陸光華，覃冬葒，宗永臣

(1. 河海大學環(huán)境學院，江蘇 南京 210098；2. 西藏農(nóng)牧學院水利土木工程學院，西藏 林芝 860000)

硫丹(endosulfan)是一種合成有機氯殺蟲劑，自20世紀50年代開始使用，主要用于控制各種作物(棉花、水稻、高粱、大豆、煙草、茶葉、咖啡等)害蟲。硫丹的化學名稱為1,2,3,4,7,7-六氯雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯-5,6-雙羥甲基亞硫酸酯，包括α-硫丹和β-硫丹2 種異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)及主要理化性質(zhì)見表1。技術(shù)硫丹(CAS：115-29-7)為α-硫丹和β-硫丹的混合物，二者的比例約為7∶3。硫丹的長期生產(chǎn)和使用導致硫丹在環(huán)境中無處不在。農(nóng)業(yè)灌溉和降雨導致的土壤徑流和滲透是硫丹進入水環(huán)境的主要途徑，在稻田附近的水體中硫丹質(zhì)量濃度高達13.5 μg/L，而在山區(qū)河流的硫丹質(zhì)量濃度也達到0.7 μg/L[1]。因具有較強親脂性，進入水環(huán)境的硫丹可以累積在水生生物體內(nèi)，在魚組織中的硫丹殘留水平可達到10～400 ng/g[2]，生物富集因子在2 400～11 000[3]。

硫丹具有環(huán)境持久性、生物蓄積性和遠距離環(huán)境遷移能力，其對生態(tài)系統(tǒng)的風險和對人類健康的影響日益引起關(guān)注。2011年硫丹及其相關(guān)異構(gòu)體被斯德哥爾摩公約列入持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)附件A(消除類)。我國自2014年3月26日起，除特定豁免用于防治棉花棉鈴蟲、煙草煙青蟲的生產(chǎn)和使用外，禁止硫丹的生產(chǎn)、流通、使用和進出口。根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》《農(nóng)藥管理條例》有關(guān)規(guī)定以及《關(guān)于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》的履約要求，農(nóng)業(yè)部擬自2018年7月1日起，撤銷所有硫丹產(chǎn)品的農(nóng)藥登記證；自2019年3月27日起，禁止所有硫丹產(chǎn)品在農(nóng)業(yè)上使用。目前世界上已經(jīng)有60多個國家禁止使用硫丹。

表1 2種硫丹異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)式及理化性質(zhì)

注：Kow為辛醇-水分配系數(shù)；Koc為標化分配系數(shù)。

很多研究表明，硫丹對水生生物、陸生生物和人類具有高毒性[4-6]。作為一種持久性有機污染物，即使天然水體中硫丹的殘留濃度不高，但是長期暴露可能產(chǎn)生生物累積和放大效應[7]，不僅影響魚類正常的生長繁殖，也給食品安全帶來潛在威脅[8]。日本規(guī)定水產(chǎn)品中硫丹最大殘留量為4 μg/kg，而我國尚無相關(guān)限量標準[9]。

