王佳奕，王 綪，丁 武*

冷卻肉以營(yíng)養(yǎng)豐富、鮮嫩多汁等特點(diǎn)深受消費(fèi)者歡迎，是我國(guó)的主要肉類消費(fèi)產(chǎn)品[1]。冷卻肉又稱冷鮮肉，是指對(duì)嚴(yán)格執(zhí)行檢疫制度屠宰后的畜禽胴體迅速進(jìn)行冷卻處理，使胴體溫度（以后腿為測(cè)量點(diǎn)）在24 h內(nèi)降至0～4 ℃，并在后續(xù)的加工、流通和零售過程中始終保持在0～4 ℃范圍內(nèi)的預(yù)冷加工肉制品[2]。但0～4 ℃貯藏條件下冷卻肉的貨架期較短，這主要是由豬肉中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、水分等引起微生物生長(zhǎng)繁殖和脂質(zhì)氧化導(dǎo)致的[3]。多項(xiàng)研究表明，利用涂膜保鮮技術(shù)可以抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖以及脂肪氧化，實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)冷卻肉貨架期的目的[4-7]。

殼聚糖（β-（1,4）-2-氨基-脫氧-D-吡喃葡萄糖）是甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物，具有良好的生物相容性、成膜性以及抗菌性[8]。由于分子間的氫鍵作用，殼聚糖在生理溶液中溶解性較差，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。殼聚糖納米顆粒作為活性物質(zhì)載體受到廣泛關(guān)注，Mao Haiquan[9]和Qi Lifeng[10]等在研究中將殼聚糖納米粒應(yīng)用于基因載體和藥物遞送系統(tǒng)。殼聚糖納米粒常用殼聚糖與三聚磷酸鹽通過離子凝膠化法進(jìn)行制備[11]?；诩{米顆粒的量子尺寸效應(yīng)，與殼聚糖相比，殼聚糖納米顆粒具有更強(qiáng)的抗微生物活性[10]。

山梨酸是國(guó)際衛(wèi)生組織推薦使用的一種安全高效的保鮮劑，可以參與人體新陳代謝，對(duì)霉菌和酵母的生長(zhǎng)有良好抑制作用[12]；但山梨酸水溶性較差，限制了它的使用范圍。本研究采用離子凝膠法制備山梨酸納米微粒，改善山梨酸分散性，擴(kuò)大山梨酸的使用范圍，利用納米粒的緩釋性能使山梨酸更好地發(fā)揮抑菌作用。目前，國(guó)內(nèi)外鮮見山梨酸納米微粒在冷卻肉保鮮中的研究。

本研究采用前期優(yōu)化工藝制備山梨酸納米微粒[13]對(duì)冷卻豬肉進(jìn)行涂膜處理，分別用空白納米微粒、山梨酸鉀以及未經(jīng)處理的冷卻豬肉作為對(duì)照，通過測(cè)定各處理組的菌落總數(shù)、霉菌和酵母總數(shù)、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值、pH值和肉樣紅度等指標(biāo)，考察山梨酸納米微粒的抑菌及抗氧化效果，旨在為延長(zhǎng)冷卻肉的貨架期提供理論依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度≥95%）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）、山梨酸（均為分析純） 上海阿拉丁試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、生物試劑 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；85-2恒溫測(cè)速磁力攪拌器 金壇榮華儀器制造公司；UV-2500紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；WSC-S測(cè)色色差計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；WGP-400智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱箱 寧波海曙賽福試驗(yàn)儀器廠；PHS-3C酸度計(jì) 上海日島科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山梨酸納米微粒的制備

山梨酸納米微粒及空白納米微粒的制備參照武陶等[13]的方法，采用離子凝膠化法進(jìn)行。

精確稱取適量殼聚糖，室溫下于10 g/L冰醋酸溶液中溶解，將溶液pH值調(diào)至5，用0.45 μm微孔濾膜過濾后在室溫下攪拌過夜，獲得1 mg/mL的殼聚糖溶液。精確稱取1.5 g TPP，溶于1 L超純水，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，獲得1.5 mg/mL TPP水溶液。精確稱取0.5 g山梨酸粉末，溶于1 L乙醇，獲得0.5 mg/mL山梨酸溶液。

將12 mL 0.5 mg/mL山梨酸溶液逐滴（2～3 滴/秒）加入30 mL 1 mg/mL殼聚糖溶液中，室溫下攪拌30 min，再逐滴（2～3 滴/秒）加入4 mL 1.5 mg/mL TPP溶液，室溫下攪拌40 min，其中攪拌速率為600 r/min，最終溶液中殼聚糖、TPP、山梨酸的物質(zhì)的量之比為5∶1∶1，溶液中的殼聚糖和TPP經(jīng)陰陽(yáng)離子靜電作用交聯(lián)包埋山梨酸形成山梨酸納米微粒。獲得的山梨酸納米微粒粒徑為335.4 nm，包埋率為70%。

