楊雅玲， 吳 鋼， 胡志堅， 潘 浩， 魏慧星

幻覺既是抗帕金森病藥物的一種副作用，也是疾病后期的一種表現(xiàn)。從病理生理上看，幻覺可能與中腦邊緣系統(tǒng)多巴胺受體因藥物治療受到過度刺激，多巴胺/乙酰膽堿失衡及5-羥色胺能神經(jīng)元變化，尾狀核和殼核的谷氨酸、殼核的去甲腎上腺素代謝水平降低以及這些神經(jīng)遞質(zhì)相互作用有關(guān)。

N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl D-Aspartate，NMDA)受體亞基(GRIN1和GRIN2)表達改變可以調(diào)節(jié)谷氨酸能釋放，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺能的死亡，促進PD進展[1，2]。Lee等[3]在馬來西亞人群中發(fā)現(xiàn)GRIN2B rs7301328基因多態(tài)性與PD患者沖動控制和相關(guān)行為(Impulse Control and Related Behavior，ICRB)有關(guān)，研究表明CC基因型可能是ICRB的獨立危險因素。GRIN2B位于12號染色體上，參與大腦谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)傳遞[4]。多項研究表明GRIN2B rs7301328在亞洲人群中突變率高[5，6]，因此我們研究GRIN2B rs7301328基因多態(tài)性與PD相關(guān)幻覺是否存在關(guān)聯(lián)。SNCA(Alpha-Synuclein，SNCA)廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]。其正常功能尚未明瞭，但有證據(jù)表明它在神經(jīng)傳遞，突觸、神經(jīng)可塑性和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用，可以幫助調(diào)節(jié)多巴胺釋放。已有許多關(guān)于SNCA基因多態(tài)性與PD非運動癥狀的相關(guān)性研究[8]，中國學(xué)者也發(fā)現(xiàn)SNCA rs894278與RBD相關(guān)聯(lián)[9]，有關(guān)該位點與PD患者幻覺癥狀的遺傳多態(tài)性分析較為少見。

本課題研究GRIN2B rs7301328和SNCA rs894278位點突變在中國PD患者伴有幻覺和不伴幻覺者之間的分布特征，探討這2個基因位點變異是否與PD幻覺癥狀的遺傳易感性有關(guān)。

1 材料及方法

1.1 研究對象 100例受試者來自2014～2015 y福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診不伴癡呆且有連續(xù)就診的患者，所有患者均符合UK腦庫原發(fā)性帕金森病臨床診斷標準。幻覺的診斷依據(jù)美國神經(jīng)疾病與卒中協(xié)會(National Institute of Neurological Disease and Stroke，NINDS)和美國心理衛(wèi)生研究協(xié)會(National Institute of Mental Health，NIMH)制定的帕金森病精神病性障礙的標準[10]，為PD發(fā)生后接受多巴胺能藥物治療后出現(xiàn)；至少在診斷1 y后出現(xiàn)，幻覺癥狀反復(fù)發(fā)生，或持續(xù)1 m并排除其他疾病或非抗PD藥物所致的幻覺。其中幻覺組53例，無幻覺組47例。本研究根據(jù)首次幻覺出現(xiàn)的時間長短劃分幻覺早發(fā)型組和幻覺遲發(fā)型組，疾病持續(xù)時間不足5 y出現(xiàn)幻覺的劃為幻覺早發(fā)型組；達5 y及以上才出現(xiàn)幻覺的劃分為幻覺遲發(fā)型組，其中幻覺早發(fā)型組27例、幻覺遲發(fā)型組26例；設(shè)對照組：幻覺早發(fā)型對照組為PD發(fā)病5 y內(nèi)從沒出現(xiàn)過幻覺的PD患者，幻覺遲發(fā)型對照組為PD病程達8 y或以上從未出現(xiàn)過幻覺的PD患者。全部受試者均為中國漢族人群，來自于同一地域。本項研究獲得福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準。所有受試者均簽署了知情同意書。

1.2 基因檢測

1.2.1 GRIN2B多態(tài)分型檢測 用TIANamp Blood DNA Kit抽提全血DNA。引物序列：F：TTCTCCCTGCAGCCCCTTTTTA和R：CGACCCAAAGAGCATCATCACC。PCR反應(yīng)體系(10 μl)：包含1x HotStarTaq buffer，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase，1 μl樣本DNA和1 μl多重PCR引物。PCR循環(huán)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，11個循環(huán)；94 ℃變性20 s，59℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，24個循環(huán)；72 ℃最后延伸2 min，4 ℃保存。將得到的PCR產(chǎn)物純化后用SNaPshot進行多重單堿基延伸反應(yīng)。延伸引物序列：SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCCGTGGATGCCCAGGAT。將延伸產(chǎn)物純化后上ABI3730XL測序儀測序。編碼樣本進行基因分型確保對病例組和對照組未知。