1 硫丹對魚類的急性致死毒性

隨著硫丹在全世界范圍的地表水中頻繁檢出，其對非靶生物的毒性效應引起了廣泛關(guān)注。硫丹通常對魚類的毒性大于對水生無脊椎動物的毒性[13]，它可以影響魚類中樞神經(jīng)、免疫和生殖系統(tǒng)，并可能導致魚類行為異常，嚴重情況下可導致魚類死亡[14]。魚類致死毒性通常以96 h半致死濃度(ρLC50)為測試終點，表2總結(jié)了硫丹對不同魚類的96 hρLC50數(shù)據(jù)。大多數(shù)研究針對技術(shù)硫丹進行毒性測試，受試魚類個體通常較小，而且多數(shù)為幼魚。從表2可見，硫丹對魚類的急性毒性變化很大，96 hρLC50的范圍為0.1～70 μg/L。毒性數(shù)據(jù)變化的主要原因是不同魚種對硫丹的敏感性(或耐受性)不同，而魚的個體大小、不同發(fā)育階段、性別也對毒性測試結(jié)果有影響。一般認為，生命早期階段的魚比青年或成年的魚更敏感[15]，而性別差異的主要原因是由于雌魚脂質(zhì)含量高于雄魚[16]。魚體脂含量高有利于保護機體免受親脂性化學品的毒性影響，因為能夠達到靶器官的化學品相對更少，因此，雌魚對親脂性毒物的耐受性更強[16-17]。此外，對同一測試魚種，不同的暴露方式(流動/靜態(tài)/半靜態(tài))也影響毒性結(jié)果。如，Sunderam等[18]發(fā)現(xiàn)硫丹對彩虹魚(Pseudomugilfurcatus)的96hρLC50值在流動暴露條件下為0.5 μg/L，而在靜態(tài)條件下為11.4 μg/L。硫丹在流動暴露條件下對翠鱧(Channapunctatus)的96hρLC50值為7.75 μg/L[19]，而在靜態(tài)條件下為5.58 μg/L[20]，由于這兩個數(shù)據(jù)來自不同實驗室，因此，可能存在其他方面的影響因素。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，水溫和堿度對硫丹暴露下虹鱒魚的存活率有顯著影響[4]。

根據(jù)我國GB/T 31270—2014《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》的毒性劃分標準，當農(nóng)藥對魚類的96 hρLC50值小于0.1 mg/L時，說明該農(nóng)藥對魚類有劇毒。從表2可見，硫丹對所有受試魚類的毒性都屬于劇毒。

表2 硫丹對不同魚類的96 h半致死濃度(ρLC50)數(shù)據(jù)

2 硫丹對魚類的細胞毒性和組織病理學

細胞凋亡是維持健康細胞群體的重要細胞機制，也是胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)活動的重要組成部分。逃避凋亡的受損細胞一般都會衰老，很多環(huán)境污染物都會誘發(fā)水生生物細胞衰老。硫丹對魚類的細胞毒性依賴于細胞類型、暴露濃度、暴露方式(活體/離體)和暴露時間。

肝臟是魚類重要的代謝和解毒器官，因此常用于環(huán)境污染物的細胞毒性測試。通過含1 μg/g和0.5 μg/g的硫丹喂食暴露21d，硫丹誘導了尼羅羅非魚肝細胞破壞、血管內(nèi)皮細胞破裂，并增加了黑色素吞噬細胞的聚集；而低至0.1 μg/g和0.001 μg/g的劑量暴露35d，增加了肝細胞空泡化和嗜酸性粒細胞聚集[35]。頭腎是硫丹代謝過程中重要的魚類免疫器官。將鯰魚(Clariasgariepinus)暴露于2.884 μg/L的硫丹30d，隨后在不含硫丹的水中恢復30d，發(fā)現(xiàn)頭腎體細胞指數(shù)降低，并導致白細胞死亡[36]。此外，硫丹活體暴露可降低魚類紅細胞數(shù)量和血紅蛋白濃度，使魚處在貧血狀態(tài)，同時，出現(xiàn)紅細胞腫脹，影響其攜氧能力[22-23]。

魚類在細胞水平上的毒性響應往往伴隨著組織水平上的病理學損傷，包括鰓上皮細胞增生和鰓損傷、肝水腫變性和局灶性壞死、睪丸損傷等。這些重要器官中度的病理反應在魚類繁殖期和長時間暴露期可能變得至關(guān)重要[22]。4 μg/L的硫丹喂食暴露35 d導致大西洋鮭魚(Salmosalar)肝臟和腸道的組織學改變，后腸病理學特征是絨毛的空泡化和融合，而在最嚴重的情況下，絨毛尖端上皮完整性喪失；對肝臟的主要影響是糖原消耗和脂質(zhì)沉積[37]。這些變化屬于典型的普遍應激反應。此外，0.16 μg/L或0.48 μg/L的硫丹對成年斑馬魚肝組織損傷表現(xiàn)為肝細胞肝肥大、壞死和完整性改變[38]。0.76 μg/L的硫丹暴露下四眼魚肝臟中出現(xiàn)了可逆的組織學改變(如水腫變性和竇狀膨脹)，而在1.26 μg/L和2.1 μg/L濃度下肝臟產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的變化，如肝臟壞死[16]。