據(jù)了解，目前全國(guó)各大醫(yī)院都會(huì)舉行莊嚴(yán)而隆重的藥師宣誓儀式,這些充滿正能量的宣誓儀式，讓藥師感受到這個(gè)職業(yè)的神圣，深切體會(huì)到肩負(fù)的責(zé)任與擔(dān)當(dāng)。例如，北京大學(xué)第三醫(yī)院藥劑科，每一位新藥師在正式上崗之前，都有一次鄭重的宣誓儀式。宣誓儀式是激勵(lì)年輕藥師的一項(xiàng)舉措，讓年輕的藥師認(rèn)識(shí)到自己所從事職業(yè)的重要性，從而以嚴(yán)肅認(rèn)真的態(tài)度來面對(duì)藥學(xué)工作，發(fā)揮更大的作用[13]。

將4 mL 1.5 mg/mL TPP溶液逐滴（2～3 滴/秒）加入30 mL 1 mg/mL殼聚糖溶液中，室溫下攪拌40 min，攪拌速率為600 r/min，殼聚糖與TPP的物質(zhì)的量之比為5∶1，溶液經(jīng)陰陽(yáng)離子靜電作用交聯(lián)形成空白納米微粒，作為對(duì)照。

山梨酸鉀溶液：其質(zhì)量濃度與山梨酸納米微粒中包埋的山梨酸質(zhì)量濃度相同。

1.3.2 肉樣處理

將購(gòu)買的新鮮豬肉置于4 ℃冰箱24 h進(jìn)行冷卻排酸處理后，在超凈工作臺(tái)中分割成200 g左右的肉塊。隨機(jī)分為4 組，每組3 塊，一組作為空白對(duì)照組，不作任何處理。另外3 組分別用山梨酸納米微粒、空白納米微粒、山梨酸鉀溶液進(jìn)行浸漬處理，每組樣品浸漬8 min，取出瀝干10 min，用聚氯乙烯保鮮膜包裝，置于4 ℃冰箱冷藏。

以處理當(dāng)天為計(jì)時(shí)起點(diǎn)第0天，分別在貯藏的15 d內(nèi)的第1、4、7、10、13、15天定期對(duì)冷卻豬肉的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

菌落總數(shù)采用GB/T 4789.2—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[14]中規(guī)定的方法測(cè)定。根據(jù)GB/T 9959.2—2008《分割鮮、凍豬瘦肉》[15]將評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為三級(jí)：一級(jí)鮮度菌落總數(shù)小于1×104CFU/g，二級(jí)鮮度在1×104～1×106CFU/g之間，變質(zhì)肉大于1×106CFU/g。

霉菌和酵母總數(shù)采用GB 4789.15—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母總數(shù)測(cè)定》[16]中規(guī)定的方法測(cè)定。

TVB-N含量采用GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[17]中的半微量定氮法測(cè)定。根據(jù)GB/T 9959.2—2008進(jìn)行評(píng)價(jià)，要求TVB-N含量小于15 mg/100 g[15]。

TBARS值的測(cè)定方法在Nam等[18]的方法上加以改進(jìn)，采用雙波長(zhǎng)600 nm和532 nm比色測(cè)定的方法。

pH值的測(cè)定按照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測(cè)定》[19]中的方法進(jìn)行。根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（pH 5.8～6.2為新鮮肉，pH 6.3～6.6為次鮮肉，pH值大于6.7為變質(zhì)肉）對(duì)肉質(zhì)進(jìn)行判斷。

紅度利用WSC-S全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì)進(jìn)行測(cè)定。在空白對(duì)照組及各處理組肉樣上隨機(jī)取點(diǎn)測(cè)定，并計(jì)算平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，利用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Duncan法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），使用SigmaPlot 10.0進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷卻豬肉在貯藏過程中菌落總數(shù)的變化

圖1 冷卻豬肉在貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Fig. 1 Changes in total bacterial counts of chilled pork during storage

