汪朦 ，董玉梅 ，汪海燕 ，洪玉 ，桂飛 ，宋曉明 ，孫筱品 ，楊怡 ，譚曉華 ，諶容 ，宋楊 ，黃瑾 ，楊磊

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002；2杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310036）

隨著社會、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，噪聲暴露的人群范圍不斷擴(kuò)大。噪聲主要影響聽覺器官，表現(xiàn)為聽覺敏感度下降、閾值升高等，嚴(yán)重時甚至可造成耳聾[1]。目前在噪音性耳聾的研究中，建立合適的噪音性耳聾動物模型是實驗研究的先決條件[2-7]。CBA近交系小鼠個體差異性小，與遠(yuǎn)親雜交種類動物比較，具有暴露變異性低、聽覺敏感喪失程度小和組織病理學(xué)改變少[8]等特點，是一種很好的研究人類年齡相關(guān)性聽力損失的動物模型[9]。

聽性腦干反應(yīng)(ABR)是檢測聽功能的重要指標(biāo)，可以反映聽覺傳導(dǎo)通路是否發(fā)生病變，并明確病變的部位，已廣泛應(yīng)用于耳聾動物模型的聽力評估。ABR反應(yīng)常用指標(biāo)主要包括潛伏期、波間期及幅值等，但目前ABR反應(yīng)閾波形的潛伏期及幅值的分析方法報道不一，本研究擬選取4-6周齡聽力正常的成年CBA小鼠，以短聲（click聲）為刺激聲進(jìn)行ABR檢測，分析比較ABR不同波形Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ波的出現(xiàn)頻次、潛伏期與閾值，找出最適合用于檢測CBA小鼠閾值的ABR波，為今后以CBA小鼠為實驗動物的聽覺研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取聽力正常SPF級的CBA小鼠50只，來源于杭州師范大學(xué)實驗動物中心 [SCXK(滬)2012-0002]，雌雄不限，年齡4-6周，體重17.2～24.9g。

1.2 ABR檢測

5%水合氯醛0.10mL/10 g腹腔注射麻醉動物，加熱墊維持正常體溫。

等待動物完全麻醉后，記錄電極置于顱頂硬膜下（注意不要插入顱內(nèi)），參考電極置于同側(cè)耳廓，接地電極置于對側(cè)耳廓，電極間電阻值應(yīng)小于3 KΩ。開放聲場中揚(yáng)聲器（TDT MF1－1250）置于距外耳道口8～10 cm的地方。

采用美國TDT公司TDTⅢ設(shè)備和SigGen RP系統(tǒng)軟件給聲并采集信號。刺激聲為click聲，強(qiáng)度10～90 dB SPL，衰減間隔 5 dB，濾波帶寬 100～3000 Hz，信號放大50 000倍，觀察窗為 10ms，疊加1024次。觀察高（90 dB SPL）、中（60 dB SPL）、低（30 dB SPL）刺激強(qiáng)度下ABR各波的出現(xiàn)率，并依據(jù)出現(xiàn)率最高的波判斷閾值，測量該波的潛伏期和幅值。

1.3 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析所使用軟件為SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±S）對計量資料進(jìn)行描述，正態(tài)性分布和方差齊檢驗后采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析、單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，若不滿足正態(tài)性及方差齊性條件則采用秩和檢驗。計數(shù)資料采用卡方檢驗，p<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高、中、低聲強(qiáng)刺激下各波的出現(xiàn)率

高、中、低聲強(qiáng)刺激下各波的出現(xiàn)率結(jié)果見表1。

表1 不同刺激聲強(qiáng)下CBA小鼠ABR各波的出現(xiàn)率%/(n=100耳)Tab.1 The incidence of ABR waves in different CBA mice with different stimuli

從表1可知，在高、中強(qiáng)度的短聲刺激下，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ波均可出現(xiàn)，Ⅴ波出現(xiàn)率較低。但在低強(qiáng)度刺激下，各波出現(xiàn)率均有所降低，波Ⅱ出現(xiàn)率最高。

2.2 ABR反應(yīng)閾值的確定

不同頻率聲音刺激后顯示ABR波形Ⅱ最穩(wěn)定，出現(xiàn)率最高，故以波Ⅱ剛剛出現(xiàn)時的刺激聲強(qiáng)為閾值[10]。高刺激聲強(qiáng)時波Ⅱ波形較容易判斷，如果在上一刺激聲強(qiáng)下波Ⅱ的潛伏期稍靠后的位置有切跡，而下一個刺激聲強(qiáng)度無切跡則可以判定該刺激聲強(qiáng)度為閾值。由此測得，本組正常CBA小鼠的ABR反應(yīng)閾值為 30±5dB SPL（圖 1）。

