李秀福，賈世峰，耿彤瑤，王新月，張琪，馬冬，李鷗

(1華北理工大學(xué)研究生學(xué)院，河北唐山063000；2華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院；3唐山工人醫(yī)院)

宮頸癌是導(dǎo)致全世界婦女癌癥相關(guān)死亡的第4大原因[1]。目前研究表明，高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續(xù)感染是其發(fā)生、發(fā)展的必要因素[2,3]。然而，宮頸局部免疫平衡狀態(tài)的改變?cè)贖R-HPV感染轉(zhuǎn)歸中具有重要作用。而白細(xì)胞介素10(IL-10)作為一種具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子對(duì)宮頸癌變的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用，當(dāng)其在人體內(nèi)大量合成可抑制免疫系統(tǒng)的調(diào)控，引起HPV病毒入侵，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。IL-10作為TH2型細(xì)胞因子，其表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平[4]。盡管最新研究表明，miR-125a靶向調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)揮抑制增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移作用[5]，但是在免疫平衡調(diào)節(jié)中作用的研究未見報(bào)道。本文進(jìn)行了相關(guān)探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年9月～2017年3月唐山工人醫(yī)院住院部就診的宮頸鱗癌患者(接受根治性子宮切除及盆腔淋巴結(jié)切除術(shù))的術(shù)中切除病理標(biāo)本56例份(宮頸癌組)，納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；病理明確診斷為宮頸鱗癌；術(shù)前未接受過放、化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前3個(gè)月內(nèi)曾行宮頸治療，如陰道用藥、激光治療等；患者為妊娠狀態(tài)；合并其他婦科惡性腫瘤，如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等；合并其他臟器腫瘤，如腸道、乳腺腫瘤等。其中患者年齡40～69(55.27±6.18)歲，病程1～3(2.12±0.28)年；按宮頸癌國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)(2000年)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期[6]：Ⅰ期34例，Ⅱ期22例；組織分化程度：高、中分化37例，低分化19例；有淋巴轉(zhuǎn)移11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；腫瘤直徑>40 mm者15例，≤40 mm者41例。另選同期行全子宮切除術(shù)的子宮良性病變患者術(shù)中切除病理標(biāo)本40例份作為對(duì)照組，患者年齡40～65(52.76±5.32)歲，病程1～4(2.78±0.62)年。兩組年齡有可比性。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：因子宮良性病變而行全子宮切除術(shù)者，如子宮肌瘤、子宮腺肌癥等；宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查未見非典型鱗狀細(xì)胞或癌細(xì)胞。排除標(biāo)準(zhǔn)同宮頸癌組。取組織標(biāo)本前均未行放、化療或免疫治療。標(biāo)本收集后于-80 ℃冰箱保存。所有患者知情同意，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 宮頸組織中miR-125a、STAT3、IL-10 mRNA表達(dá)的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[7,8]方法采用RT-qPCR法檢測(cè)miR-125a mRNA，qRT-PCR法檢測(cè)STAT3 mRNA和IL-10 mRNA。將液氮保存的宮頸組織按TRIzol試劑盒說明書提取組織總RNA，以RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，75 ℃、15 min。miR-125a的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACA-3′；反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系按試劑盒說明配制。具體引物序列：miR-125a-F：5′-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCCTTTAA-3′;miR-125a-R:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3′;STAT3-F:5′-AAGAGGCGGCAACAGATT-3′;STAT3-R:5′-CGGTCTTGATGCCGAGGG-3′;IL-10-F: 5′-ACAAAG-GAAGGAGGGGTTCAC-3′;IL-10-R:5′-AGAAGTGGA-CTCAGCATGGG-3′;U6-F:5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′;U6-R:5′-GAGAGGGAAATCGTGCGT-GAC-3′;GAPDH-F:5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTA-A-3′;GAPDH-R: 5′-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3′。 miR-125a、STAT3和IL-10 mRNA三者PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，72 ℃、35 s共40個(gè)循環(huán)，記錄循環(huán)閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-125a、STAT3和IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，比較兩種標(biāo)本miR-125a mRNA、STAT3 mRNA、IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量。miR-125a mRNA以U6為內(nèi)參基因，STAT3 mRNA、IL-10 mRNA以GAPDH為內(nèi)參基因。

1.3 宮頸組織中STAT3和IL-10蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)Elivision二步法。按照試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。一抗抗體分別采用鼠抗人STAT3(Proteinch，1∶100比例稀釋)、鼠抗人IL-10(Proteinch，1∶80比例稀釋)，二抗采用通用型HRP標(biāo)記兔抗鼠抗體，DAB顯色。陰性對(duì)照組中，以PBS液代替一抗。染色結(jié)果判定：STAT蛋白以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽性著色，少數(shù)位于細(xì)胞核；IL-10染色為棕黃色或褐色顆粒，多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)。參照Mattern等[9]的方法進(jìn)行判定。陽性染色深度：未見染色為0分，輕度染色(淺黃色)為1分，中度染色(棕黃色)為2分，深度染色(棕褐色)為3分；陽性細(xì)胞百分比：未見染色為0分，染色細(xì)胞小于25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。兩方面得分相加，0～2分判為陰性表達(dá)，>2分判為陽性表達(dá)，隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(×50倍)，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，取均值。

