梁 濱 董 冬

（山東省濱州市鄒平縣魏橋中學(xué) 山東濱州 256212）

植物在生長過程中會(huì)受到生物逆境（病原菌侵入、病蟲害等）和非生物逆境（高溫、高鹽、干旱等）的脅迫（圖1），從而抑制植物的生長發(fā)育，造成各種作物質(zhì)量、產(chǎn)量的下降，給人類生產(chǎn)帶來極大危害。在長期進(jìn)化過程中，植物為了適應(yīng)這些不利的環(huán)境因素，在體內(nèi)形成了一套既復(fù)雜且又高效的植物防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，胞外的信號(hào)（高溫、高鹽、干旱、病原菌等）通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（例如通過MAPK 激酶等進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）級(jí)聯(lián)放大進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過與其他防御相關(guān)蛋白之間的相互作用，進(jìn)而激活或抑制下游相關(guān)防御基因的轉(zhuǎn)錄，從而響應(yīng)植物對(duì)相關(guān)逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)［1］。其中，轉(zhuǎn)錄因子（MYC、NAC、WRKY、ERF、bZIP 等）在這一系列調(diào)控中起到非常重要的作用［2］。在這一系列的轉(zhuǎn)錄因子中，WRKY是近年研究比較廣泛的一類轉(zhuǎn)錄因子，研究表明，WRKY 在植物生長發(fā)育和防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制中起重要調(diào)控作用。

轉(zhuǎn)錄因子WRKY 是近年在植物中新發(fā)現(xiàn)的一類超大家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［2］，已發(fā)現(xiàn)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥、水稻等作物中參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的WRKY 家族成員既有起正調(diào)節(jié)作用的，也有起負(fù)調(diào)節(jié)作用的，但二者的N-末端均含有高度保守的WRKYGQK 氨基酸序列［3］。不同的WRKY家族成員均通過核心結(jié)構(gòu)域（WRKYGQK）結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域保守的W-BOX 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，由此產(chǎn)生的一個(gè)突出問題是： 不同的WRKY家族成員如何實(shí)現(xiàn)其在植物應(yīng)答逆境過程中的特異功能？最近大量報(bào)道表明，除W-BOX 側(cè)翼序列能在一定程度上影響WRKY 蛋白特異調(diào)節(jié)靶基因外，還能與其他蛋白的互作并調(diào)節(jié)其功能以實(shí)現(xiàn)功能的特異性。該家族的WRKY 基因分別相繼從甜馬鈴薯、野燕麥、皺葉歐芹、擬南芥等植物中分離獲得。同時(shí)，諸多專家也研究了其相應(yīng)的分子生物學(xué)功能，目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)WRKY 基因74 個(gè)，玉米中發(fā)現(xiàn)119 個(gè)，水稻中發(fā)現(xiàn)105 個(gè)，油菜中發(fā)現(xiàn)46 個(gè)。這些研究都表明了WRKY 轉(zhuǎn)錄因子確實(shí)參與植物的多種逆境脅迫的應(yīng)答，同時(shí)還參與植物生長的重要生理生化活動(dòng)的調(diào)控［4-6］，在植物抗逆反應(yīng)過程中具有重要的作用（圖2）。

1 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征及分類

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是植物中廣泛存在的一類超基因家族，通過其保守的氨基酸序列（WRKYGQK）對(duì)靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的W-box［（T）TGACC（AT）］特異識(shí)別，并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。WRKY 家族在代謝調(diào)控、種子的萌發(fā)及發(fā)育衰老調(diào)控、植物防御應(yīng)答、形態(tài)學(xué)建成等生命過程中都起到重要作用。

WRKY 是鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，它的DNA 結(jié)合區(qū)通常包含1 個(gè)或2 個(gè)保守的WRKY 核心結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其DNA 結(jié)合區(qū)的核心結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)及鋅指結(jié)構(gòu)類型將WRKY 轉(zhuǎn)錄因子分為三大類：第1 類具有2 個(gè)WRKY 核心結(jié)構(gòu)域及Cys2His2 型鋅指結(jié)構(gòu)；第2 類具有1 個(gè)WRKY 核心結(jié)構(gòu)域及Cys2His2 型鋅指結(jié)構(gòu)；第3 類具有1 個(gè)WRKY 核心結(jié)構(gòu)域及Cys2HisCys 型鋅指結(jié)構(gòu)。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子家族之一（擬南芥中有74 個(gè)成員，水稻中100 多個(gè)成員，辣椒中有報(bào)道的也已經(jīng)有40 多個(gè)），它能與各種蛋白質(zhì)相互作用，包括MAP 激酶，MAP 激酶的激酶，14-3-3 蛋白，鈣調(diào)蛋白，組蛋白去乙?；福剐缘鞍缀推渌鸚RKY 轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)成完整的信號(hào)網(wǎng)路調(diào)節(jié)許多植物生理過程。

