黃惠英， 鄭 輝， 楊 樹， 劉 丹， 郭富強(qiáng)

近年來(lái)，頸動(dòng)脈支架成形術(shù)(carotidartery angioplasty and stenting，CAS)已廣泛應(yīng)用于頸動(dòng)脈狹窄治療。同時(shí)，人們也認(rèn)同頸動(dòng)脈支架成形術(shù)治療頸動(dòng)脈狹窄的安全性和有效性[1]。但是，頸動(dòng)脈支架成形術(shù)術(shù)后6 m內(nèi)有約20%～30%患者出現(xiàn)血管內(nèi)再狹窄，遠(yuǎn)期觀察血管內(nèi)再狹窄機(jī)率更高。有研究表明血管成形術(shù)后血管再狹窄多好發(fā)于術(shù)后3～6 m，嚴(yán)重影響該手術(shù)方式遠(yuǎn)期療效[2]。

新生內(nèi)膜形成在血管成形術(shù)后再狹窄的形成過(guò)程中起著重要作用[2]，而VSMCs(血管平滑肌細(xì)胞vascular smooth muscle cells，VSMCs)從中膜向內(nèi)膜遷移是新生內(nèi)膜形成的一個(gè)關(guān)鍵原因。在VSMCs遷移的過(guò)程中，細(xì)胞通過(guò)表達(dá)包括基質(zhì)金屬蛋白酶、組織蛋白酶等多種蛋白酶降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)和內(nèi)彈力板，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞遷移[3]。已有細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明組織蛋白酶主要由單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞和活化的平滑肌細(xì)胞分泌[4]；降解彈性組織的活性主要依賴于組織蛋白酶，這些實(shí)驗(yàn)還表明組織蛋白酶在平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的粘附、增殖和遷移過(guò)程中都發(fā)揮了重要作用，而這些過(guò)程都發(fā)生在血管成形術(shù)后血管重塑過(guò)程中，阻滯這些酶的表達(dá)可能降低ECM的降解和積聚，從而降低血管成形術(shù)后再狹窄形成的程度和進(jìn)程。組織蛋白酶能分解彈力蛋白，在動(dòng)脈粥樣硬化及其斑塊不穩(wěn)定性中的作用目前已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，然而在血管成形術(shù)后再狹窄血管重塑中的作用尚不清楚。組織蛋白酶S (Cathepsin S，CatS)能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)多種成分降解[5]，具有顯著的彈力纖維和膠原纖維水解活性，可以長(zhǎng)時(shí)間在中性條件下保持蛋白水解活性，并參與各種生理病理過(guò)程。因此，Cat S具有在細(xì)胞內(nèi)外發(fā)揮更大生理功能潛力[6]。已有研究表明[7，8]，在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷和兔頸動(dòng)脈球囊損傷加高脂飲食飼養(yǎng)后，血管壁Cat S明顯表達(dá)。這些研究提示Cat S在新生內(nèi)膜形成中發(fā)揮重要作用。但是，血管成形術(shù)后再狹窄中研究很少，特別是支架置入術(shù)后再狹窄研究，目前國(guó)內(nèi)外尚未有相關(guān)報(bào)道。

Cat S及其抑制劑在AS中的作用已廣泛受到人們關(guān)注。Matsumoto等[9]首先報(bào)道了Rho激酶在再狹窄和Rho激酶抑制劑法舒地爾在防治再狹窄中的潛在效果，該研究表明在支架置入術(shù)后28 d，法舒地爾能顯著抑制支架置入部位巨噬細(xì)胞聚集、膠原蛋白沉積。有研究表明[4]，Cat S主要由單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞和活化的平滑肌細(xì)胞分泌，法舒地爾是否可以通過(guò)抑制Cat S的表達(dá)，從而抑制新生內(nèi)膜的形成，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性比格犬12只，硫酸氫氯吡格雷片、鹽酸法舒地爾注射液等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 雄性比格犬12只，隨機(jī)分為A組(假手術(shù)組n=4，經(jīng)前期假手術(shù)處理)，B組(裸支架組n=4，經(jīng)前期頸動(dòng)脈粥樣硬化狹窄造模)，C組(裸支架+fasudil組n=4，經(jīng)前期頸動(dòng)脈粥樣硬化狹窄造模)。在支架置入術(shù)前24 h及支架置入術(shù)后1 w喂食阿司匹林腸溶片300 mg/d，氯吡格雷片25 mg/d，之后改為喂食阿司匹林腸溶片100 mg/d，氯吡格雷片25 mg/(d·只)，直至取血管標(biāo)本。所有實(shí)驗(yàn)比格犬在造模后高脂飲食喂養(yǎng)2 m后進(jìn)行造影檢查，并將8枚金屬裸支架置入B組和C組的比格犬頸總動(dòng)脈最狹窄處。 C組在支架置入后2 h開始給予靜脈輸注法舒地爾，共7 d，其余組均給予同等劑量的生理鹽水靜脈滴注。在支架置入后7 d，2 m時(shí)對(duì)A組、B組和C組比格犬進(jìn)行頸動(dòng)脈彩超檢查，了解頸動(dòng)脈狹窄程度及支架置入后頸動(dòng)脈情況。最后取血管標(biāo)本進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 頸動(dòng)脈的結(jié)果分析 將取出的血管行石蠟包埋，顯微鏡下觀察，新生內(nèi)膜組織完整者可作為分析對(duì)象。通過(guò)HE染色和彈力纖維染色病理形態(tài)學(xué)，分析了解頸動(dòng)脈支架置入后再狹窄情況；RT-PCR檢測(cè)比格犬頸動(dòng)脈中CatS mRNA表達(dá)情況；免疫組化觀察血管中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達(dá)情況；通過(guò)彩超與DSA檢測(cè)血管的內(nèi)徑和斑塊情況，了解血管的狹窄情況和支架的安置情況。