1.2.2 SNCA多態(tài)分型檢測 引物序列：F：CTGGGTGAAATATGGCGGACAG和R：GGCCAATTCCCTATGCCAGAA C。延伸引物：SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGATAAACCATCCCACTT。后續(xù)步驟同GRIN2B多態(tài)分型檢測(見圖1、圖2)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 22.0軟件包進行統(tǒng)計分析，設(shè)定P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗利用SNaPshot SNP分型技術(shù)對100個樣本進行10個SNP位點分型。設(shè)4個分析模型，Condominant共顯性、Dominant顯性、Recessive隱性、Allele等位基因?qū)γ總€位點進行卡方分析。Logistic regression以單個位點為單位，按3個假設(shè)模型，Dominan (頻率低的等位基因為顯性)，Recessive(頻率低的等位基因為隱性)，Log-additive (疊加作用)進行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié) 果

2.1 臨床基線資料的比較 幻覺組臨床資料分析：幻覺組53例為46～86歲的PD患者，平均(68.55±8.77)歲，無幻覺組47例，33～76歲，平均(59.77±8.20)歲，幻覺組的年齡和起病年齡均較無幻覺組大(P<0.001；P<0.001)；總體比較，PD患者幻覺有男性優(yōu)勢，但兩組之間無顯著性差異(P=0.087)?；糜X組日常生活能力和運動能力均較無幻覺組差，差異有顯著性(P=0.013；P=0.028)。幻覺者伴慢性便秘較多(P<0.001)，而較少出現(xiàn)異動癥(P=0.003)(見表1)。

幻覺早發(fā)型組臨床資料分析：幻覺早發(fā)型組27例，46～79歲，平均(66.78±8.28)歲，其對照組73例，33～86歲，平均(63.55±9.88)歲，兩組的年齡無明顯差異(t=1.513，P=0.134)。幻覺早發(fā)型組的起病年齡較對照組大(P=0.001)；且疾病持續(xù)時間和治療持續(xù)時間均少于對照組(P<0.001；P<0.001)?；糜X早發(fā)型組伴便秘者較多(P=0.018)，且較少出現(xiàn)異動癥(P=0.006)(見表1) 。

幻覺遲發(fā)型組的臨床資料分析：幻覺遲發(fā)型組26例，53～86歲，平均(70.38±9.05)歲，其對照組19例，45～75歲，平均(59.21±7.52)歲，兩組比較年齡差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.385，P<0.001)?；糜X遲發(fā)型組的起病年齡也大于對照組(P<0.001)。與對照組相比，幻覺遲發(fā)型組男性患者居多(P=0.018)。此外，幻覺遲發(fā)型組日常生活能力和睡眠狀況均較對照組差(P=0.001；P=0.036)，且較少出現(xiàn)異動癥(P<0.001)(見表1)。

2.2 基因多態(tài)性 GRIN2B rs7301328和SNCA rs894278的基因型及等位基因頻率在幻覺組、幻覺早發(fā)型組、幻覺遲發(fā)型組與各自的對照組之間均無顯著差異(見表2、表3)。GRIN2B和SNCA 的基因頻率在三組中的分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)(除了SNCA 在幻覺遲發(fā)型組及其對照組中考慮受樣本量影響出現(xiàn)偏差，P=0.003)，提示研究對象來自大的群體，受自然選擇等因素影響小，資料可靠。

2.3 關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 幻覺組與無幻覺組(見表4) 在Logistic regression校正幻覺組與無幻覺組之間具有顯著差異的年齡、起病年齡、UPDRS-Ⅱ和UPDRS-Ⅲ這些對幻覺癥狀產(chǎn)生有影響的因素后，在隱性模型和疊加模型下，GRIN2B rs7301328的GG基因型是PD相關(guān)幻覺的保護因素(OR’=0.246，95%CI[0.071～0.848]，P’=0.026)；OR’=0.432，95%CI[0.208～0.895]，P’=0.024)，而在顯性模型下未發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)性(P’=0.132)。SNCA rs897278在三種遺傳模型下校正后與PD相關(guān)幻覺風險無顯著關(guān)聯(lián)(P’=0.250；P’=0.078；P’=0.074)。

