黃曉霞 梁奇?zhèn)ヱT惠崗 莊煒釗 林桂儀 王浩 邢會杰 陳漢威 黃益李龍

下肢靜脈曲張是一種常見的周圍血管性疾病，表現(xiàn)為下肢淺靜脈的迂曲、延長和擴張，具有很高的患病率和致殘率[1]。泡沫硬化療法因其創(chuàng)傷小、操作方便、安全性好多用于治療下肢靜脈曲張，其原理主要是硬化劑引起血管內(nèi)皮及中膜損傷，致使內(nèi)皮下膠原蛋白暴露，從而促進中外膜膠原蛋白纖維化，引起血管閉塞[2]。有研究發(fā)現(xiàn)下肢靜脈曲張泡沫硬化術(shù)后1～3年隨訪過程中，再通率和再發(fā)反流率在20%～32%[3]，有研究提出這與硬化治療后血管殘留的上皮細胞有關(guān)[4-5]。不同的泡沫硬化劑有不同的硬化效力，國內(nèi)臨床上使用較多的治療下肢靜脈曲張的泡沫硬化劑主要有魚肝油酸鈉和聚多卡醇注射液[6]，但其作用機制尚未明確，本研究采用動物實驗探討其作用機制。

材料與方法

一、材料

12只健康比格犬購自華南農(nóng)業(yè)大學動物實驗中心，雌雄不限，體質(zhì)量6～7 kg。造影劑：碘普羅胺注射液，麻醉劑：1%聚多卡醇注射液（2 ml/支，德國Chemische Fabrik Kreussler&Co.GmbH 生產(chǎn)），5%魚肝油酸鈉注射液（2 ml/支，上海東海制藥廠生產(chǎn)）?；赥essari法將聚多卡醇或魚肝油酸鈉注射液與空氣按1∶4比例制成泡沫硬化劑。主要設(shè)備：數(shù)字減影血管造影（DSA）購自美國GE公司，型號：INNOVA3100；光鏡購自北京拓普康醫(yī)療器械公司、Aperio數(shù)字病理分析掃描儀購自上?；蚩萍脊煞萦邢薰?。

二、實驗動物分組

每只比格犬右前肢靜脈注射生理鹽水，為對照組（n=12）。將12只比格犬隨機分為兩個實驗組，每組6只。于每只犬的3條靜脈（左前肢、左后肢、右后肢）注射硬化劑，聚多卡醇組注入1%聚多卡醇泡沫硬化劑，魚肝油酸鈉組注射5%魚肝油酸鈉泡沫硬化劑，每組各注射18條靜脈。

三、實驗方法

對比格犬備皮、麻醉消毒后，戴頸脖套。在膝關(guān)節(jié)上水平隱靜脈作標記，局部穿刺大隱靜脈，回抽見靜脈血后固定留置針。將犬側(cè)臥于DSA治療床上，X線透視下注入適量碘普羅胺對比劑行隱靜脈全程造影，記錄靜脈血流方向的對比劑用量。于右前肢注入等量生理鹽水，余肢體靜脈注入即時配制的相應(yīng)組別的泡沫硬化劑，注意控制推注速度，用量為置換隱靜脈內(nèi)對比劑充盈的血容量，拔除留置針止血，用彈力繃帶適當加壓包扎四肢，送回動物實驗中心飼養(yǎng)。待犬隱靜脈注完泡沫硬化劑后30 min、2 d、28 d分別采集其大隱靜脈。硬化治療后局部麻醉消毒手術(shù)切開皮膚，取膝上大隱靜脈約5 cm，放入液氮氣內(nèi)儲存，送回實驗中心后用10%福爾馬林固定，制作切片，HE染色和Masson染色后于光鏡下觀察，并采用數(shù)字病理分析掃描儀采用以下3個指標來評估內(nèi)皮和中膜的損傷。①內(nèi)皮脫失率：血管腔中缺失內(nèi)皮細胞的周長與整個管腔的周長的比值，缺失的內(nèi)皮細胞周圍可出現(xiàn)黃褐色物質(zhì)（圖1、2）。②中膜損傷深度：管腔內(nèi)層至最開始出現(xiàn)病理平滑肌細胞（病理平滑肌細胞具有腫脹性、蒼白性、核分裂異常特點）的距離（圖3）。③中膜損傷率：中膜損傷深度與中膜厚度的比值（圖3、4）。

