范華華，孫厚杰，韓建華，蔡小軍

(遵義市第一人民醫(yī)院·遵義醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

脊柱結核致殘率高，嚴重威脅人類健康，目前病灶清除植骨融合內固定術已成為脊柱結核外科治療的經典術式[1]。相關植骨材料的研究發(fā)現(xiàn)也成為人們關注的熱門課題，自體骨因供骨量不足，異體骨宿主反應甚至疾病傳播，使其應用受到一定限制。目前常用鈦網(wǎng)進行植骨支撐融合，但鈦網(wǎng)植骨無法了解植骨融合情況,且鈦網(wǎng)易移位及下降,導致融合失敗、再發(fā)畸形等并發(fā)癥。納米羥基磷灰石/聚酰胺66(n-HA/PA66)復合生物材料因其具有良好生物相容性、骨傳導性、成骨活性及生物力學特性，已被應用于創(chuàng)傷脊柱外科[2～4]。然而由于脊柱結核屬感染性病灶，結核分枝桿菌對n-HA/PA66復合材料是否能像鈦網(wǎng)等金屬材料一樣產生惰性，是否會黏附材料表面或聚集在材料內，國內外文獻暫未見相關報道。2015年1月～2017年3月,本研究通過建立兔脊柱結核動物模型，然后在病灶內植入n-HA/PA66復合材料人工椎體，觀察植骨融合及結核治療情況，為臨床應用提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康新西蘭白兔60只，由遵義醫(yī)學院動物實驗中心提供，雌雄不限，體質量2.0～3.0 kg，結核菌素試驗陰性。飼養(yǎng)條件：動物房嚴格消毒，溫度23 ℃，相對濕度70%，標準兔高壓飼料飼養(yǎng)。人型結核分枝桿菌H37Rv標準菌株混懸液(1×107cfu/mL)購自新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，4 ℃冷藏保存。弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司。實驗植骨材料：n-HA/PA66復合生物材料人工椎體購自四川國納科技有限公司提供；鈦網(wǎng)及內固定材料購自山東威高醫(yī)療器械有限公司。

1.2 模型制備 新西蘭白兔背側頸跟部皮內注射弗氏完全佐劑0.1 mL，其中3只于注射后3周腹瀉死亡，剩余57只新西蘭白兔于致敏后1個月頸部皮膚發(fā)現(xiàn)直徑0.9～1.8 cm硬結，皮膚無破潰。取致敏的57只新西蘭白兔，將其腰背部脫毛(直徑約12 cm)，取左側臥位，將其固定在兔專用板上。采用氯胺酮、安定、阿托品(比例:2 mL∶2 mL∶1 mL，用生理鹽水稀釋1倍)進行聯(lián)合麻醉，經耳緣靜脈緩慢注入(2.5 mL/kg)。麻醉后，沿右側第12肋末向下至髂嵴作一縱行切口(長約6 cm)，將腰4、5椎體顯露；于腰5椎體上部近椎間盤處，從右前方向左后方(與椎體遠端呈30°)進入，鉆骨孔(深約0.5 cm、孔徑約0.25 cm)，止血后填入醫(yī)用明膠海綿。然后用注射器緩慢將結核菌懸液(0.1 mL)注于明膠海綿上。最后用1-0絲線間斷關閉切口、關閉深筋膜，于皮下涂灑30萬U/只注射用青霉素粉劑，無菌紗布覆蓋并固定。術后觀察動物一般情況，包括動物進食、活動、精神狀態(tài)、切口情況。如動物切口出現(xiàn)感染，立即淘汰。術后1～2個月內觀察癥狀，術后2個月行X線片、CT、MRI檢查，觀察膿腫和死骨形成、病灶數(shù)目、病變范圍、骨質破壞程度、脊髓受壓、椎間盤異常情況，并進行解剖學及組織病理學變化觀察以驗證模型是否成功建立。57只新西蘭白兔，造模術后20 d因進食不良死亡2只，造模后47 d，結核全身播散死亡2只，切口感染死亡1只，實際存活52只。成功率為86.67%(52/60)。