從圖1可知，山梨酸納米微粒組和空白納米微粒組樣品的菌落總數(shù)在貯藏初期呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，之后隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加，說明山梨酸納米微粒和空白納米微粒涂膜處理能夠降低冷卻豬肉初始菌落總數(shù)?？瞻讓?duì)照組和山梨酸鉀組的菌落總數(shù)呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。在整個(gè)貯藏期間，空白對(duì)照組的菌落總數(shù)顯著高于其余各處理組（P＜0.05），在第7天菌落總數(shù)為6.46（lg（CFU/g）），超過腐敗水平6.0（lg（CFU/g））[15]；各處理組在第10天菌落總數(shù)均低于6.0（lg（CFU/g））；其中山梨酸納米微粒處理組的菌落總數(shù)在貯藏12 d后超過腐敗水平6.0（lg（CFU/g）），與空白對(duì)照組相比貨架期延長(zhǎng)了5 d。在貯藏期內(nèi)，山梨酸納米微粒組的菌落總數(shù)顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05）；貯藏時(shí)間超過7 d時(shí)，山梨酸納米微粒組的菌落總數(shù)顯著低于其他處理組（P＜0.05），表明山梨酸納米微?？梢杂行б种评鋮s豬肉中微生物的增殖，在貯藏中后期山梨酸納米微粒發(fā)揮了緩釋性能。

2.2 冷卻豬肉在貯藏過程中霉菌和酵母總數(shù)的變化

本研究選擇第0、5、10、15、20天進(jìn)行霉菌和酵母總數(shù)的測(cè)定，具體結(jié)果如圖2所示。各處理組的霉菌和酵母總數(shù)在貯藏初期呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，之后隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加，表明各處理組保鮮劑具有降低霉菌和酵母初始菌落數(shù)的作用?？瞻讓?duì)照組的霉菌和酵母總數(shù)在貯藏期間持續(xù)上升，顯著高于其余處理組（P＜0.05）。山梨酸納米微粒組的霉菌和酵母總數(shù)顯著低于空白處理組與空白納米微粒組（P＜0.05），表明以納米粒形式存在的山梨酸可有效抑制霉菌和酵母的生長(zhǎng)；但與山梨酸鉀組差異不顯著（P＞0.05），表明山梨酸及其鹽類均能有效抑制霉菌和酵母的生長(zhǎng)[12]。

圖2 冷卻豬肉在貯藏過程中霉菌和酵母總數(shù)的變化Fig. 2 Changes in the total number of molds and yeasts in chilled pork during storage

2.3 冷卻豬肉在貯藏過程中TVB-N含量的變化

圖3 冷卻豬肉貯藏過程中TVB-N含量變化Fig. 3 Changes in TVB-N content of chilled pork during storage

TVB-N是肉品被侵染或肉本身含有的微生物引起蛋白質(zhì)脫氨、脫羧等作用所產(chǎn)生的堿性物質(zhì)，是評(píng)價(jià)肉類產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)。如圖3所示，空白對(duì)照組及各處理組TVB-N含量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)均呈上升趨勢(shì)?？瞻讓?duì)照組TVB-N含量在第7天已達(dá)到16.80 mg/100 g，超過GB/T 9959.2—2008限定值15.00 mg/100 g[15]，表明冷卻豬肉已發(fā)生腐敗變質(zhì)。通過空白納米微粒涂膜處理的冷卻豬肉的TVB-N含量在第10天達(dá)到15.73 mg/100 g。而由山梨酸納米微粒涂膜處理的冷卻肉保鮮效果最好，第13天超過限定值，與空白對(duì)照組相比貨架期延長(zhǎng)了6 d，TVB-N含量較其他處理組上升緩慢。表明山梨酸納米微粒作為冷卻肉涂膜保鮮劑能有效抑制微生物的作用，減緩蛋白質(zhì)分解。

2.4 冷卻豬肉在貯藏過程中TBARS值的變化

TBARS值是反映脂肪氧化后期終產(chǎn)物含量的一個(gè)指標(biāo)，通過測(cè)定氧化終產(chǎn)物丙二醛的含量評(píng)價(jià)肉品脂肪氧化程度[20]。由圖4所示，在冷卻豬肉貯藏期間，空白對(duì)照及各處理組樣品均發(fā)生脂肪氧化，TBARS值整體呈上升趨勢(shì)。其中山梨酸納米微粒組冷卻豬肉的TBARS值在貯藏過程中出現(xiàn)下降，可能是由于樣品中的丙二醛作為氧化的中間產(chǎn)物被氧化為有機(jī)酸，使丙二醛無法繼續(xù)與TBARS反應(yīng)導(dǎo)致[21]。空白對(duì)照組的TBARS值上升最快，其在貯藏過程中均顯著高于其他處理組（P＜0.05），表明空白對(duì)照組冷卻肉樣品脂肪氧化程度顯著高于其他處理組（P＜0.05）。山梨酸納米微粒組TBARS值相比于其他處理組較小并且上升較緩慢，貯藏15 d后達(dá)到0.73 mg/kg，顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明山梨酸納米微粒具有抑制脂肪氧化的作用。