鰓與水環(huán)境直接接觸，因此對污染物非常敏感。研究發(fā)現(xiàn)，18.5 μg/L的硫丹暴露96 h引起遮目魚(Chanoschanos)鰓上繼發(fā)性片段的卷曲、原發(fā)性上皮的增厚、上皮增生、次級層融合等；較高濃度(21.5 μg/L)下肝細胞出現(xiàn)嚴重壞死[27]?？梢姡~肝臟、腸、鰓等都是硫丹毒性作用的靶器官，而且組織病理學損傷程度存在明顯的濃度依賴性。

3 硫丹對魚類生理生化指標的影響

亞致死濃度的硫丹除了在個體、組織和細胞水平上對魚類產(chǎn)生毒性效應以外，在分子水平上也會產(chǎn)生不利影響，包括代謝轉(zhuǎn)化、抗氧化防御、激素調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞等生物過程的脅迫響應。表3總結(jié)了硫丹對不同魚類生理生化指標的影響。

表3 硫丹暴露下魚類生理生化指標的響應

有研究表明，硫丹對鯽魚、南美慈鯛魚、四眼魚、遮目魚、羅非魚等抗氧化防御系統(tǒng)都產(chǎn)生了干擾效應。抗氧化防御系統(tǒng)常用的生物標志物包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性和還原型谷胱甘肽(GSH)、硫代巴比妥酸反應物質(zhì)(TBARS)、脂質(zhì)過氧化(LPO)含量等。SOD和CAT是敏感的抗氧化酶，不同魚類對硫丹暴露的脅迫響應不一致，多數(shù)為誘導效應，也有抑制效應，表現(xiàn)出不同的響應機制。硫丹通過釋放氧自由基誘導組織的氧化損傷[46]，SOD和CAT的活性升高有助于清除氧自由基，保護魚體組織免受氧化損傷。但是，強氧化劑能夠克服生物的抗氧化防御系統(tǒng)，產(chǎn)生過量的H2O2損傷酶的活性位點，從而抑制SOD的催化活性[47-48]。從表3可見，硫丹增加了不同魚類的TBARS和LPO水平，這是由于生成的活性氧(ROS)攻擊細胞膜產(chǎn)生了抗氧化酶損傷，繼而對細胞完整性和細胞功能產(chǎn)生影響。

細胞色素P450 1A(CYP1A)表達及其相關(guān)乙氧異吩惡唑酮—O—脫乙基酶(EROD)活性通常用來反映有機污染物Ⅰ相生物轉(zhuǎn)化途徑，谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶(GST)活性反映Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化和解毒途徑。表3的結(jié)果顯示，通過不同方式暴露的硫丹誘導了不同魚類的CYP1A表達及EROD和GST活性。來自不同實驗室的研究得到了一致的結(jié)果，表明進入魚體內(nèi)的硫丹可以進行代謝轉(zhuǎn)化和解毒。不同濃度的硫丹暴露增加了遮目魚肝、鰓和腦的乳酸脫氫酶(LDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)的活性，表明魚體為維持自身能量需求應激誘導了無氧代謝[27]。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)是相關(guān)的應激指標，通常用于診斷魚類疾病和檢測由環(huán)境污染引起的組織損傷，ALT和AST活性增加表明通過魚糖異生反應促進天冬氨酸和丙氨酸產(chǎn)轉(zhuǎn)化成葡萄糖以承受污染物的脅迫作用[49]。此外，研究發(fā)現(xiàn)雄性和雌性斑馬魚之間存在基于性別的硫丹解毒差異[39]。

乙酰膽堿酯酶(AChE)是生物神經(jīng)傳導中的一種關(guān)鍵酶，對魚類正常行為和肌肉功能至關(guān)重要。水體暴露的硫丹顯著降低了不同魚類AChE的活性，最大抑制率達到79%[26]。AChE的抑制率達到40%就會導致魚的行為異常，包括游泳活力降低、探索能力下降，影響逃避和捕食行為，并且可能破壞它們的生態(tài)和種間相互作用[40-42,50]。

