劉海濤 舒端陽

（1 淮南師范學(xué)院生物工程學(xué)院 安徽淮南 232038 2 廣東省梅州市豐順中學(xué) 廣東梅州 514300）

RNAi（RNA interference）是由dsRNA（double strand RNA）在細(xì)胞內(nèi)被切割成siRNA（small interference RNA），從而引起的同源mRNA 特異性降解，針對性地關(guān)閉某個基因的表達(dá)，為人們研究具體某個基因的功能打開一扇窗戶，所以被廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域。然而要對某個基因進(jìn)行有效的沉默需要制備與此基因mRNA 同源的dsRNA，怎樣才能獲得此dsRNA？ 目前應(yīng)用比較廣泛的方法有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、構(gòu)建載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法等，本實驗通過構(gòu)建一個雙啟動子的表達(dá)載體，再體外轉(zhuǎn)錄制備dsRNA。

本實驗以鱗翅目昆蟲細(xì)胞色素c 基因片段為靶基因制備dsRNA，細(xì)胞色素c（cytochrome c，cyt c）是呼吸鏈中一種重要的蛋白質(zhì)，正常細(xì)胞在受到凋亡因子（例如紫外線）刺激時cyt c 就會從線粒體中釋放，激活caspase 家族蛋白酶，引起一系列的通訊級聯(lián)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。若將一個正常細(xì)胞的cyt c 的表達(dá)抑制后，用紫外線處理細(xì)胞還會發(fā)生凋亡，或者凋亡程度會不會減弱？這時即可用RNAi技術(shù)沉默cyt c 基因的表達(dá)。本實驗以鱗翅目昆蟲斜紋夜蛾（Spodoptera litura）的離體細(xì)胞株Sl-1 為研究材料［1］，制備其cyt c 基因的一段dsRNA。

1 實驗材料

PBS緩沖液、Sl-1細(xì)胞株、提取總RNA 的Tri-zol 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、DNA 連接酶、限制酶BamH I 和EcoR I、Taq 酶、RNA聚合酶、PCR 儀、帶有T7 雙啟動子的質(zhì)粒Litmus28i（圖1）、微量移液器、EP 管、培養(yǎng)皿、4 種核糖核苷酸（NTP）、4 種脫氧核苷酸（dNTP）、冷凍離心機(jī)、焦炭酸二乙酯（DEPC）。

2 實驗方法

2.1 提取總RNA［2］

1）取1 瓶對數(shù)期細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)量約1.5×106個），用PBS 洗滌后加入1 mL TRIzol；室溫靜置5 min 后移入1.5 mL 離心管中。

2）加入0.2 mL 氯仿，輕微振蕩15 s，冰上靜置2 min。

3）12000g/15 min，4℃離心后取上層水相，保留中間相和有機(jī)相（其中含有DNA 和蛋白質(zhì)）。

4）加入0.5 mL 異丙醇，輕輕混勻，冰上靜置10 min。

5）12000g/10 min，4℃離心，棄上清液。

6）加入1 mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀；7 500 g/5 min，4℃離心后棄上清液。

7）加入50 μL DEPC處理過的超純水溶解沉淀后取10 μL 用于瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示所提取RNA樣品中28S rRNA 亮度約為18S rRNA的2 倍，說明RNA 質(zhì)量較好（如圖2所示）。

2.2 體外轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建

1）用微量移液器取5 μL 總RNA 為模板，加入1 μL M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、1 mg dNTP，16℃條件下對總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。

2）以cDNA 為模板，設(shè)計cyt c 基因片段（長度為248 bp）的引物：

上游5′-GAATTCTGCCACACTGTTGAAGCCGGT3′

下游5′-GGATCCGATCTGCACGCTCGTTTGCCT3′

引物兩頭分別加上EcoR I 和BamH I 的酶切位點，PCR 反應(yīng)（圖3）。

3）PCR 產(chǎn)物測序正確后，電泳切膠回收。

4）37℃條件下加入EcoRⅠ和BamH Ⅰ對純化后的片段和質(zhì)粒Litmus28i 同時進(jìn)行酶切反應(yīng)3 h。

5）分別將雙酶切后的片段和質(zhì)粒純化后進(jìn)行連接反應(yīng)，4℃，10h 得到重組DNA 分子（圖4）。

6）為保證重組DNA 分子插入正確，用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ同時進(jìn)行雙酶切驗證，電泳檢測插入正確（圖5）。

2.3 體外轉(zhuǎn)錄

1）將重組DNA 分子分為2 份，分別用BamHⅠ和EcoR Ⅰ進(jìn)行酶切，作為體外轉(zhuǎn)錄模板（圖6）。

2）加入1 μL RNA 聚合酶、NTP 2 mg 及緩沖液，37℃水浴使轉(zhuǎn)錄持續(xù)進(jìn)行4 h 后，65℃加熱變性5 min 后迅速冰浴使2 種互補(bǔ)的單鏈RNA 退火形成dsRNA，電泳檢測（圖7）。

此時的dsRNA 序列與斜紋夜蛾cyt c 基因的一段是完全同源的，可以利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Sl-1 細(xì)胞，進(jìn)行RNAi 的相關(guān)實驗。

3 討論及意義

體外轉(zhuǎn)錄實驗?zāi)芊癯晒χ饕Q于的限制酶選擇，只有選擇切口為5′-突出末端（5′-overhang）或平末端（blunt-end）限制酶才能成功進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，本實驗選用的限制酶EcoR I 和BamH I 都屬于5′-突出末端；若所采用的限制酶（如Pst I）切出的切口為3′-突出末端（3′-overhang），則RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄結(jié)束后無法與模板脫離，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失敗。

RNA 干擾現(xiàn)象廣泛存在于多種生物，有效地組織外源病毒的侵染、參與機(jī)體發(fā)育、調(diào)節(jié)基因的表達(dá)等，因此研究RNAi 具有重要的意義。然而研究RNAi 的前提就是如何高效地制備相應(yīng)的dsRNA。

最初研究人員是通過化學(xué)合成的方法直接合成siRNA 用于實驗，這種方法最為簡單，客戶只要知道相應(yīng)目的基因的堿基序列，生物公司就會根據(jù)其要求提供高質(zhì)量的siRNA，不過價格十分昂貴，且需要在靶基因中事先篩選出一段最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成，因此定制周期較長。

2002年，Novina CD 等［3］開發(fā)出一種利用腺病毒感染的方法將靶基因帶入受體細(xì)胞，達(dá)到了較高的轉(zhuǎn)染率且能持續(xù)穩(wěn)定地在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出siRNA，因此利用病毒載體是目前唯一一種可以長期研究RNAi 的方法，而且相比于化學(xué)合成這種方法的成本低。但是病毒載體只能轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞，對于果蠅、線蟲和斑馬魚這類生物則無能為力。

然而，通過構(gòu)建表達(dá)載體在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄合成dsRNA 的費用相比于化學(xué)合成法要低得多，也能較快地得到dsRNA。一旦得到靶基因的模板序列，只要48 h 就可以RNAi 實驗，通常一次體外轉(zhuǎn)錄得到的dsRNA 可以進(jìn)行上百次的RNAi 實驗。利用脂質(zhì)體可以將dsRNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞，雖然轉(zhuǎn)染效率略低于病毒載體，但是脂質(zhì)體包裹著這些siRNA 可以與哺乳動物、線蟲、魚類、果蠅和各種植物的細(xì)胞發(fā)生融合，因此體外轉(zhuǎn)錄是目前進(jìn)行RNAi 最有效的手段。