2.3 ABR波形Ⅱ幅值與潛伏期的確定

幅值的判斷有兩種方法[11]：一種是量取波峰與基線之間的差值 ，另外一種是波峰與波谷的差值。同樣，潛伏期的量取也有兩種方法：一種方法是聲音刺激開始到波Ⅱ剛要上升階段的時間間隔，第二種是聲音刺激開始到波Ⅱ峰值的時間差。為消除基線不穩(wěn)帶來的影響，均采用后一種方法測量。

圖1 CBA小鼠ABR波Ⅱ圖Fig.1 CBA mice ABR wave II

2.4 波Ⅱ幅值與潛伏期的變化情況

波Ⅱ幅值與潛伏期的變化情況結(jié)果見表2。

表2 不同強(qiáng)度刺激聲下波Ⅱ峰-谷幅值與潛伏期±STab.2 Different intensity stimulation sound，waveⅡpeak valley amplitude and latent period

表2 不同強(qiáng)度刺激聲下波Ⅱ峰-谷幅值與潛伏期±STab.2 Different intensity stimulation sound，waveⅡpeak valley amplitude and latent period

刺激聲強(qiáng)度/dB SPL 波Ⅱ幅值/μV 波Ⅱ潛伏期/ms 90 2.15±1.46 2.08±0.22 80 2.63±1.41 2.11±0.18 70 2.86±1.20 2.12±0.17 60 2.93±1.11 2.15±0.15 50 2.76±1.13 2.18±0.13 40 2.12±0.91 2.25±0.15 30 1.62±0.79 2.35±0.16

從表2可見刺激聲強(qiáng)度從低到高變化時，在高刺激聲強(qiáng)下（90 dB SPL）潛伏期較短，均值為 2.08 ms，隨著刺激聲強(qiáng)度降低，潛伏期延長，在閾值附近（30 dB SPL）潛伏期為 2.35ms，與 90dB SPL強(qiáng)度下的潛伏期相差約0.27 ms。幅值從高刺激聲強(qiáng)度下（90 dB SPL）的 2.15 μV 下降到閾值附近（30 dB SPL）的1.62 μV。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

ABR檢測是反映聽功能的一項客觀指標(biāo)。ABR測試為非侵入性測聽手段，對內(nèi)耳不產(chǎn)生影響，能客觀反應(yīng)聽力閾值的變化。不同的小鼠品系，ABR檢測波形不一致。既往研究聽功能的動物品系有豚鼠、C57BL小鼠等，它們的ABR波形報道不同。評價聽功能閾值的豚鼠是以 ABRⅢ波作為評判標(biāo)準(zhǔn)[12-13]，C57BL小鼠[11-14]聽力閾值是以ABRⅡ波作為評判標(biāo)準(zhǔn)，而關(guān)于CBA小鼠目前沒有非常明確的相關(guān)研究結(jié)果，所以我們探討了CBA小鼠聽力閾值的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 CBA小鼠ABR波Ⅱ閾值判斷、幅值和潛伏期的測量

測量聲波的潛伏期一般是從電脈沖沖擊電聲換能器時算起，至電位的起始點為真正的潛伏期，由于電位的起始點很難確定，所以通常以各波的峰尖為電位的“起始”點[12]，以此方法來測量的潛伏期為峰潛伏期，即選擇從刺激開始到峰值的時間差作為潛伏期。

本實驗發(fā)現(xiàn)給予不同頻率刺激，ABR波波Ⅱ的引出率最高并且最穩(wěn)定，相比較其他波而言最適合用來判斷反應(yīng)閾值。并且我們實驗發(fā)現(xiàn)從90 dB SPL逐漸降低到30 dB SPL時，波Ⅱ的潛伏期在2.08～2.35ms之間，幅值在 2.15～1.62 μV之間，該結(jié)論與方華敏[14]李登科[11]等人做出的 C57品系小鼠結(jié)果一致。

3.2 影響ABR波形的因素

ABR檢測記錄到的電位為場電位，受物理因素（如刺激聲種類、強(qiáng)度、極性、濾波等）、環(huán)境因素（如光、電、磁、溫度等）和受試者的生理因素的影響[15-17]。因此，在ABR檢測實驗中要嚴(yán)格規(guī)范實驗環(huán)境、儀器設(shè)備以及控制小鼠年齡等條件，同時，檢測過程中要注意維持動物體溫，防止由于肌肉顫抖引發(fā)肌電干擾。這些ABR波形因素對CBA小鼠的影響還需要我們進(jìn)一步研究。

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