現(xiàn)有研究表明，μg/L級的硫丹通過急性、亞急性或者亞慢性暴露，都對魚類正常的生理功能產(chǎn)生了干擾效應。通過實驗室暴露研究，篩選出敏感的魚類分子生物學指標，對自然水體中硫丹的生態(tài)風險評估具有重要意義。

4 硫丹對魚類的遺傳、繁殖和發(fā)育毒性

體內(nèi)和體外實驗都已證明硫丹具有致突變和致畸效應，以前的研究主要以哺乳動物為模式生物，對水生生物的研究相對較少。DNA損傷、微核形成和染色體畸變在評估農(nóng)藥誘導的魚類遺傳毒性方面發(fā)揮了重要作用。

不同質(zhì)量濃度(1.25、2.50、3.75、5.00、6.25 μg/L)硫丹暴露4 d導致葛氏鱸塘鱧外周血紅細胞核異常率升高，并呈現(xiàn)較明顯的劑量—效應關(guān)系，表明硫丹對葛氏鱸塘鱧具有潛在的遺傳毒性[51]。Pandey等[19]采用彗星試驗方法研究了硫丹對淡水硬骨魚翠鱧的遺傳毒性，4.0 μg/L的硫丹暴露4 d后，在魚鰓和腎組織細胞觀察到了明顯的DNA損傷，而且鰓細胞對硫丹暴露比腎細胞更敏感。

即使在環(huán)境相關(guān)濃度暴露下，硫丹對一些敏感魚類也會產(chǎn)生遺傳毒性。硫丹在0.5 μg/L 或者1.0 μg/L質(zhì)量濃度下暴露4 d對金頭鯛(SparusaurataL.)產(chǎn)生了明顯的染色體損傷[52]。0.02 μg/L的硫丹暴露24 h增加了南美慈鯛紅細胞的核異常率，5 μg/L增加了微核形成率[49]。魚的微核形成率、核異常率和染色體畸變率的增加常伴隨著氧化脅迫效應的增強和抗氧化酶的干擾，因此，Dar等[21]推測硫丹的遺傳毒性機制可能為氧化應激路徑。

考慮到很多地表水環(huán)境中硫丹的賦存濃度高達μg/L級，長期暴露可能會通過影響個體生長發(fā)育、流動性、覓食成功率、繁殖能力，進而對魚類種群健康產(chǎn)生嚴重影響。

0.5 μg/L和1 μg/L的硫丹暴露30 d，顯著干擾了雄性華生小鯉(Cyprinionwatsoni)的睪酮水平，并對生殖健康產(chǎn)生了負面影響[53]。將日本青鳉(Oryziaslatipes)的受精卵暴露于0.01 μg/L、0.10 μg/L和1 μg/L的硫丹24 h，導致孵化時間更長，而且孵出的魚苗個體較小，活動性降低；當這些魚達到性成熟時，產(chǎn)卵量減少，孵化時間延長[54]?？梢?，短期暴露于環(huán)境相關(guān)濃度的殺蟲劑可能會對魚類的發(fā)育和繁殖產(chǎn)生長期影響。然而，Beyger等[55]將孵化78 d后的旗魚(Jordanellafloridae)脈沖暴露于硫丹4 h，監(jiān)測魚的生長和繁殖，結(jié)果表明，濃度高達10.8 μg/L的硫丹都沒有顯著影響旗魚的生長和繁殖能力。這一結(jié)果可能與暴露方式有關(guān)，該研究采用高濃度硫丹急性脈沖暴露4 h，然后將魚轉(zhuǎn)入清水，吸收進入魚體中的硫丹可能逐漸被代謝、清除，從而恢復了正常的生理功能。