植物有2 套固有的可誘導(dǎo)的免疫機(jī)制： 病原菌相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫機(jī)制（PTI）及效應(yīng)子觸發(fā)的免疫機(jī)制（ETI）［2］，而WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在這2 種免疫機(jī)制中都起重要作用。擬南芥中AtWRKY48和AtWRKY7 在抗丁香假單孢桿菌中分別起正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)作用；AtWRKY51，AtWRKY70 在JA，SA，ET信號(hào)通路中起作用；AtWRKY25，AtWRKY40，AtWRKY28，AtWRKY70 同時(shí)受到生物及非生物脅迫的調(diào)控。同時(shí)WRKY 也受到機(jī)械損傷的誘導(dǎo)，例如煙草的NtWRKY6，NtWRKY3，參與糖代謝，以及對(duì)低溫、干旱脅迫的應(yīng)答。關(guān)于辣椒WRKY家族的研究還很不深入，到2014年NCBI 才公布了11 條辣椒WRKY 基因序列。

擬南芥中AtWRKY58 作為NPR1（獲得性防御系統(tǒng)SAR 的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)子）的下游基因參與NPR1 基因介導(dǎo)的信號(hào)傳遞。CaWRKY58 在辣椒對(duì)病原菌的防御反應(yīng)過程中起到轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié)作用，青枯病侵染的辣椒中，CaWRKY58 的表達(dá)先出現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的情況，而且CaWRKY58 的表達(dá)被茉莉酸和脫落酸所抑制，同時(shí)將CaWRKY58 轉(zhuǎn)化煙草，使煙草在病原菌侵染下表現(xiàn)出更嚴(yán)重的病狀，同時(shí)在轉(zhuǎn)化CaWRKY58 的煙草中很多重要的過敏反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)記基因及一些防御相關(guān)的標(biāo)記基因都出現(xiàn)下調(diào)，而且CaWRKY58 基因沉默后的辣椒植株表現(xiàn)出對(duì)病原菌的更耐受性及各種防御相關(guān)基因的上調(diào)。WRKY58 的作用可能是提供一個(gè)保障機(jī)制，以防止防衛(wèi)反應(yīng)的激活停留在高SA 水平。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)含有DNA 結(jié)合區(qū)域、核定位信號(hào)區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域和寡聚化位點(diǎn)［7］。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是其DNA 結(jié)合區(qū)域中都至少含有一個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的N-末端含有高度保守的WRKYGQK 氨基酸殘基和CX4-5CX22-23HXH 型或CX7CX23HXC 型的C-末端鋅指結(jié)構(gòu)。根據(jù)WRKY 的結(jié)構(gòu)特征，可分為3 種類型：Ⅰ類為WRKY 轉(zhuǎn)錄因子含有2 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2（CX4-5CX22-23HX1H），其DNA 結(jié)合功能主要是通過C-末端的WRKY 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)；Ⅱ類為WRKY轉(zhuǎn)錄因子只含1 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型也為C2H2（CX4-5CX22-23HX1H），而且大部分高等植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是屬于這類型；Ⅲ類為WRKY 轉(zhuǎn)錄因子也僅含1 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC （CX7CX23HX1C），但這類型轉(zhuǎn)錄因子一般只存在高等植物中，在一些低等植物中是不存在的。

2 WRKY 蛋 白與W-box 結(jié)合

眾多研究表明:WRKY 轉(zhuǎn)錄因子能特異結(jié)合啟動(dòng)子上的順式作用元件W-box［（T）（T）TGAC(C/T)］,其中高度保守序列TGAC 對(duì)于WRKY 的結(jié)合功能是必要的，任一核苷酸被替代，與之結(jié)合的能力都大幅度下降甚至可能完全消失。研究還發(fā)現(xiàn)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子不僅與自身基因啟動(dòng)子上的順式作用元件W-box 結(jié)合，而且與大量抗病相關(guān)基因啟動(dòng)子的W-box 結(jié)合參與表達(dá)調(diào)控［8］，且這些W-box 多存在于抗病等相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，說明WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與植物的抗逆反應(yīng)及其生長過程中生理生化等的調(diào)控。為了進(jìn)一步研究W-box 順式作用元件在基因表達(dá)調(diào)控中的作用，通常利用人工合成只含W-box 順式作用元件的啟動(dòng)子研究其在植物中的防御反應(yīng)［9］，結(jié)果表明僅含W-box 的啟動(dòng)子也能介導(dǎo)植物的逆境脅迫和防衛(wèi)反應(yīng)。

3 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能

3.1 參與生物逆境脅迫 目前大量報(bào)道表明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在生物脅迫中的作用方面的研究既廣泛又深入。植物免疫系統(tǒng)包括PTI （PAMPtriggered immunity），ETI （Effector- triggered immunity），MTI（MAMP-triggered immunity）及SAR（Systemic acquired resistance）等多種免疫系統(tǒng)，WRKY基因在其中發(fā)揮著正調(diào)控或負(fù)調(diào)控的作用，而且在參與植物的抗病反應(yīng)，既存在正調(diào)控調(diào)節(jié)又有負(fù)調(diào)控途徑［10］。