1.3 分組及處理 造模后2個月，隨機選取36只造模成功新西蘭兔分為兩組，鈦網(wǎng)植骨組和n-HA/PA66植骨組，每組18只。植骨融合內固定術：麻醉及顯露同建模術，清理周圍膿液，制備植骨床，取自體髂骨松質骨顆粒填充至鈦網(wǎng)中,將植骨材料鈦網(wǎng)及n-HA/PA66分別植入鈦網(wǎng)植骨組和n-HA/PA66植骨組植骨床內，微型指鈦鋼板固定牢固，術后采用異煙肼5 μg/(kg·d)、利福平1.25 mg/(kg·d)抗結核治療。

1.4 觀察指標及其評價或檢測方法 分別于術后1 d、1個月、2個月、3個月兩組各取6只實驗兔行X線檢查，術后3個月采用Lane-Sandhu法[5]根據(jù)X線檢查結果對骨形成、骨連接及骨塑型情況進行評分。骨形成情況：無骨形成為0分，骨形成占缺損15%～25%為1分，骨形成占缺損26%～50%為2分，骨形成占缺損51%～75%為3分，骨形成占缺損76%至充滿缺損區(qū)為4分；骨連接情況：骨折線清晰為0分，骨折線部分存在為1分，骨折線消失為2分；骨塑型情況：未見塑型為0分，髓腔形成為2分，皮質骨塑型為4分。骨形成、骨連接及骨塑型三項評分相加取平均值。ESR、血清CRP：分別于術前、術后1、3個月經實驗兔耳緣靜脈采集靜脈血1.5 mL，采用血沉檢測儀檢測ESR。離心機以3 000 r/min離心5 min,取血清。采用ELISA法檢測血清CRP。結核分枝桿菌對植骨材料的黏附能力：術后1 d，兩組各取6只實驗兔，用異戊巴比妥鈉麻醉后將其處死，原切口進入術區(qū)，將植入材料取出，用PBS溶液清洗3次，沖掉未黏附的細菌，置于3%戊二醛于4 ℃下固定過夜，用PBS溶液清洗3次，梯度乙醇脫水，零界點干燥過夜，表面噴金，用掃描電鏡觀察，隨機選取10個視野(×5 000)計數(shù)黏附的結核分枝桿菌數(shù)目，取平均值。

2 結果

2.1 兩組骨形成、骨連接及骨塑型情況 術后1 d兔子飲食差、活動少，手術切口無明顯紅腫、滲液。術后1個月，n-HA/PA66植骨組材料兩端可見骨痂形成，且材料與自體骨界限不清；鈦網(wǎng)植骨組未見明顯骨痂形成，材料與自體骨間隙仍較清楚。術后2個月，n-HA/PA66植骨組材料周圍大量骨痂形成，材料與自體骨界面模糊；鈦網(wǎng)植骨組材料兩端有骨痂形成，但明顯較n-HA/PA66植骨組少；術后3個月兩組材料均與自體骨結合，對位對線好，材料與自體骨界面模糊，有大量新生骨痂包裹材料，n-HA/PA66植骨組骨痂明顯多于鈦網(wǎng)植骨組。術后3個月，n-HA/PA66植骨組Lane-Sandhu評分為(6.92±2.05)分，鈦網(wǎng)植骨組為(4.10±1.14)分，n-HA/PA66植骨組Lane-Sandhu評分高于鈦網(wǎng)植骨組(P<0.05)。

2.2 兩組手術前后ESR、血清CRP水平比較 術前兩組ESR、血清CRP水平比較，P均>0.05;術后1、3個月兩組ESR、血清CRP水平均較術前降低(P均<0.05)；術后1個月，n-HA/PA66植骨組ESR、血清CRP水平均低于鈦網(wǎng)植骨組(P<0.05)；術后3個月兩組ESR、血清CRP水平比較，P均>0.05。見表1。