四、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、光鏡觀察結(jié)果

兩個實驗組注射泡沫硬化劑后30 min，大部分血管內(nèi)皮細胞局部壞死脫落，中膜和外膜無明顯變化。注射后2 d，血管內(nèi)皮細胞壞死脫落，中膜平滑肌細胞排列紊亂，外膜無明顯變化（圖5）。注射后28 d，血管壁增厚，管腔縮小；Masson染色見血管壁平滑肌細胞增生，管腔閉塞（圖6）。而對照組血管壁及血管管腔未見異常變化。

二、兩組注射硬化劑后不同時點的內(nèi)皮脫失率和中膜損傷率比較

注射硬化劑后30 min，聚多卡醇組和魚肝油酸鈉組的內(nèi)皮脫失率分別達95.32%和93.95%，表明這兩種硬化劑均對血管內(nèi)皮產(chǎn)生明顯破壞作用。而對照組內(nèi)皮基本無損傷，其內(nèi)皮脫失率和中膜損傷率基本為0，故下面只比較聚多卡醇組和魚肝油酸鈉組血管損傷的差異。

注射硬化劑后30 min，聚多卡醇組與魚肝油酸鈉組的內(nèi)皮脫失率和中膜損傷率差異無統(tǒng)計學意義；注射后2 d，聚多卡醇組的中膜損傷率高于魚肝油酸鈉組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。魚肝油酸鈉組注射后2 d的內(nèi)皮脫失率高于注射后30 min，差異有統(tǒng)計學意義（t=18.003，P=0.011），見表 1。

表1 兩組注射硬化劑后不同時點的內(nèi)皮脫失率和中膜損傷率比較 （n=18，%，±s）

表1 兩組注射硬化劑后不同時點的內(nèi)皮脫失率和中膜損傷率比較 （n=18，%，±s）

組別 內(nèi)皮脫失率 中膜損傷率聚多卡醇組魚肝油酸鈉組t值P值30 min 95.3±0.6 93.9±0.3 0.971 0.352 2 d 99.3±0.6 99.6±0.3-0.221 0.681 30 min 19.3±2.0 22.0±6.4-1.881 0.712 2 d 63.6±9.4 49.2±4.4 2.314 0.030

三、兩組注射硬化劑后的中膜厚度比較

兩組注射后28 d的中膜厚度均大于注射后2 d的厚度，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組注射硬化劑后的中膜厚度比較（n=18，μm，±s）

表2 兩組注射硬化劑后的中膜厚度比較（n=18，μm，±s）

組別聚多卡醇組魚肝油酸鈉組2 d 150.40±33.12 182.29±10.34 28 d 510.82±20.12 408.28±20.12 t值3.291 6.880 P值0.013 0.008

討 論

圖1 注射聚多卡醇30 min，藍色曲線為剩余的內(nèi)皮細胞的管腔周長；圖2 注射聚多卡醇30 min后，藍色線為管腔周長；圖3 注射聚多卡醇30min后，紅色直線為中膜損傷的深度；圖4 注射聚多卡醇30min后，紅色直線為中膜損傷的深度，藍色直線為中膜的厚度

圖5 魚肝油酸鈉組注射配制的魚肝油酸鈉硬化劑后2 d，可見血管內(nèi)皮細胞大部分脫落，平滑肌細胞排列紊亂（HE，×40）；圖6 聚多卡醇組注射配制的聚多卡醇硬化劑后28 d，可見血管壁增厚，管腔縮小閉塞（HE，×40）