將成年斑馬魚暴露于硫丹28 d，發(fā)現(xiàn)0.16 μg/L暴露組斑馬魚生產(chǎn)的幼魚心跳頻率明顯低于對照組，并出現(xiàn)嚴重的脊柱前凸、腹水等形態(tài)學變化(圖1)[38]。可見，在亞致死濃度下，成年斑馬魚即使能夠成功繁殖，但是后代發(fā)育異?？赡苡绊懰鼈兊拈L期存活。因此，在硫丹的環(huán)境風險評估中應考慮其對魚類的代際危害。

硫丹對生殖系統(tǒng)的影響主要是通過激素作用介導，而不是直接毒性作用[56]。性激素在低等脊椎動物(包括魚類)的性別分化中起重要作用。因此，由內(nèi)分泌干擾物引起的性激素水平略有變化，對水生脊椎動物的性腺發(fā)育就會產(chǎn)生明顯的影響。硫丹通過與雌二醇競爭與雌激素受體(ER)結(jié)合，從而誘導雌激素響應[57]。但是硫丹與ER結(jié)合的親和力低，其雌激素活性比雌二醇低105～106倍[58]?；铙w試驗表明，硫丹通過觸發(fā)雌魚早熟發(fā)育，加快其卵巢生長[59-60]。硫丹還是一種弱的抗雄激素，可以通過調(diào)節(jié)睪丸相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和類固醇生成酶的轉(zhuǎn)錄表達，使雄魚睪丸分化或發(fā)育受損[56,61]。這些研究證實了硫丹對魚生殖軸的內(nèi)分泌干擾作用，而性腺的組織病理學變化、卵黃蛋白原水平變化和兩性異形可對魚類繁殖產(chǎn)生嚴重影響[62]。

(a) 對照組與0.16 μg/L暴露組

(b) 0.48 μg/L暴露組

注：(a)圖箭頭指向為對照組，下方為0.16 μg/L暴露組，顯示了嚴重的脊柱前凸；(b) 圖為0.48 μg/L暴露組，顯示了嚴重腹水。

圖1斑馬魚親魚暴露硫丹28d導致仔魚發(fā)育異常[38]

5 結(jié)論與展望

硫丹作為新列入POPs清單的有機氯殺蟲劑，目前仍有很多國家在生產(chǎn)和使用。硫丹具有長距離遷移能力和環(huán)境持久性，今后相當長的時間內(nèi)都是重要的環(huán)境污染物，其在一些地區(qū)的環(huán)境殘留可能繼續(xù)升高。目前，發(fā)達國家對水產(chǎn)品農(nóng)藥殘留的限量要求日益嚴格，這已對我國魚類產(chǎn)品出口產(chǎn)生了巨大影響，因此，我國亟須完善水產(chǎn)品藥物殘留限量標準體系，針對硫丹等新POPs制定嚴格的限量標準，同時在漁業(yè)水質(zhì)標準中增設(shè)相應指標。此外，還需要在源頭上加強對硫丹使用的管控。

目前，有關(guān)硫丹對魚類的毒理學研究取得了一些進展，尤其在急性毒性方面，積累了豐富的數(shù)據(jù)?，F(xiàn)有研究成果也證實了亞致死濃度下硫丹對魚類具有細胞毒性、遺傳毒性和組織損傷，長期暴露對親代繁殖能力和子代生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響。鑒于在真實水環(huán)境中硫丹通常與其他殺蟲劑共存，因此，研究硫丹與其他污染物共暴露對魚類的聯(lián)合毒性，探明是否存在協(xié)同效應，將有助于客觀評價硫丹污染水體的生態(tài)風險。另外，在魚類毒性作用機制方面，目前提出了細胞和分子機制，包括線粒體功能障礙、誘導氧化應激、應激反應信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)節(jié)、增加細胞外信號調(diào)節(jié)激酶等，但是確定硫丹對魚類的毒性機制需要更多實驗證據(jù)。硫丹將長期在水環(huán)境中殘留，因此需要加強魚類全生命周期暴露、子代傳遞效應、多代繁殖影響等方面的研究，揭示水環(huán)境中硫丹持續(xù)暴露對魚類種群健康的影響。

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