圖4 冷卻豬肉貯藏過程中TBARS值的變化Fig. 4 Changes in TBARS value of chilled pork during storage

2.5 冷卻豬肉在貯藏過程中紅度的變化

圖5 冷卻豬肉貯藏過程中a值的變化Fig. 5 Changes in a value of chilled pork during storage

肉樣紅度用a值表示。a值為正時(shí)表示偏紅，a值越大肉色越紅，說明肉類被氧化的程度越小。如圖5所示，各實(shí)驗(yàn)組冷卻豬肉樣品的a值在整個(gè)貯藏期間總體呈下降趨勢(shì)。與空白對(duì)照組相比，貯藏7 d后，各處理組的a值顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明各處理組保鮮劑對(duì)紅度都具有保護(hù)性。山梨酸納米微粒對(duì)紅度有良好的保護(hù)效果，在貯藏7 d后，其a值顯著高于空白納米微粒組及山梨酸鉀組（P＜0.05），表明山梨酸納米微粒具有良好的抗氧化性能。

2.6 冷卻豬肉在貯藏過程中pH值的變化

如圖6所示，各處理組及空白對(duì)照組的pH值在整個(gè)貯藏過程中呈上升趨勢(shì)，這是肉類中的蛋白質(zhì)在微生物分泌的酶的作用下發(fā)生脫羧、脫氨反應(yīng)而生成堿性含氮物質(zhì)引起的[22]?？瞻讓?duì)照組pH值上升較快，在第10天達(dá)到6.6，豬肉表面發(fā)黏，出現(xiàn)腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。與空白對(duì)照組相比，各處理組樣品pH值上升緩慢。山梨酸鉀組的pH值始終高于其他處理組，這可能是呈堿性的山梨酸鉀溶液處理樣品后導(dǎo)致pH值上升。而山梨酸納米微粒組的pH值在整個(gè)貯藏期內(nèi)均低于6.8，與空白對(duì)照組相比貨架期延長(zhǎng)了5 d，顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明山梨酸納米微粒作為冷卻肉保鮮劑可以對(duì)微生物繁殖起到有效抑制作用，延緩pH值上升。

圖6 冷卻豬肉貯藏過程中pH值的變化Fig. 6 Changes in pH of chilled pork during storage

3 討 論

殼聚糖具有良好的成膜性，其作為天然防腐劑應(yīng)用于肉品保鮮中已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[23-25]。殼聚糖對(duì)一系列食源性微生物具有體外抗菌活性[26]，在肉制品貯藏期間能夠有效抑制微生物的生長(zhǎng)[26-27]。殼聚糖的抗氧化性能使其在肉制品貯藏期間能夠有效延緩脂肪氧化[26-28]。山梨酸對(duì)霉菌、酵母具有良好的抑制作用[29]。通過殼聚糖和TPP的陰陽(yáng)離子靜電作用交聯(lián)包埋山梨酸制備的山梨酸納米微粒，具有抑菌、抗氧化性能，以及納米微粒的緩釋作用[13]，可以獲得更好的保鮮效果。

微生物是導(dǎo)致冷卻肉在貯藏過程中腐敗的主要原因，肉品表面營(yíng)養(yǎng)豐富、水分充足，適宜微生物生長(zhǎng)繁殖[30]。肉品中含有的大量易被氧化的不飽和脂類化合物也會(huì)導(dǎo)致冷卻肉在貯藏過程中變質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)山梨酸納米微?？梢詼p緩TBARS值的上升，山梨酸鈉納米微粒組的TBARS值顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明山梨酸納米微粒能夠有效抑制脂肪氧化；山梨酸鈉納米微粒組a值顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明山梨酸納米微粒對(duì)肉樣紅度具有保護(hù)作用。冷卻豬肉經(jīng)優(yōu)化工藝制備的山梨酸納米微粒涂膜處理后，其菌落總數(shù)、霉菌和酵母總數(shù)、pH值顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），TVB-N含量在貯藏后期顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明山梨酸納米微粒對(duì)微生物生長(zhǎng)起到有效的抑制作用。綜合上述指標(biāo)測(cè)定結(jié)果可知，經(jīng)過山

梨酸納米微粒涂膜處理，冷卻豬肉的貨架期延長(zhǎng)了5 d，達(dá)到了保持肉樣新鮮度、延長(zhǎng)貨架期的目的。

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