2 結(jié) 果

2.1 DSA數(shù)據(jù)分析 支架置入術(shù)前DSA顯示，B組和C組管腔狹窄率顯著高于A組(P<0.05)，B組狹窄率和C組相似(P>0.05)。支架置入后2 mDSA示A組管腔光滑，無(wú)狹窄形成，B組狹窄率顯著大于C組(P<0.05)(見(jiàn)圖1，表1)。

2.2 比格犬頸動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)的變化

2.2.1 HE染色 光鏡下A組(假手術(shù)組)比格犬頸動(dòng)脈中膜由3～5層環(huán)行排列的彈性膜和平滑肌細(xì)胞組成，外膜由結(jié)締組織組成，內(nèi)彈力膜呈波浪狀，內(nèi)膜僅內(nèi)襯單層內(nèi)皮細(xì)胞，無(wú)新生內(nèi)膜形成。與假手術(shù)組相比，B組、C組中膜平滑肌細(xì)胞層稍紊亂，內(nèi)膜增生明顯，新生內(nèi)膜內(nèi)可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞(見(jiàn)圖2)。

2.2.2 彈力纖維染色結(jié)果分析 A組血管無(wú)新生內(nèi)膜形成，B、C組血管見(jiàn)大量新生內(nèi)膜形成，B組新生內(nèi)膜厚度、面積、狹窄率均大于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。結(jié)合HE染色結(jié)果，可以看出新生內(nèi)膜中細(xì)胞的成分較少，主要為細(xì)胞外基質(zhì)成分(見(jiàn)圖3、表2)。

2.3 比格犬頸動(dòng)脈支架置入后2 m時(shí)Cat S mRNA的表達(dá)的比較 支架置入后2 m時(shí)頸動(dòng)脈RT-PCR示Cat S mRNA在A組中有少量表達(dá)，而在B組和C組中表達(dá)水平明顯升高，且和A組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組和C組比較，B組Cat S mRNA表達(dá)水平明顯高于C組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖4)。

2.4 免疫組化結(jié)果分析

2.4.1 頸動(dòng)脈α-SMA的免疫組化表現(xiàn) A組表現(xiàn)為中膜α-SMA染色陽(yáng)性較多，無(wú)新生內(nèi)膜形成。 B、C組中膜中膜和新生內(nèi)膜上均可見(jiàn)α-SMA染色陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞，表明平滑肌細(xì)胞突破基底膜，遷移到內(nèi)彈力膜外增殖，是新生內(nèi)膜的主要組成細(xì)胞(見(jiàn)圖5)。α-SMA新生內(nèi)膜平均光密度值檢測(cè)結(jié)果示：B組新生內(nèi)膜中α-SMA平均光密度值高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表3)。

2.4.2 頸動(dòng)脈PCNA的免疫組化表現(xiàn) A組PCNA免疫組化陽(yáng)性染色顆粒表達(dá)偶見(jiàn)于血管外膜，中膜表達(dá)較少。B、C組在支架周圍及新生內(nèi)膜中PCNA陽(yáng)性表達(dá)較多(見(jiàn)圖5)。新生內(nèi)膜PCNA平均光密度值結(jié)果顯示B組新生內(nèi)膜上PCNA高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)各指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，Cat S mRNA與α-SMA、PCNA、內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)。

a：支架置入術(shù)前DSA示管腔明顯狹窄；b：支架置入術(shù)后10 min DSA示狹窄解除

圖1 支架置入前后DSA檢查結(jié)果

注：I：代表內(nèi)膜；M：代表中膜。a：A組血管未見(jiàn)新生內(nèi)膜形成；b：B組血管見(jiàn)新生內(nèi)膜形成；c：C組血管見(jiàn)新生內(nèi)膜形成

