汪 靖 王 進(jìn) 曾家豫 廖世奇

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070）

1 核酸適配體

核酸適配體（aptamer）是從人工構(gòu)建的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選出的與目標(biāo)靶分子高親和力、高特異性結(jié)合的SSDNA 或者RNA，一般由幾十個(gè)核苷酸（20～60 nt）組成。其制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、靶分子范圍廣、易于修飾，且無(wú)免疫原性，被稱(chēng)為“化學(xué)抗體”。1990年Tuerk 等［1］首次在體外人工構(gòu)建的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選出和噬菌體T4DNA 聚合酶（gp43）特異性結(jié)合的RNA 配體，此后，核酸適配體已成熟發(fā)展為新一代靶分子特異性識(shí)別結(jié)合體，核酸通過(guò)自身形成的空間結(jié)構(gòu)可以識(shí)別不同的分子靶標(biāo)，包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、細(xì)菌、小分子與病毒等。篩選的適配體與靶標(biāo)復(fù)合物的解離常數(shù)從低等微摩爾級(jí)到高等兆摩爾級(jí)［2］，親和力逐漸增強(qiáng)。適配體的應(yīng)用也逐漸廣泛，在生物醫(yī)藥、農(nóng)用食品、環(huán)境等檢測(cè)方面具有重要的實(shí)用意義。第1 個(gè)基于RNA 適配體的藥物哌加他尼鈉，在2004年12月已被美國(guó)FDA通過(guò)，目前正應(yīng)用于老年黃斑變性患者［3］。

2 SELEX 技術(shù)

篩選核酸適配體主要采用體外指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX），首先建立一個(gè)1012～1014庫(kù)容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，將靶目標(biāo)與該文庫(kù)進(jìn)行孵育，待靶標(biāo)與核酸充分結(jié)合后，洗脫掉沒(méi)有結(jié)合的核酸序列，并將結(jié)合靶標(biāo)的核酸序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用于下一輪篩選。通過(guò)不斷地結(jié)合、分離、洗脫與擴(kuò)增，一些與靶標(biāo)不結(jié)合或親和力較弱的核酸相繼被淘汰。而具有高親和力的核酸適配體逐漸被富集起來(lái)。最后富集的文庫(kù)通過(guò)測(cè)序獲得特異性識(shí)別靶標(biāo)的核酸適配體，并對(duì)適配體進(jìn)行親和力的檢測(cè)。

3 核酸適配體親和力的表征方法

3.1 細(xì)胞靶標(biāo)核酸適配體親和力的表征方法細(xì)胞適配體親和力表征方法最常用的為流式細(xì)胞術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是可以計(jì)算出靶細(xì)胞與適配體結(jié)合的平衡解離常數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是一種在液流系統(tǒng)中，能快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器的生物學(xué)性質(zhì)，并將特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類(lèi)收集的技術(shù)，細(xì)胞的分選是通過(guò)分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)的。在流動(dòng)室的噴口上配有一個(gè)超高頻電晶體，充電后振動(dòng)，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測(cè)定細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正、負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。Ababneh 等［4］在體外篩選出CD44 腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的RNA 適配體Apt1，利用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡檢查術(shù)的方法分析了適配體與腫瘤干細(xì)胞的結(jié)合特異性，熒光的不同強(qiáng)度反映CD44 在這些細(xì)胞表面的表達(dá)水平。Aptaker 等［5］將細(xì)胞重懸在PBS 溶液中利用流式細(xì)胞術(shù)定量分析了適配體與靶標(biāo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤相比較于和非癌或非膠質(zhì)類(lèi)型細(xì)胞的結(jié)合情況。通過(guò)共聚焦顯微鏡可以觀察aptamers 的細(xì)胞攝入和定位分析。為了探討膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)aptamers 的選擇性吸收是否為一個(gè)積極的過(guò)程，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定了溫度對(duì)細(xì)胞結(jié)合的影響。由于細(xì)胞與適配體結(jié)合之后，流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞可能受到胰蛋白酶的威脅，會(huì)潛在地降低適配體結(jié)合在細(xì)胞表面受體的機(jī)率，所以溫度在4℃為宜，并通過(guò)以下公式計(jì)算Kd值：