2.3 結核分枝桿菌對植骨材料的黏附能力比較 n-HA/PA66植骨組光滑表面黏附的結核分枝桿菌數(shù)目為(3.47±1.15)個/視野，粗糙表面黏附的結核分枝桿菌數(shù)目為(15.04±6.40)個/視野；鈦網(wǎng)植骨組光滑表面黏附的結核分枝桿菌數(shù)目為(30.20±7.15)個/視野，粗糙表面黏附的結核分枝桿菌數(shù)目為(49.32±10.24)個/視野。兩組比較,P均<0.05。

表1 兩組手術前后ESR、血清CRP水平比較

3 討論

脊柱結核屬特異感染性疾病，過去一直認為在感染病灶中植入內植物會導致結核分枝桿菌在其表面黏附聚集，且抗生素難以到達內植物表面，有使感染經久不愈甚至擴散的風險[5]。Oga等[6]從細菌黏附的角度研究表明，與金葡菌比較，結核分枝桿菌不易黏附金屬異物表面。Ha等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，結核分枝桿菌對鈦合金異物的親和力、黏附性較小，增殖力弱，產生小又薄生物膜，為結核病灶中植入內植物的安全可行性提供了理論依據(jù)。由于鈦金屬組織相容性好，取材方便，支撐固定可靠，克服自體骨取骨量大、異體骨易發(fā)生宿主反應，甚至引起疾病傳播等缺點，鈦網(wǎng)作為一種植骨支撐材料目前已被多數(shù)專家學者所接受并普遍應用于脊柱結核病灶清除后植骨融合環(huán)節(jié)。有研究[8,9]表明，應用鈦網(wǎng)植骨2年以上，前柱高度有不同程度的丟失，一般術后丟失4°～6°；另外，X射線遮擋效應不利于觀察椎體間融合情況，鈦網(wǎng)價格昂貴。

n-HA/PA66復合生物材料中的羥基磷灰石作為骨修復替代材料具有良好的生物相容性[10],聚酰胺具有骨膠原類似的結構，生物相容性良好。將n-HA/PA66材料用于修復兔橈骨缺損，顯示出該材料具有良好的成骨能力[11]。臨床觀察中，n-HA/PA66復合生物活性材料具有良好的生物相容性和安全性，未發(fā)現(xiàn)該材料的不良反應[12,13]。通過國內許多實驗研究和臨床觀察已初步發(fā)現(xiàn)，n-HA/PA66復合材料作為良好的植骨填充材料，應用于修復非感染性骨缺損安全有效。然而該復合材料應用在感染性骨缺損中的動物實驗和臨床研究國內鮮見有報道。四川達州市人民醫(yī)院報道臨床應用該復合生物材料治療脊柱結核“效果滿意”[14]，我們認為該新生材料在沒有大量動物實驗研究結果支持下盲目應用于臨床脊柱結核患者是一種冒險且有悖于倫理道德的行為；報道中“效果滿意”缺乏評價標準，缺乏影像學資料證實及長期隨訪觀察。

本課題擬對兔腰5椎體實施H37Rv結核菌懸液攻毒建模后，分別植入n-HA/PA66和鈦網(wǎng)，比較兩種植骨材料在脊柱結核中的應用效果。術后1～3個月兩組植入的材料逐漸被新生骨痂包裹，且逐漸與自體骨融合，但n-HA/PA66植骨組術后1個月即有大量骨痂生成，且與自體骨融合。術后3個月，n-HA/PA66植骨組Lane-Sandhu評分高于鈦網(wǎng)植骨組。提示與鈦合金比較，n-HA/PA66復合材料能更快地促進骨痂生成及骨融合，說明HA/PA66復合材料的相容性更好。

ESR、CRP是臨床監(jiān)測早期感染、病情進展的重要指標，二者水平變化可反映炎癥反應和組織損傷程度[15]。術后1、3個月兩組ESR、血清CRP水平均較術前降低，術后1個月n-HA/PA66植骨組ESR、血清CRP水平較鈦網(wǎng)植骨組低。說明n-HA/PA66材料能降低脊柱結核兔模型炎癥指標水平，從而減輕實驗動物的炎癥狀態(tài)。探討細菌對生物材料的黏附能力，可為該材料臨床應用的安全性進行評價。結核分枝桿菌對n-HA/PA66復合材料的黏附能力弱于鈦網(wǎng)。本研究中n-HA/PA66植骨組光滑表面與粗糙表面黏附的結核分枝桿菌數(shù)均少于鈦網(wǎng)植骨組，與文獻報道一致。說明n-HA/PA66復合材料用于臨床比較安全。