2.3.2 幻覺早發(fā)型組與幻覺早發(fā)型對照組(見表5) 在Logistic regression校正幻覺早發(fā)型組及其對照組之間具有顯著差異的起病年齡、病程及治療持續(xù)時間，在隱性模型下，SNCA rs894278 的GG基因型是PD幻覺早發(fā)型發(fā)生幻覺的危險因素(OR’=8.281，95%CI[1.217～56.334]，P’=0.031)，而在顯性模型及疊加模型下未發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)(P’=0.998，P’=0.253)。GRIN2B rs7301328在三種遺傳模型下校正后與PD幻覺早發(fā)型的幻覺風險無顯著關(guān)聯(lián)(P’=0.637；P’=0.901；P’=0.817)。

2.3.3 幻覺遲發(fā)型組與幻覺遲發(fā)型對照組(見表6) 在Logistic regression校正幻覺遲發(fā)型組及其對照組之間具有顯著差異的年齡、性別、起病年齡及UPDRS-Ⅱ后，在3種遺傳模型下均沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)的基因多態(tài)性增加幻覺的風險(GRIN2B rs7301328：P’=0.724，P’=0.095，P’=0.213；SNCA rs894278：P’=0.994，P’=0.129，P’=0.212)。

表1 PD患者幻覺組與無幻覺組、幻覺早發(fā)型及其對照組、幻覺遲發(fā)型及其對照組的臨床參數(shù)比較

注：定量資料用t/t’檢驗；分類資料用χ2檢驗/Fisher確切概率法檢驗。各個因素所對應(yīng)的統(tǒng)計值右上方標有*，表示幻覺組和無幻覺組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；標有△，表示幻覺早發(fā)型組及其對照組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；標有#，表示幻覺遲發(fā)型組及其對照組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用雙側(cè)檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義

表2 幻覺組、幻覺早發(fā)型和幻覺遲發(fā)型組與各自對照組GRIN2B 基因多態(tài)性分布

注：右上方標有*號表示用Fisher確切概率法檢驗

表3 幻覺組、幻覺早發(fā)型和幻覺遲發(fā)型組與各自對照組的SNCA 基因多態(tài)性分布

注：右上方標有*號表示用Fisher確切概率法檢驗

表4 幻覺組與無幻覺組PD患者的基因型多態(tài)性

注：Dominan：(突變純合+突變雜合)VS野生純合；Recessive：突變純合VS(突變雜合+野生純合)；Additive：突變純合VS野生純合；CrudeOR(95%CI)和P值為用原始Logisticregression分析基因型與幻覺關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計值和95%可信區(qū)間；Adj-OR’(95%CI)和Adj-P’值為校正年齡、起病年齡、UPDRS-Ⅱ和UPDRS-Ⅲ后的統(tǒng)計參數(shù)和95%可信區(qū)間

表5 早發(fā)幻覺組與早發(fā)幻覺對照組PD患者的基因型多態(tài)性

注：Dominan：(突變純合+突變雜合)VS野生純合；Recessive：突變純合VS(突變雜合+野生純合)；Additive：突變純合VS野生純合；CrudeOR(95%CI)和P值為用原始Logisticregression分析基因型與幻覺關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計值和95%可信區(qū)間；Adj- OR’(95%CI)和Adj-P’為校正起病年齡、病程、治療持續(xù)時間后的統(tǒng)計參數(shù)和95%可信區(qū)間

表6 遲發(fā)幻覺組與遲發(fā)幻覺對照組PD患者的基因型多態(tài)性

注：Dominan：(突變純合+突變雜合)VS野生純合；Recessive：突變純合VS(突變雜合+野生純合)；Additive：突變純合VS野生純合；CrudeOR(95%CI)和P值為用原始Logisticregression分析基因型與幻覺關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計值和95%可信區(qū)間；Adj- OR’(95%CI)和Adj-P’為校正年齡、性別、起病年齡、UPDRS-Ⅱ后的統(tǒng)計參數(shù)和95%可信區(qū)間

圖1 GRIN2B rs7301328位點檢測圖

圖2 SNCA rs894278位點檢測圖

3 討 論

有將近1/3長期接受多巴胺能治療的PD患者會出現(xiàn)幻覺癥狀，以視幻覺多見，有報道PD患者視幻覺占全部幻覺類型的90%以上[11，12]。在PD診治的臨床實踐中我們常常會發(fā)現(xiàn)有些患者由于出現(xiàn)精神異常，即使調(diào)整各種藥物也很難避免，從而導(dǎo)致治療失敗，這些患者在遺傳基因上具有什么特質(zhì)這是我們開展本課題研究的思考背景。