研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥的大部分WRKY 基因受SA（水楊酸）和病原菌的誘導(dǎo)，并且這些WRKY 基因自身的啟動(dòng)子中富含W-box，說明這類轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病反應(yīng)中形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。很多WRKY 轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道能調(diào)控抗病基因（PR）的表達(dá)。擬南芥AtWRKY70 在SA（水楊酸）和JA（茉莉酸）途徑中扮演了重要的調(diào)控角色，其功能的缺失將使植物易感染灰霉病菌、葉斑病菌和真菌性白粉病菌等［11］。擬南芥AtWRKY18，AtWRKY40和AtWRKY60 結(jié)構(gòu)非常相似，參與植物抗病并且在功能上存在冗余［12］，此外，AtWRKY18 還作為正調(diào)控因子參與系統(tǒng)獲得性抗性，而AtWRKY40沒有參與其中［13］。

另一方面，也有許多WRKY 基因參與植物防御的負(fù)調(diào)控。在擬南芥中，AtWRKY7 功能缺失體將導(dǎo)致細(xì)菌性葉斑病菌抗性的增強(qiáng)，且在AtWRKY7 和AtWRKY11 雙突變中得到進(jìn)一步的提高，說明兩者在抗病過程中起到負(fù)調(diào)控作用［14］。AtWRKY25，AtWRKY38 和AtWRKY62 在植物防御中也起到負(fù)調(diào)控作用，其過表達(dá)植株都顯著抑制 了PR 基因的表達(dá)［15-16］。

此外，還有許多非模式植物中WRKY 基因參與了抗病反應(yīng)，如皺葉歐芹中PcWRKY1，2，3，4，5，紅辣椒中CaWRKY1，40，大麥中的HvWRKY1，2，10，19，28 等都在抗病調(diào)控方面起到重要的作用。

3.2 參與非生物逆境脅迫 近年越來越多的研究證實(shí)了WRKY 基因在高溫、高鹽、機(jī)械損傷、干旱等非生物逆境脅迫下，其表達(dá)量會(huì)發(fā)生特異地變化，表明其在非生物逆境中扮演重要的角色，對(duì)于了解植物適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境的分子機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義。qRT-PCR 研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtWRKY25，28，40，70 均受到高鹽、高溫及滲透脅迫的誘導(dǎo)［17］，AtWRKY25，26，33，39 則能應(yīng)答熱激反 應(yīng)［18-19］，AtWRKY57 能通過激活與ABA 相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)擬南芥耐干旱的能力［20］。此外還發(fā)現(xiàn)擬南芥AtWRKY7 中含有一個(gè)鈣調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合域，能特異結(jié)合鈣調(diào)蛋白并介導(dǎo)Ca2+離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［21］。這些研究有力地說明了WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在抵御高溫、高鹽、干旱和熱等復(fù)雜環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用。

3.3 參與植物的生長發(fā)育及物質(zhì)代謝 研究表明，WRKY 家族還參與了調(diào)控植物種子形成、休眠和萌發(fā)及葉片衰老等生長發(fā)育及物質(zhì)代謝等一系列生理活動(dòng)。例如擬南芥AtWRKY10 參與種子的發(fā)育過程，AtWRKY6 不僅參與植物的防御應(yīng)答而且還參與植物的衰老調(diào)控，擬南芥AtWRKY44 參與調(diào)控種皮和表毛皮的發(fā)育，其功能突變體后使得表毛皮出現(xiàn)未分支且數(shù)量顯著下降，同樣地，水稻OsWRKY78 也參與調(diào)控種子大?。?］。此外，棉花GaWRKY1 參與調(diào)控棉子酚的合成。這些結(jié)果都表明WRKY 基因在植物生長發(fā)育、物質(zhì)代謝等生理過程中發(fā)揮了極其重要的作用。

4 展望

其實(shí)，在應(yīng)用基因工程培育作物抗逆新品種方面，人們已經(jīng)從植物基因組的角度進(jìn)行了深入的研究，這些研究成果在分子水平上對(duì)植物的相關(guān)表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究具有重要的指導(dǎo)意義。而啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，是基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵元素。因此，研究WRKY 轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)抗病基因啟動(dòng)子的調(diào)控特性，分離并分析其順式作用元件的分布及逆境應(yīng)答對(duì)于闡明植物抗病性極其重要，可為作物抗病育種開辟出一條新途徑。大量報(bào)道表明，除了W-BOX 側(cè)翼序列能在一定程度上影響WRKY 蛋白特異調(diào)節(jié)靶基因外，還能與其他蛋白的互作并調(diào)節(jié)其功能以實(shí)現(xiàn)功能的特異性。而迄今僅分離鑒定了部分的WRKY 蛋白的互作蛋白，大多數(shù)WRKY 家族成員的互作蛋白仍未見報(bào)道。因此，分離相關(guān)的互作蛋白，同時(shí)對(duì)其互作驗(yàn)證及功能和作用機(jī)制的研究將成為今后的研究熱點(diǎn)。