圖2 各組支架置入后2 m血管HE染色(×40倍)

注：I：代表內(nèi)膜；M：代表中膜 標(biāo)尺為100 μm。a：A組血管未見(jiàn)新生內(nèi)膜形成；b：B組血管見(jiàn)新生內(nèi)膜形成；c：C組血管見(jiàn)新生內(nèi)膜形成

圖3 各組支架置入后血管2 m彈力纖維染色(×40倍)

注：A組代表假手術(shù)組，B組代表裸支架組，C組代表裸支架+fasudil組。A組相比*P<0.05；與C組相比#P<0.05。

圖4：各組支架置入后2 m比格犬頸動(dòng)脈Cat S mRNA值

注：I：代表內(nèi)膜；M：代表中膜。a：A組可見(jiàn)中膜α-SMA染色陽(yáng)性；b：B組中膜和內(nèi)膜上可見(jiàn)α-SMA染色陽(yáng)性；c：C組中膜和內(nèi)膜上可見(jiàn)α-SMA染色陽(yáng)性；d：A組中膜上未見(jiàn)PCNA染色陽(yáng)性；e：B組內(nèi)膜上可見(jiàn)PCNA染色陽(yáng)性；f：C組內(nèi)膜上可見(jiàn)PCNA染色陽(yáng)性

圖5 支架置入2 m后血管α-SMA和PCNA免疫組化(×200倍)

注：A組代表假手術(shù)組，B組代表裸支架組，C組代表裸支架+fasudil組。*代表P值A(chǔ)組VS B組，#代表P值A(chǔ)組 VS C組，&代表P值B組 VS C組。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表2 支架置入后2 m病理形態(tài)學(xué)分析

注：A組代表假手術(shù)組，B組代表裸支架組，C組代表裸支架+fasudil組。*代表P值A(chǔ)組 VS B組，#代表P值A(chǔ)組 VS C組，&代表P值B組 VS C組。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。標(biāo)尺為100 μm

組別α-SMAPCNAA(n=4)B(n=4)C(n=4)F值P值0.000±0.000927.417±157.767468.000±168.01848.5760.000*0.001#0.001&0.000±0.000242.833±68.650110.083±69.30118.6450.000*0.022#0.009&

注：A組代表假手術(shù)組，B組代表裸支架組，C組代表裸支架+fasudil組。*代表P值A(chǔ)組VS B組，#代表P值A(chǔ)組VS C組，&代表P值B組VS C組。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討 論

目前，對(duì)支架置入后再狹窄的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，大多是以血管球囊損傷術(shù)為基礎(chǔ)，支架與血管中層直接接觸[10]，而在人類患者中支架則與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊直接接觸。因此，既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究不能很好的模擬臨床中支架置入術(shù)后再狹窄病理生理變化過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比格犬進(jìn)行頸總動(dòng)脈粥樣硬化狹窄造模后置入支架，研究支架置入后比格犬頸動(dòng)脈Cat S表達(dá)情況，以及法舒地爾對(duì)Cat S表達(dá)的影響，為支架置入后再狹窄的防治提供了新思路。

法舒地爾于1995在日本首次被批準(zhǔn)用于臨床的Rho激酶抑制劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制ATP與Rho激酶結(jié)合選擇性抑制Rho激酶活性[11]。目前已有研究表明，法舒地爾可通過(guò)多種機(jī)制參與抑制支架術(shù)后內(nèi)膜形成，包括抑制血管炎性反應(yīng)、抑制VSMCs增殖和遷移、增加凋亡，以及減少膠原蛋白沉積等[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在支架置入后急性期靜脈輸注法舒地爾干預(yù)支架置入后的再狹窄進(jìn)程，對(duì)支架置入后2 m DSA和頸動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)的結(jié)果分析表明，B組(裸支架組)再狹窄率顯著高于C組(裸支架+fasudil組)，表明法舒地爾可以抑制支架置入后再狹窄的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與既往研究結(jié)果類似，進(jìn)一步提示法舒地爾可以抑制支架術(shù)后再狹窄進(jìn)程。

支架置入后再狹窄的形成主要由新生內(nèi)膜增生所致[13]。動(dòng)物模型和人類尸檢表明血管支架置入后的病理生理機(jī)制和傷口愈合的病理生理機(jī)制相似[14]。傷口愈合的過(guò)程劃分為3個(gè)過(guò)程：炎性反應(yīng)(數(shù)小時(shí)至數(shù)天)，肉芽形成或細(xì)胞增殖階段(數(shù)天至數(shù)周)，以及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑(數(shù)月)[14]。既往研究[15]表明，血管損傷后形成的新生內(nèi)膜中，細(xì)胞外基質(zhì)占89%，細(xì)胞僅占11%。 本實(shí)驗(yàn)頸動(dòng)脈HE染色和彈力纖維染色結(jié)果表示，假手術(shù)組內(nèi)彈力膜外僅覆蓋單層內(nèi)皮細(xì)胞，而支架置入2 m后的B組(裸支架組)和C組(裸支架+fasudil組)頸動(dòng)脈內(nèi)彈力膜外均可見(jiàn)新生內(nèi)膜形成，其中細(xì)胞的含量較少，主要成分為膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，這與既往的研究結(jié)果一致。且B組的新生內(nèi)膜厚度及面積均大于C組，表明法舒地爾可以通過(guò)抑制新生內(nèi)膜的形成來(lái)抑制再狹窄的形成進(jìn)程。