其中，Bmax=最大限度結(jié)合位點(diǎn)；Captamer=適配體的濃度。但是多數(shù)流式細(xì)胞儀只能測(cè)量一個(gè)細(xì)胞的總核酸量，總蛋白量等指標(biāo)，而不能鑒別和測(cè)出某一特定部位的核酸或蛋白的多少，即它的細(xì)節(jié)分辨率為零。

3.2 小分子靶標(biāo)核酸適配體親和力表征方法小分子靶標(biāo)包括一些不同基團(tuán)組成的分子、含相同基團(tuán)的同類(lèi)分子和基團(tuán)相同空間結(jié)構(gòu)不同的手性分子。由于傳統(tǒng)的核酸適配體Kd值測(cè)定需要固定靶標(biāo)或核酸適配體，而對(duì)于小分子靶標(biāo)，固定核酸適配體，面臨著靈敏度的考驗(yàn)，因?yàn)樾》肿咏Y(jié)合到核酸適配體引起的質(zhì)量比較?。欢潭ㄐ》肿影袠?biāo)，要通過(guò)化學(xué)修飾會(huì)影響親和力的問(wèn)題。小分子靶標(biāo)核酸適配體的親和力表征方法主要有以下幾種方法。

3.2.1 超濾法（ultrafiltration） 超濾技術(shù)由于其成本低，速度快、靈敏度高而被普遍應(yīng)用。應(yīng)用孔徑為1～20 nm 的超濾膜過(guò)濾含有大分子或微細(xì)粒子的溶液，使大分子或微細(xì)粒子從溶液中分離的過(guò)程。超濾膜一般選用硝酸纖維素膜，其使用形式以斑點(diǎn)雜交最多，主要是因?yàn)闃悠返南牧可佟Ｏ跛崂w維素膜上的孔徑只允許游離的核酸適配體通過(guò)，而利用吸附作用將分子靶標(biāo)截留。對(duì)截留下來(lái)的分子與濾液中的核酸適配體進(jìn)行定量分析，利用平衡狀態(tài)下各組分的平衡分布評(píng)估計(jì)算核酸適 配體的Kd值。Javed 等［6］篩選四環(huán)素的核酸適配體，通過(guò)平衡透析膜，濾液中只有游離SSDNA，而游離四環(huán)素和四環(huán)素-SSDNA 復(fù)合物會(huì)被截留在膜上。然而，超濾法的不足之處在于，硝酸纖維素膜不能完全保留核酸適配體-靶標(biāo)復(fù)合物，從而導(dǎo)致過(guò)高估算Kd值，不完整的保留可能是由于核酸適配體與膜競(jìng)爭(zhēng)靶分子的同一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。另外一個(gè)潛在的制約因素是，硝酸纖維素膜對(duì)核酸具有非特異性吸附，針對(duì)非特異性吸附的問(wèn)題可以做沒(méi)有靶分子的控制實(shí)驗(yàn)，并在計(jì)算結(jié)合分?jǐn)?shù)時(shí)扣除吸附量。

3.2.2 熒光偏振法/熒光各向異性（fluorescence anisotropy/polarization；FA） 熒光各向異性是使用光譜多模制板閱讀器與偏振光學(xué)測(cè)量的。在FA中，當(dāng)高分子量成分被滴定到系統(tǒng)中時(shí)，分子量較低的成分通常被標(biāo)記為熒光分子使各向異性最大化改變［7］。溶液中的熒光分子受偏振光激發(fā)，激發(fā)時(shí)如果分子保持靜止，則發(fā)射的熒光仍有偏振性，如分子旋轉(zhuǎn)或者翻轉(zhuǎn)，發(fā)射熒光的偏振平面會(huì)不同于激發(fā)光偏振平面。所以熒光分子的各向異性和偏振性可以由以下方程表示：