2 結(jié)果

2.1 宮頸組織中miR-125a、STAT3和IL-10 mRNA的表達(dá) 宮頸癌組、對(duì)照組中miR-125a mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為4.20±0.79、11.02±3.20，與對(duì)照組比較，宮頸癌組miR-125a mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；宮頸癌組、對(duì)照組中STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為5.21±1.70、1.00±0.34；IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為5.82±1.34、0.81±0.56；與對(duì)照組相比，宮頸癌組STAT3和IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均升高(P均<0.05)。

2.2 宮頸組織中STAT3和IL-10蛋白的表達(dá) STAT3蛋白陽性信號(hào)呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，彌漫或局灶性分布于腫瘤細(xì)胞質(zhì)及核周，而腫瘤間質(zhì)組織未見STAT3蛋白陽性染色。IL-10染色為棕黃色或褐色顆粒，多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于細(xì)胞核。與對(duì)照組相比，宮頸癌組STAT3表達(dá)強(qiáng)，宮頸癌組中STAT3陽性表達(dá)率高[69.7%(39/56)比22.5%(9/40)](χ2=20.74，P<0.01)；與對(duì)照組相比，宮頸癌組IL-10陽性表達(dá)率高[(58.9%(33/56)比7.5%(3/40)](χ2=27.12，P<0.01)。

2.3 宮頸癌組織miR-125a及STAT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與患者臨床病理特征的關(guān)系 宮頸癌組miR-125a mRNA的表達(dá)水平與宮頸癌的組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與年齡、腫瘤大小無關(guān)(P均>0.05)；宮頸癌組STAT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與年齡、腫瘤大小、FIGO分期無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 宮頸癌組織miR-125a和STAT3 mRNA表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 宮頸癌組織中miR-125a mRNA與STAT3、IL-10 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，宮頸癌組中，STAT3 mRNA和miR-125a mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.285 4，P=0.024 5)；IL-10和STAT3的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.457 8，P=0.000 4)。

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見惡性腫瘤[10]。迄今為止，每年有529 800個(gè)新增病例，死亡病例275 100個(gè)，且多發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家[11]。臨床治療手段包括手術(shù)、放療及化療，后兩種治療手段會(huì)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持久而顯著的影響。目前，宮頸癌的免疫治療逐漸成為研究的熱點(diǎn)。前期研究表明，宮頸局部免疫狀態(tài)的改變?cè)趯m頸癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[12]。IL-10是一種具有免疫抑制作用的因子，通過多種途徑抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用，造成HR-HPV的持續(xù)感染進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[13]。IL-10基因的表達(dá)主要是通過啟動(dòng)子區(qū)一系列轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進(jìn)行調(diào)控，例如STAT3[14]，STAT3是STATS家族重要成員之一，在對(duì)照組織中多數(shù)呈低表達(dá)水平，而在多種惡性腫瘤中往往呈持續(xù)性高表達(dá)。研究表明，STAT3的高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如肝癌[15]、胃癌[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，STAT3 mRNA和蛋白在宮頸癌組中均呈高表達(dá)，且隨著宮頸癌分化程度降低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，STAT3的表達(dá)進(jìn)一步提高。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，STAT3和IL-10的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，且免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，宮頸癌組STAT3及IL-10的蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，提示STAT3可能通過調(diào)控IL-10的表達(dá)，從而使宮頸局部免疫狀態(tài)失衡，造成HR-HPV持續(xù)感染，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，但兩者具體調(diào)控機(jī)制尚未明確。

通過在線預(yù)測(cè)軟件TARGETSCAN發(fā)現(xiàn)，STAT3與miR-125a存在結(jié)合位點(diǎn)。眾所周知，miRNAs需通過相應(yīng)的靶向基因才能發(fā)揮多種生物學(xué)過程，包括腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。miR-125a位于染色體19q13上，在不同病理類型腫瘤中具有促癌和抑癌作用[17]，在不同腫瘤中表達(dá)程度亦不相同，有可能成為治療惡性腫瘤的新靶點(diǎn)或腫瘤標(biāo)記物[18]。Zheng等[19]發(fā)現(xiàn)，miR-125a在肝癌中低表達(dá)，可作為其發(fā)展進(jìn)程的標(biāo)志物，在肝癌病程進(jìn)展中起到監(jiān)測(cè)作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，宮頸癌組miR-125a的相對(duì)表達(dá)量下降，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，且隨著腫瘤向晚期進(jìn)展、分化程度降低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，miR-125a的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步降低，與患者的年齡及腫瘤大小無明顯相關(guān)性。進(jìn)一步研究顯示，在宮頸癌組中，STAT3和miR-125a的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-125a與STAT3可能存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系，宮頸癌中miR-125a、STAT3和IL-10之間相互作用，形成免疫逃逸，促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展，但三者具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

綜上所述，隨著宮頸癌惡性程度的進(jìn)展，miR-125a表達(dá)水平降低，可使STAT3的表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)一步提高IL-10的表達(dá)水平，造成免疫逃逸，使HR-HPV持續(xù)感染，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，本研究為治療宮頸癌提供了新靶點(diǎn)。

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