再狹窄形成過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵的機(jī)制是VSMC分化缺失，使之成為能夠增殖和遷移的平滑肌細(xì)胞[13]。血管平滑肌細(xì)胞在出生后保持著顯著的血管可塑性功能，能由收縮型轉(zhuǎn)化為分泌型。對(duì)人類PTCA術(shù)后再狹窄血管的研究[13]顯示，新生內(nèi)膜中主要是α-SMA陽(yáng)性的VSMCs，這些細(xì)胞周圍富含以蛋白聚糖為主的ECM。本實(shí)驗(yàn)免疫組化染色的結(jié)果表明，A、B、C組血管的中膜上均可見(jiàn)大量α-SMA染色陽(yáng)性的細(xì)胞，而A組內(nèi)彈力膜外未見(jiàn)α-SMA染色陽(yáng)性，而B組和C組的新生內(nèi)膜上均可見(jiàn)α-SMA染色陽(yáng)性細(xì)胞，表明支架置入后平滑肌細(xì)胞突破了內(nèi)彈力膜，遷移至內(nèi)彈力膜外，同時(shí)分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致新生內(nèi)膜的形成。PCNA在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)中起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)；檢測(cè)其在細(xì)胞中的表達(dá)，可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)，且與內(nèi)膜增生程度有關(guān)，是判斷內(nèi)膜增殖程度的有效指標(biāo)[16]。本實(shí)驗(yàn)的PCNA免疫組化染色結(jié)果表明，A組血管中PCNA表達(dá)較少，而B組和C組血管的中膜和內(nèi)膜上可見(jiàn)PCNA陽(yáng)性染色，尤其是新生內(nèi)膜上陽(yáng)性染色的細(xì)胞顆粒較多。對(duì)新生內(nèi)膜中α-SMA和PCNA的陽(yáng)性染色光密度值的結(jié)果分析可見(jiàn)，B組的α-SMA和PCNA光密度值高于C組。相關(guān)性分析表明，α-SMA、PCNA與新生內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)，表明fasudil可以通過(guò)抑制支架置入后平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖，進(jìn)而抑制新生內(nèi)膜的形成和再狹窄的進(jìn)程，這與既往研究結(jié)果一致。

Cat S是木瓜蛋白酶超家族成員，具有較強(qiáng)的彈性纖維和膠原纖維溶解活性。Cat S能降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，層粘連蛋白、纖連蛋白和蛋白聚糖，是木瓜蛋白酶家族中一個(gè)強(qiáng)有力的ECM降解半胱氨酸蛋白酶[17]。彈性蛋白是中層ECM蛋白中最主要的蛋白，Cat S能在自然PH值條件下降解彈性蛋白，而彈性蛋白在再狹窄形成過(guò)程中ECM的重塑中具有重要的作用。進(jìn)一步研究[18]發(fā)現(xiàn)，Cat S可通過(guò)降解ECM促進(jìn)VSMCs從收縮型轉(zhuǎn)化為分泌型，提高其增殖和遷移的能力，促進(jìn)VSMCs從中膜遷移入內(nèi)膜，從而在新生內(nèi)膜的形成中發(fā)揮重要的作用。既往研究[7，8]表明，在正常血管中Cat S表達(dá)較少或幾乎沒(méi)有，而在高膽固醇飲食兔和大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后，血管壁中可見(jiàn)Cat S明顯表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)RT-RCR檢測(cè)結(jié)果表明，B組(裸支架組)和C組(裸支架+fasudil組)的Cat S mRNA的表達(dá)較A組(假手術(shù)組)顯著升高，表明Cat S參與了支架置入后再狹窄形成過(guò)程。B組(裸支架組)的Cat S mRNA的表達(dá)顯著高于C組(裸支架+fasudil組)，表明fasudil可以降低支架置入后血管中Cat S mRNA的表達(dá)。對(duì)各指標(biāo)的相關(guān)性分析表明，Cat S mRNA與α-SMA、PCNA、新生內(nèi)膜厚度之間呈正相關(guān)，表明fasudil可能通過(guò)降低血管中Cat S mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖，從而發(fā)揮抑制新生內(nèi)膜的形成和再狹窄進(jìn)程的作用。

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