適濃度為10 g/ml。

2.2.2 共同培養(yǎng)Treg細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、2組對(duì)比發(fā)現(xiàn)：Treg細(xì)胞分化2組 （19.70%）多于1組（12.50%），證明TGP-β能夠提高Treg細(xì)胞分化生成比例，且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2、3組對(duì)比發(fā)現(xiàn)：2組 （19.70%）Treg細(xì)胞分化生成比例多于3組（6.20%），即PD-L1蛋白分子具有誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化生成的能力，與TGF-β同時(shí)存在發(fā)揮作用時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同作用，應(yīng)用抑制劑能夠顯著影響Treg細(xì)胞分化，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 詳見(jiàn)圖 2。

圖2 實(shí)驗(yàn)1、2、3的Treg細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，肺癌發(fā)病率在惡性腫瘤中占有比重越來(lái)越大，而且常發(fā)生在40歲以上有常年吸煙史的人群中。臨床表現(xiàn)為咯血、胸悶脹痛等癥狀，患者常常因此疲于運(yùn)動(dòng)、難以休息，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，危及生命健康?；煛⒎暖?、手術(shù)為常用的肺癌治療方法，但由于治療緩解效率低、復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)大等情況，治療需要其他的可行治療方案配合或代替常規(guī)肺癌治療手段。腫瘤難以根除一大部分由于其能夠進(jìn)行免疫逃逸［13-15］，腫瘤細(xì)胞通過(guò)病原體持續(xù)性的中和抗原并突變，保持連續(xù)性感染，中和免疫機(jī)制的清除作用；病原體躲避在人體正常肺部細(xì)胞內(nèi)保持休眠，逃逸多重免疫機(jī)制的巡回監(jiān)視；病原體通過(guò)其本身的組成分子或分子結(jié)構(gòu)影響、阻止免疫機(jī)制的生成或者兩者保持拮抗?fàn)顟B(tài)。由此能夠增強(qiáng)患者自身免疫能力以及低不良反應(yīng)的新治療手段即免疫治療方法，進(jìn)入了肺癌治療領(lǐng)域。

該研究原理為：T細(xì)胞在APC（抗原呈遞細(xì)胞）表面的共刺激分子作用下大量增殖，其中一部分分化為CTL（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞），CTL與先前可識(shí)別的腫瘤細(xì)胞結(jié)合并將之殺傷裂解。T細(xì)胞增殖受T表面PD-1分子與APC細(xì)胞表面PD-L1控制，兩個(gè)共抑制分子結(jié)合抑制T細(xì)胞活化，控制免疫細(xì)胞增殖。而近些年研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1活躍表達(dá)于多種類實(shí)體腫瘤中：肺癌、卵巢癌、胰腺癌等。所以腫瘤細(xì)胞表面PD-L1分子的高度表達(dá)與PD-1分子的大量結(jié)合會(huì)使特異性免疫細(xì)胞凋亡，影響T細(xì)胞增殖分化，導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化。T細(xì)胞為殺滅腫瘤細(xì)胞的重要參與者，腫瘤細(xì)胞表面PD-L分子表達(dá)水平會(huì)影響T細(xì)胞的分化生成。所以通過(guò)本研究實(shí)驗(yàn)觀察PD-L1在肺癌細(xì)胞株表面表達(dá)情況，以及其對(duì)T細(xì)胞的影響程度，從而為肺癌的免疫治療方法提供有效可靠的依據(jù)。

綜上所述，PD-L1是誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化生成的重要影響因素之一，免疫治療可能是肺癌治療的有效可行方法。

參考文獻(xiàn)

［1］王維瓊.2016年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析［J］.臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2017（19）：3604.

［2］陳海，毛建平.腫瘤免疫逃逸與T淋巴細(xì)胞關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物工程雜志，2012（10）：86-92.

［3］白麗艷，祁玉娟.晚期非小細(xì)胞肺癌化療新進(jìn)展［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2016（7）：99-102.

［4］EMMANOUILIDES C，TRYFON S，BAKA S，et al.Operation for preservation of lung parenchyma in central lung cancer-in vivo and ex situ reimplantation techniques［J］.Anticancer Research，2015，35（3）：75-81.

［5］陳亮.局限性切除與肺葉切除治療Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌術(shù)后總生存期和復(fù)發(fā)率meta分析［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

［6］匡栩源，徐麗偉，林國(guó)強(qiáng)，等.1635例肺癌術(shù)后患者電話隨訪結(jié)果及預(yù)后分析［J］. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，（09）：895-900.

［7］高新.200例非小細(xì)胞肺癌術(shù)后生存率相關(guān)影響因素的分析［D］.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2016.

［8］鐘安媛.PD-1/PD-L1信號(hào)通路在肺癌中對(duì)Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用［D］. 蘇州：蘇州大學(xué)，2016.

［9］徐華，王丹波.誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與腫瘤免疫研究進(jìn)展［J］.免疫學(xué)雜志，2015（4）：353-357.

［10］陳成，穆傳勇，瞿秋霞，等.PD-L1分子在肺癌細(xì)胞株上的表達(dá)及其生物學(xué)意義［J］. 中國(guó)肺癌雜志，2009（8）：859-863.

［11］YING L，AHMED S，HARARI F，et al.Impact of Ficoll density gradient centrifugation on major and trace element concentrations in erythrocytes and blood plasma［J］.Journal of Trace Elements in Medicine&Biology，2015，29（S6/7）：249-254.

［12］JI JL，JIANG YZ，TANG QQ，et al.Detection of circulating tumor cells using a novel immunomagnetic bead method in lung cancer patients［J］.Journal of Clinical Laboratory Analysis，2016，30（5）：656.

［13］LAURENT C，CHARMPI K，GRAVELLE P，et al.Several immune escape patterns in non-Hodgkin's lymphomas［J］.Oncoimmunology，2015，4（8）：11-13.

［14］AUDET J，KOBINGER GP.Immune evasion in ebolavirus infections［J］.Viral Immunology，2015，28（1）：78.

［15］陶千山.IL-35誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞免疫逃逸的作用及機(jī)制［D］.合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2014.