王 璐，張殿鴻，王 鎂

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

糖尿病性腎臟疾病(DKD)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,已成為終末期腎病的重要原因[1]。DKD的發(fā)生與氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)通過與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白，是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激最重要的通路[2]。而Nrf2與ARE上的GCTGAGTCA結(jié)合，啟動Nrf2一系列下游的抗氧化酶基因及Ⅱ相解毒酶表達(dá)，如血紅素加氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)等[3]。研究表明核因子κB(NF-κB)是眾多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，NF-κB信號激活可以直接在轉(zhuǎn)錄水平抑制Nrf2/ARE信號通路介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而導(dǎo)致Nrf2無法激活[4]。復(fù)方糖腎安是王鎂教授以“補(bǔ)益脾腎”為基礎(chǔ)理論，在實(shí)踐中不斷優(yōu)化而創(chuàng)立的中藥方劑。前期實(shí)驗(yàn)研究已證明，糖腎安對腎臟的保護(hù)作用與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[5]。本研究進(jìn)一步探討了糖腎安的腎臟保護(hù)作用與Nrf2/ARE通路的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量230～300 g，動物合格證編號:SCSK(遼)2010-0001，購于沈陽龍?jiān)平?jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥品 糖腎安煎劑(由白術(shù)、茯苓、黃芪等中藥組成)中的藥材購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；蛋白裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；厄貝沙坦(購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，生產(chǎn)批號：2A292)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)；Nrf2抗體、HO-1抗體、NF-κB抗體(購自武漢博士德公司)。

1.3主要儀器設(shè)備 EQ.0603-021型PCR儀(購自日本Ta KaRa公司)，Bioshine GelX 1520 型凝膠成像系統(tǒng)(購自美國UVP公司)，血糖儀及血糖試紙(購自德國拜耳公司安康系列)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1模型制作 50只健康雄性SD大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常組8只和造模組42只。參照文獻(xiàn)[6-8]方法，造模組大鼠給予高糖高脂飼料(普通飼料67%、蔗糖20%、膽酸鹽1%、膽固醇2%、豬油10%)喂養(yǎng)4周，然后禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射1% STZ 35 mg/kg，注射72 h后，尾靜脈采血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L且有多飲、多食、多尿的癥狀提示2型糖尿病大鼠造模成功(3只大鼠未成模，予以剔除)。正常組注射相應(yīng)量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.4.2動物分組及給藥 將成模大鼠隨機(jī)分為模型組7只，糖腎安低、中、高劑量組及西藥組各8只。糖腎安低、中、高劑量組分別給予糖腎安6，18，60 g/(kg·d)灌胃，西藥組給予厄貝沙坦13.5 mg/(kg·d)灌胃，正常組和模型組每天給予相應(yīng)量的生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃8周。實(shí)驗(yàn)過程中糖腎安低劑量組2只死亡，從實(shí)驗(yàn)中剔除。

1.4.3樣本采集 各組大鼠末次灌胃1 h后稱體質(zhì)量，取10%水合氯醛3 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，腹腔暴露，游離腎臟，去除被膜，濾紙吸干血跡，切取左側(cè)腎臟，部分腎組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定，4 ℃冷藏保存，留做免疫組織化學(xué)觀察；切取右側(cè)腎臟，一分為二，部分置于凍存管中，用于Western blot檢測，部分置于1 mL Trizol溶液中用于RT-PCR檢測，置于-80 ℃冷凍保存。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1大鼠腎組織中Nrf2、HO-1蛋白檢測 采用免疫組化SP法檢測。每組各取5只大鼠標(biāo)本，常規(guī)處理石蠟切片，滅活內(nèi)源性過氧化酶，高壓煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)，血清封閉后依次加入相應(yīng)的一抗、二抗。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

1.5.2大鼠腎組織中NF-κBp65蛋白檢測 采用Western blot技術(shù)檢測。每組各取6只大鼠腎皮質(zhì)組織約100 mg，加入細(xì)胞裂解緩沖液，在玻璃研磨器中研磨，冰浴1 h，BCA法測定上清液蛋白濃度。各組取50 μg組織裂解蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，TBST洗膜，分別加入一抗NF-κBp65置于4 ℃孵育過夜；TBST洗膜，各組加入二抗后置于37 ℃孵育2 h；以上兩步后TBST洗膜10 min×3次；用ECL發(fā)光法檢測各組NF-κBp65蛋白表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。Image J分析系統(tǒng)軟件對Western條帶進(jìn)行定量分析，確定條帶的吸光度值。