綜上所述，n-HA/PA66復合材料植入可促進脊柱結核兔模型骨融合進展及骨痂生長，降低ESR、血清CRP水平，且材料表面黏附的結核分枝桿菌少，效果優(yōu)于鈦網(wǎng)植入。但本研究時間短，未對比鈦網(wǎng)與n-HA/PA66復合材料植骨融合在治愈率、融合率、復發(fā)率及不良事件等方面的差異，后期研究中將對以上問題進行探討。

參考文獻：

[1] 施建黨,王自立,馬小民.病灶清除植骨內固定治療相鄰多椎體脊柱結核[J].中國脊柱脊髓雜志,2010,20(2):98-102.

[2] Wang X, Li Y, Wei J, et al. Development of biomimetic nano-hydroxyapatite/poly(hexamethylene adipamide) composites[J].Biomaterials, 2002,23(24):4787-4791.

[3] 廖建國,李艷群,段星澤,等.納米羥基磷灰石/聚合物復合骨修復材料[J].化學進展,2015,27(Z1):220-228.

[4] 盧旻鵬,王群波,董靖,等.納米羥基磷灰石/聚酰胺66/富血小板血漿復合物修復兔股骨中段骨缺損的實驗研究[J].重慶醫(yī)學,2015,44(7):885-887.

[5] 孟純陽,安洪,蔣電明.新型骨關節(jié)修復重建復合材料(n-HA/PA66)的生物活性及近期對機體鈣磷代謝的影響[J].中國骨與關節(jié)損傷雜志，2005，20(10)：34-36.

[6] Oga M, Arizono T, Takasita M, et al. Evaluation of the risk of instrumentation as a foreign body in spinal tubereulosis.Clinical and biologic study[J]. Spine, 1993,18(13)：1890-1894.

[7] Ha KY, Chung YG, Ryoo SJ. Adherence and biofilm formation of staphylococcus epidermidis and mycobacterium tuberculosis on various spinal implants[J]. Spine, 2005，30(1)：38-43.

[8] Molinari RW, Bridwell KH, Klipps SJ, et al. Minimum 5-year follow up of anterior column structural allografts in the thoracic and lumbar spine[J]. Spine, 1999，24(1)：967-972.

[9] Verlaan JJ, Dieekerhof CH, Buskens E, et al. Surgical treatment of traumatic fractures of thoracic and lum bar spine：a systematic review of the literature on techniques complications and outcome[J]. Spine, 2004，29(7)：803-814.

[10] Sepulveda P, Bressiani AH, Bressiani JC, et al. In vivo evaluation of hydroxyapatite foams[J]. J Biomed Mater Res, 2002，62(4)：587-929.

[11] 孟純陽,安洪,蔣電明,等.網(wǎng)孔納米羥基磷灰石/聚酰胺人工骨修復兔橈骨缺損的實驗研究[J].中華創(chuàng)傷雜志，2005，21(3)：201-205.

[12] 歐云生,蔣電明,權正學,等.n-HA/PA66復合生物活性人工椎體支撐植骨治療胸腰椎爆裂型骨折合并截癱[J].中國臨床醫(yī)學,2007,14(3):413-415.

[13] 蔣電明,權正學,歐云生,等.n-HA/PA66復合生物活性支撐材料在重建椎體結構中的初步臨床應用[J].重慶醫(yī)學，2007,36(2):1010-1012.

[14] 王群波.應用納米羥基磷灰石/聚酰胺66復合人工椎體治療脊椎結核[J].四川醫(yī)學,2006,27(4):391-392.

[15] 岳學鋒，王鵬，施建黨，等.ESR 及CRP 在兔脊柱結核模型構建中的變化規(guī)律研究[J].安徽醫(yī)科大學學報，2017,52(6)：833-838.