隨著PD持續(xù)時間的進展，許多PD患者最終也會出現(xiàn)幻覺癥狀。不能排除入選PD非幻覺者的成員隨著疾病進展出現(xiàn)幻覺的可能，為此，我們將不伴幻覺的PD對照組中病程少于5y的排除(至2015年)，以免降低檢驗效能。此外，我們還根據(jù)幻覺始發(fā)時的病程將幻覺組分為幻覺早發(fā)型組和幻覺遲發(fā)型組兩個亞組以便進行進一步研究。

綜合三組臨床基線資料比較分析(見表1)，年齡大和起病年齡大者易出現(xiàn)幻覺，幻覺癥狀受日常生活能力和運動能力的影響，而幻覺遲發(fā)癥狀還受睡眠狀況影響。幻覺者伴慢性便秘和伴高血壓者較多，而較少出現(xiàn)異動癥，考慮差異是因為年齡亦是慢性便秘和高血壓的危險因素，而異動癥多見于年輕起病的PD患者[13]。因此，PD患者的幻覺癥狀除了與年齡、病程、抗PD藥物劑量這些常常描述PD特征的因素有關(guān)，還受到起病年齡、日常生活能力、運動能力及睡眠質(zhì)量的影響。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)GRIN2Brs7301328的等位基因及基因型頻率在3個對照組之間均無顯著差異(見表2)。然而在調(diào)整混雜因素后我們發(fā)現(xiàn)GG基因型是PD相關(guān)幻覺的保護因素(見表4)。我們的研究首次報道了GRIN2Brs7301328多態(tài)性與PD患者幻覺風險相關(guān)，我們推測可能是由于CC基因型導(dǎo)致SNP中其他功能性變異以致連鎖失衡。此外，NMDA受體亞基GRIN2B還被發(fā)現(xiàn)與酒精依賴(rs1806201)[14]、精神分裂癥和雙相情感障礙(rs1019385)[15]有關(guān)，表明谷氨酸信號通路參與調(diào)節(jié)情感性精神障礙[16，17]。然而在這些研究中發(fā)現(xiàn)GRIN2B基因突變增加精神疾病風險。從病理生理上看，雙相情感障礙和精神癥狀可能與中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平的改變和NMDAR在患者的表達、分布以及功能減少有關(guān)[18，19]。因此，參與NMDA受體通路的基因可能影響情感障礙和精神癥狀。

SNCArs894278在三個對照組間的等位基因及基因型頻率也均無顯著差異(見表3)。然而在調(diào)整混雜因素后我們發(fā)現(xiàn)SNCArs894278位點增加PD患者早發(fā)幻覺風險(見表5)。1997年時研究發(fā)現(xiàn)SNCA基因突變引起帕金森病[20，21]。大多數(shù)研究表明SNCA突變常見于幻覺早發(fā)型帕金森病，且患者多表現(xiàn)為各種非運動癥狀，如自主神經(jīng)功能異常、RBD(快速眼動睡眠行為障礙)、幻覺(視幻覺多見)和認知功能障礙。只有少數(shù)病例表現(xiàn)為PD的典型表現(xiàn)，以致誤診為多系統(tǒng)萎縮[22]。我們的發(fā)現(xiàn)對于協(xié)助診斷以非運動癥狀中幻覺早期出現(xiàn)的幻覺早發(fā)型帕金森病有益。當然，我們需要更多良好匹配的大樣本來準確判斷基因型與表型的相關(guān)性。

結(jié)論：在中國人不伴癡呆帕金森病人群中，GRIN2Brs7301328的GG基因型可能是PD相關(guān)幻覺的保護因素。而SNCArs894278的GG基因型可能是幻覺早發(fā)型PD患者發(fā)生幻覺的危險因素。

[參考文獻]

[1]MandelS，GrunblattE，MaorG，etal.EarlyandlategenechangesinMPTPmicemodelofParkinson’sdiseaseemployingcDNAmicroarray[J].NeurochemicalResearch，2002，27：1231-1243.

[2]MartiM，MelaF，BianchiC，etal.Striataldopamine-NMDAreceptorinteractionsinthemodulationofglutamatereleaseinthesubstantianigraparsreticulatainvivo：oppositeroleforD1andD2receptors[J].Neurochemical，2002，83：635-644.