下肢靜脈曲張是一種常見的血管外科疾病，可導致下肢靜脈性潰瘍等不良并發(fā)癥，重者會導致殘疾。該病的病因多為深靜脈及交通支瓣膜功能不全，傳統(tǒng)的治療方法為大隱靜脈高位結(jié)扎術(shù)及曲張靜脈剝脫術(shù)，但創(chuàng)傷較大，近年來泡沫硬化治療應(yīng)用越來越多，但長期隨訪發(fā)現(xiàn)硬化治療的復發(fā)率較高[7]。本研究采用DSA引導下注入泡沫硬化劑，可避免超聲引導空間分辨率不夠的缺點，且透視下操作保證了血管內(nèi)壁全部暴露，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種硬化劑均未見血管殘腔，可認為DSA透視下靜脈硬化注藥療效更優(yōu)。

國內(nèi)多采用魚肝油酸鈉和聚多卡醇這兩種泡沫硬化劑。泡沫硬化劑的作用機制為：血管的內(nèi)皮細胞膜上聚集足夠的有機分子后發(fā)生乳化作用，可使細胞膜的一處或多處發(fā)生變性并溶解，變性的細胞呈現(xiàn)氣球樣變，可出現(xiàn)脫落[8]。本研究結(jié)果示，聚多卡醇組和魚肝油酸鈉組注射后15 min及2 d的內(nèi)皮脫失率均高于生理鹽水對照組，同一個時間點兩種硬化劑的內(nèi)皮脫失率未見明顯差異，表明兩種硬化劑對血管內(nèi)皮層的破壞程度無明顯差異。魚肝油酸鈉組在注射后2 d的內(nèi)皮脫失率較15 min大，提示魚肝油酸鈉在2 d內(nèi)都處于硬化破壞內(nèi)皮的過程中，而聚多卡醇注射后15 min的內(nèi)皮脫失率達95.3%，與注射后2 d的內(nèi)皮脫失率（99.3%）無明顯差別，提示魚肝油酸鈉破壞內(nèi)皮細胞的速度較聚多卡醇慢。

硬化劑產(chǎn)生連鎖反應(yīng)的機制為：內(nèi)皮細胞的脫失可充分暴露內(nèi)膜下組織，血管發(fā)生痙攣，中膜繼續(xù)受到破壞，繼而可誘發(fā)血小板聚集激發(fā)凝血機制并刺激細胞基質(zhì)纖維化[8]。本研究中注射聚多卡醇和魚肝油酸鈉后15 min的中膜損傷率差異無統(tǒng)計學意義，注射后2 d，聚多卡醇的中膜損傷率高于魚肝油酸鈉，表明硬化治療后短期（2 d）內(nèi)，聚多卡醇的硬化效力強于魚肝油酸鈉。

廖愷等[9]對兔的耳緣靜脈進行硬化處理，發(fā)現(xiàn)血管腔內(nèi)纖維條索在硬化治療后30 d出現(xiàn)，照此本研究選了術(shù)后28 d為時點進行研究，發(fā)現(xiàn)術(shù)后28 d兩組的中膜厚度均大于2 d，表明硬化處理后2～28 d，中膜仍處于纖維化過程。且聚多卡醇組28 d的中膜厚度比魚肝油酸鈉組厚，提示聚多卡醇的血管纖維化作用較魚肝油酸鈉強。

綜上，聚多卡醇和魚肝油酸鈉在硬化治療短期（2 d）內(nèi)的內(nèi)皮損傷程度未見明顯差異，但前者對中膜的損傷程度強于后者；治療后中期（28 d）聚多卡醇的血管纖維化作用較魚肝油酸鈉強，可能與其對中膜損傷的程度有關(guān)。聚多卡醇是一種更為理想的下肢靜脈泡沫硬化劑，值得進一步推廣。