1.5.3大鼠腎組織中NF-κBp65 mRNA檢測 采用RT-PCR技術(shù)檢測。每組各取6只大鼠腎組織，采用Trizol沉淀法提取腎組織總RNA，操作按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行；將所得樣品cDNA用于Real-Time PCR反應(yīng)；同時(shí)將GAPDH作為內(nèi)在參照基因；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并做熔解曲線，以保證以上PCR反應(yīng)產(chǎn)物良好的特異性，計(jì)算△Ct值用來比較給藥前后mRNA的表達(dá)變化。

1.5.4大鼠腎組織中SOD活性檢測 取各組大鼠腎組織，制成10%均漿，采用ELISA法檢測腎組織中SOD活性，操作順序嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎組織中Nrf2、HO-1表達(dá)水平比較 模型組及各給藥組Nrf2、HO-1表達(dá)水平均顯著高于正常組(P均<0.05)；糖腎安中、高劑量組及西藥組Nrf2、HO-1表達(dá)水平均顯著高于模型組(P均<0.05 )；糖腎安低劑量組Nrf2、HO-1表達(dá)水平均顯著低于西藥組(P均<0.05)，糖腎安高劑量組HO-1表達(dá)水平顯著高于西藥組(P<0.05)。見表1及圖1～12。

表1 各組大鼠腎組織中 Nrf2、HO-1表達(dá)水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與正常組比較，P<0.01；③與模型組比較，P<0.05；④與模型組比較，P<0.01；⑤與西藥組比較，P<0.05；⑥與西藥組比較，P<0.01。

2.2各組大鼠腎組織中NF-κBp65蛋白和mRNA表達(dá)情況比較 模型組NF-κBp65蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常組(P均<0.05)，各給藥組NF-κBp65蛋白表達(dá)水平和糖腎安低中劑量組及西藥組NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常組(P均<0.05)；各給藥組NF-κBp65蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著低于模型組(P均<0.05)；糖腎安低劑量組NF-κBp65蛋白mRNA表達(dá)水平均顯著高于西藥組(P均<0.05)。見圖13、圖14及表2。

圖1 正常組大鼠腎組織中Nrf2表達(dá)情況

圖2 模型組大鼠腎組織中Nrf2表達(dá)情況

圖3 糖腎安低劑量組大鼠腎組織中Nrf2表達(dá)情況

圖4 糖腎安中劑量組大鼠腎組織中Nrf2表達(dá)情況

圖5 糖腎安高劑量組大鼠腎組織中Nrf2表達(dá)情況

圖6 西藥組大鼠腎組織中Nrf2表達(dá)情況

圖7 正常組大鼠腎組織中HO-1表達(dá)情況

圖8 模型組大鼠腎組織中HO-1表達(dá)情況

圖9 糖腎安低劑量組大鼠腎組織中HO-1表達(dá)情況

圖10 糖腎安中劑量組大鼠腎組織中HO-1表達(dá)情況

圖11 糖腎安高劑量組大鼠腎組織中HO-1表達(dá)情況

圖12 西藥組大鼠腎組織中HO-1表達(dá)情況

1為正常組；2為模型組；3為糖腎安低劑量組；4為糖腎安中劑量組；5為糖腎安高劑量組；6為西藥組圖13 各組大鼠腎組織中NF-κBp65蛋白表達(dá)情況

1為正常組；2為模型組；3為糖腎安低劑量組；4為糖腎安中劑量組；5為糖腎安高劑量組；6為西藥組圖14 各組大鼠腎組織中NF-κBp65 mRNA表達(dá)情況

2.3各組大鼠腎組織中SOD活性比較 正常組、模型組、糖腎安低劑量組、糖腎安中劑量組、糖腎安高劑量組及西藥組大鼠腎組織中SOD活性分別為(148.82±7.50)IU/mL、(22.37±10.15)IU/mL、(43.66±18.73)IU/mL、(81.87±15.41)IU/mL、(96.09±11.91)IU/mL、(96.57±10.93)IU/mL，模型組及各給藥組SOD活性均顯著低于正常組(P均<0.05)，各給藥組SOD活性均顯著高于模型組(P均<0.05)，糖腎安低、中劑量組SOD活性均顯著低于西藥組及糖腎安高劑量組(P均<0.05)，糖腎安高劑量組及西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠腎組織中NF-κBp65蛋白和mRNA表達(dá)情況