[3]LeeJY，LeeEK，ParkSS，etal.AssociationofDRD3andGRIN2BwithimpulsecontrolandrelatedbehaviorsinParkinson’sdisease[J].MoventDisorder，2009，24：1803- 1810.

[4]HessS，DaggettL，CronaJ，etal.CloningandfunctionalcharacterizationsofhumanheteromericN-methyl-D-aspartatereceptor[J].PharmacologyandExperimentalTherapeutics，1996，278：808-816.

[5]LiouYJ，WangYC，ChenJY，etal.AssociationanalysisofpolymorphismsintheN- -methyl-D-aspartate(NMDA)receptorsubunit2B(GRIN2B)geneandtardivedyskine-siainschizophrenia[J].PsychiatryResearch，2007，153：271-275.

[6]OhtsukiT，SakuraiK，DouH，etal.MutationanalysisoftheNMDAR2B(GRIN2B)geneinschizophrenia[J].MolecularPsychiatry，2001，6：211-216.

[7]SolanoSM，MillerDW，AugoodSJ，etal.Expressionofalpha-synuclein，parkinandubiquitincarboxy-terminalhydrolaseL1mRNAinhumanbrain：genesassociatedwithfamilialParkinson’sdisease[J].AnnalsofNeurology，2000，47(2)：201-210.

[8]ChaudhuriKR，TolosaEduardo，SchapiraHV.Non-MotorSymptomsofParkinson’sDisease[J].LancetNeurology，2006，5(3)：235-245.

[9]吳國平，萬大勇，康文巖，等.α-突觸核蛋白基因多態(tài)性與帕金森病非運動癥狀的關(guān)聯(lián) [J]. 中華神經(jīng)科雜志，2015，48(10)：870-875.

[10]RavinaB，MarderK，F(xiàn)ernandezHH，etal.DiagnosticcriteriaforpsychosisinParkinson’sdisease：reportofanNINDS，NIMHworkshop[J].MovDisord，2007，22：1062-1068.

[11]CummingsJL.NeuropsychiatriccomplicationsofdrugtreatmentofParkinson'sdisease,inParkinson’sDisease:NeurobehavioralAspects[M].NewYork：OxfordUniversitypress，USA，1992. 313-327.

[12]RamosS，OrtollJR，PaulsonGW.VisualhallucinationsassociatedwithParkinson’sdisease[J].ArchivesofNeurology，1996，53：1265-1268.

[13]MiocinovicS，SomayajulaS，ChitnisS，etal.History，applicationa，andmechanismsofdeepbrainstimulation[J].JAMANeurol，2013，70(2)：29-34.

[14]KimJH，ParkM，YangSY，etal.AssociationstudyofpolymorphismsinN-methyl-D-aspartatereceptor2Bsubunits(GRIN2B)genewithKoreanalcoholism[J].NeuroscienceResearch，2006，56：220-223.

[15]LiD，HeL.AssociationstudybetweentheNMDAreceptor2Bsubunitgeneandschizophrenia：AHugereviewandmeta-analysis[J].GeneteticMedcine，2007，9：4-8.

[16]MundoE，TharmalinghamS，NevesPereiraM，etal.EvidencethattheN-methyl-D-aspartatesubunit1receptorgene(GRIN1)conferssusceptibilitytobipolardisorder[J].MolecularPsychiatry，2003，8(2)：241-245.

[17]FallinMD，LasseterVK，AvramopoulosD，etal.Bipolardisorderandschizophrenia：a440-singlenucleotidepolymorphismscreenof64candidategenesamongAshkenaziJewishcase-parenttrios[J].AmericanJournalHumanGenetic，2005，77：918-936.

[18]CoyleJT.Theglutamatergicdysfunctionhypothesisforschizophrenia[J].HarvardReviewofPsychiatry，1996，3(5)：241-253.

[19]JavittDC，ZukinSR.Recentadvancesinthephencyclidinemodelofschizophrenia[J].TheAmericanJournalofPsychiatry，1991，148(10)：1301-1308.

[20]SingletonAB，F(xiàn)arrerM，JohnsonJ，etal.Alpha-SynucleinlocustriplicationcausesParkinson’sdisease[J].Science，2003，302(5646)：841.

[21]DudaJE，GiassonBI，MabonME，etal.ConcurrenceofalphasynucleinandtaubrainpathologyintheContursikindred[J].ActaNeuropathologica，2002，104(1)：7-11.

[22]KonnoT，RossOA，PuschmannA，etal.AutosomaldominantParkinson’sdiseasecausedbySNCAduplications[J].ParkinsonismRelatateDisorder，2016，22：S1-S6.