IⅡ表示與入射偏振光平行的發(fā)射光強(qiáng)度，I⊥表示與入射偏振光垂直的發(fā)射光強(qiáng)度。熒光各向異性和熒光偏振在物理數(shù)學(xué)上相似并可以互換。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最重要的是選擇一個(gè)熒光壽命與其旋轉(zhuǎn)速度相匹配的熒光染料，熒光染料和核酸適配體之間的鏈接臂不宜太長(zhǎng)，否則會(huì)使熒光染料的自由活動(dòng)度增加，從而降低熒光標(biāo)記分子偏振性的敏感度。

3.2.3 紫外光譜法與圓二色譜法（UV-Vis absorption/Circular Dichroism） 紫外光譜法可以根據(jù)核酸適配體與靶分子的最大吸收波長(zhǎng)的強(qiáng)度變化計(jì)算結(jié)合常數(shù)，是一種簡(jiǎn)單、成本低廉、較準(zhǔn)確檢測(cè)技術(shù)。一般需要在篩選出的Aptamer 的5′端進(jìn)行FAM 熒光標(biāo)記，然后再進(jìn)行熒光強(qiáng)度的檢測(cè)［8］。根據(jù)核酸適配體或其靶分子的最大吸收波長(zhǎng)的強(qiáng)度變化計(jì)算結(jié)合常數(shù)。圓二色譜法（circular dichroism，CD）是利用平面偏振光研究溶液中DNA、靶分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種方法。由于光學(xué)活性物質(zhì)對(duì)組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸收系數(shù)（ε）是不相等的，εL≠εR，即具有圓二色性。如果以不同波長(zhǎng)的平面偏振光的波長(zhǎng)λ為橫坐標(biāo)，以吸收系數(shù)之差Δε=εL-εR 為縱坐標(biāo)作圖，得到的圖譜即是圓二色光譜，簡(jiǎn)稱(chēng)CD。如果某手性化合物在紫外可見(jiàn)區(qū)域有吸收，就可以得到具有特征的圓二色光譜。在紫外可見(jiàn)光區(qū)域測(cè)定圓二色譜與旋光譜，可以推斷分子的構(gòu)型和構(gòu)象。DNA 的圓二色譜是由其骨架結(jié)構(gòu)中的不對(duì)稱(chēng)糖分子和由這些糖分子的構(gòu)型決定的螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的。根據(jù)靶分子對(duì)原有的DNA 圓二色譜信號(hào)的影響，以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的圓二色譜新信號(hào)的不同特點(diǎn)，不僅可以得知靶分子與DNA 具有相互作用，還可以推斷靶分子與DNA 結(jié)合的不同模式。這2 種方法被廣泛用于研究核酸適配體-靶標(biāo)的相互作用。利用這2 種方法測(cè)定出的適配體解離常數(shù)一般都在（100±30）nmol/L。

3.3 細(xì)菌靶標(biāo)核酸適配體親和力表征方法 細(xì)菌靶標(biāo)適配體的篩選，一般需要先將靶標(biāo)滅活，再分離純化菌體表面的蛋白質(zhì)、多糖分子，并以這些大分子作為靶標(biāo)進(jìn)行篩選，或者直接以全細(xì)胞菌體為靶標(biāo)篩選適配體。所以細(xì)菌靶標(biāo)篩選的方法類(lèi)似于小分子，全細(xì)胞靶標(biāo)的篩選，而篩選出的適配體進(jìn)行親和力表征方法也類(lèi)似于上述細(xì)胞，以及小分子靶標(biāo)的親和力表征方法，主要有：①紫外光譜法［9］：將適配體與靶標(biāo)的孵育混合物通過(guò)離心等方法分離后，使用熒光光譜儀測(cè)定核酸靶標(biāo)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度；②流式細(xì)胞儀法［10］：將孵育之后的復(fù)合物通過(guò)流式細(xì)胞儀，測(cè)定帶有熒光標(biāo)記的適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的數(shù)量；③表面等離子體共振法［11］：可以直接檢測(cè)適配體與靶標(biāo)的結(jié)合狀態(tài)，并能利用同種不同來(lái)源的菌株，或者不同種屬的其他細(xì)菌來(lái)檢測(cè)適配體的特異性。一般與靶標(biāo)的親和力越強(qiáng)，表明其特異性越強(qiáng)，與其他細(xì)菌的結(jié)合力很弱。適配體用于細(xì)菌檢測(cè)時(shí)的靈敏度還有很大的提升空間，使用熒光、同位素等手段標(biāo)記適配體，與其他傳感器、分析系統(tǒng)聯(lián)合使用可以降低檢測(cè)限。