注：①與正常組比較，P<0.01；②與正常組比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05；④與模型組比較，P<0.01；⑤與西藥組比較，P<0.05；⑥與西藥組比較，P<0.01。

3 討 論

DKD的發(fā)生發(fā)展不僅與蛋白非酶糖化、糖脂代謝紊亂、血流動力學(xué)、遺傳背景有關(guān)，還與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。ARE是細(xì)胞保護(hù)蛋白基因表達(dá)和Ⅱ相解毒酶的上游調(diào)節(jié)區(qū)，這一序列的激活因子是Nrf2。活化的Nrf2從Keap1解離后進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)Maf蛋白結(jié)合成異二聚體后與ARE序列結(jié)合，進(jìn)而啟動ARE所調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，稱為Keap1-Nrf2-ARE通路，該通路是一種重要的抗氧化應(yīng)激通路[9]。高糖狀態(tài)下產(chǎn)生過多的活性氧(ROS)，消耗了通過機(jī)體自身Nrf2/ARE通路激活所增加的HO-1等抗氧化蛋白，使機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力減弱，激活內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激Nrf2/ARE信號通路，減輕腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮對機(jī)體腎臟的保護(hù)作用，可延緩糖尿病的發(fā)展，預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，改善代謝紊亂，減輕糖尿病引起的腎損害[10-12]。張鎳等[13]研究結(jié)果顯示積雪草酸可激活糖尿病大鼠腎臟Nrf2-ARE信號通路，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)，提高腎臟的抗氧化應(yīng)激能力，從而延緩DKD的進(jìn)展。

糖尿病狀態(tài)下腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活性增高,尤其是腎組織中AngⅡ含量增加,可促進(jìn)ROS的合成,ROS激活絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號傳導(dǎo)通路,核因子抑制蛋白(IκB)磷酸化而被降解,使IκB與NF-κB分離,激活NF-κB的表達(dá)[14]。NF-κB是重要的炎癥遞質(zhì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，而Nrf2是細(xì)胞防御多種氧化應(yīng)激損傷的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有抗氧化損傷及抗炎等作用，并能抑制NF-κB活性[15]。陳凱等[16]觀察經(jīng)血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦干預(yù)后，糖尿病大鼠腎臟組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白NK-κB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，表明纈沙坦能夠激活 NF-κB系統(tǒng)，抑制炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)糖尿病大鼠腎臟組織。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中NF-κBp65表達(dá)水平顯著高于正常組，提示激活了糖尿病大鼠腎組織中炎癥反應(yīng)，與此同時(shí)，Nrf2、HO-1在核蛋白中的表達(dá)增高，推測糖尿病大鼠腎組織的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激引起了機(jī)體保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，刺激Nrf2的活化引起其下游靶基因HO-1上升；給予糖腎安干預(yù)后，各組大鼠腎組織中Nrf2及HO-1水平繼續(xù)上調(diào)，NF-κBp65水平降低，活化受到抑制，并呈濃度梯度依賴，提示在糖腎安干預(yù)下，Nrf2活性激活，調(diào)控HO-1表達(dá)升高，進(jìn)一步啟動機(jī)體抗炎、抗氧化反應(yīng)，抑制NF-κBp65表達(dá)，減輕糖尿病大鼠腎組織炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)腎臟作用。

綜上所述，中藥復(fù)方糖腎安治療糖尿病腎病的機(jī)制與激活內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路Nrf2/ARE，提高Nrf2及其下游因子HO-1的活性，抑制NF-κBp65的表達(dá)，減輕腎臟炎癥水平，從而發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)。

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