3.4 其他 核酸適配體的親和力表征方法還可以通過(guò)高通量親和定量PCR 結(jié)合分析［12］，用核酸適配體雙鏈與靶標(biāo)孵育，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 對(duì)孵育過(guò)程中釋放的核酸適配體進(jìn)行定量分析。等溫滴定量熱法（ITC）［13］理論基于aptamer-靶標(biāo)復(fù)合物的形成是一個(gè)放熱過(guò)程，可以同時(shí)測(cè)定Kd值，化學(xué)計(jì)量比和熱力學(xué)性質(zhì)，攝取的熱必須與細(xì)胞樣品的結(jié)合部分和一定溫度下反應(yīng)的摩爾焓相關(guān)。根據(jù)大分子靶標(biāo)和適配體結(jié)合時(shí)構(gòu)象的改變，可以通過(guò)足跡分析法［14］測(cè)定其親和力，因?yàn)榕c靶標(biāo)結(jié)合的核酸適配體不會(huì)被核酸酶降解。

4 總結(jié)與展望

近年來(lái)，針對(duì)核酸適配體的報(bào)道已有很多，其優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用也廣泛展現(xiàn)于各種研究項(xiàng)目中。用于檢測(cè)靶標(biāo)-核酸適配體結(jié)合狀態(tài)的方法也越來(lái)越多，但沒(méi)有一種方法是堪稱(chēng)完美的。細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同一個(gè)細(xì)菌可能篩選出蛋白質(zhì)、多糖、鞭毛等的不同適配體，其親和力和特異性識(shí)別也較難檢測(cè)。而細(xì)胞篩選的適配體一般用于活體檢測(cè)，但是篩選是在體外進(jìn)行，細(xì)胞適配體能否在體內(nèi)很好的識(shí)別和結(jié)合靶標(biāo)，也是正在探索的問(wèn)題。隨著檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，需要的樣品量越來(lái)越少，Kd值的測(cè)定速度也越來(lái)越快，但許多檢測(cè)方法仍然受到限制，例如熒光偏振法和紫外光譜法需要對(duì)適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記或者其他修飾，可能會(huì)影響適配體的空間結(jié)構(gòu)，從而影響與靶標(biāo)的結(jié)合，而表面等離子體共振技術(shù)無(wú)需標(biāo)記，并且檢測(cè)速度較快，但是它的缺點(diǎn)在于難以區(qū)分非特異性吸附，并對(duì)溫度和樣品組成等干擾因素比較敏感。固定基質(zhì)的親和力檢測(cè)方法可能會(huì)引起非特異性結(jié)合，所以建議Kd值的測(cè)定最好在核酸適配體與靶標(biāo)溶液結(jié)合的情況下進(jìn)行。未來(lái)也可以聯(lián)合多種互補(bǔ)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行Kd值的相互印證，并了解核酸適配體與靶標(biāo)之間相互作用的機(jī)制，可以幫助對(duì)適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)，了解適配體與靶標(biāo)相互作用中誘導(dǎo)構(gòu)象的改變，測(cè)量結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和平衡常數(shù)，使核酸適配體-靶標(biāo)結(jié)合的親和力檢測(cè)速度更快、樣品消耗量更低、靈敏度更高。