鄭富春,祁曉倩

(陜西省安康市人民醫(yī)院：1.耳鼻咽喉科；2.檢驗(yàn)科 725000)

鼻咽癌是耳鼻咽喉科較為常見的癌癥之一，發(fā)病因素可能與當(dāng)?shù)貪駸岬沫h(huán)境氣候及飲食偏辛辣有關(guān)[1]。鼻咽癌病死率較高，目前臨床多采用放射治療，原發(fā)性鼻咽癌在提高患者生存率等方面取得了顯著成效，但手術(shù)時(shí)間較長(zhǎng)，預(yù)后不佳且易造成患者面容改變[2]。通過抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(IGFBP-rP1)的表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系CNE1細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力的影響，檢測(cè)CNE1細(xì)胞半衰期變化情況和相關(guān)蛋白變異后性質(zhì)的表達(dá)[3]?，F(xiàn)探討在此蛋白基礎(chǔ)上構(gòu)建2條特異性針對(duì)IGFBP-rP1基因的小干擾RNA(siRNA32、siRNA34)，并采用各種臨床檢測(cè)技術(shù)對(duì)IGFBP-rP1基因和CNE1細(xì)胞的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),分析抑制IGFBP-rP1基因的表達(dá)能有效治療鼻咽癌且術(shù)后患者不易發(fā)生并發(fā)癥。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1一般材料 本研究所用CNE1細(xì)胞購買自中南大學(xué)高等研究中心細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒購買自上海吉瑪公司。

1.2儀器與試劑 (1)材料：鼻咽癌細(xì)胞系CNE1細(xì)胞，空白載體，2條特異性針對(duì)IGFBP-rP1基因的小干擾RNA(siRNA32、siRNA34)，轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。(2)試劑：Trizol試劑，秋水仙素，龍膽紫溶液，無酶RNA沖洗液，SYBR Green 1染料，上游引物，下游引物，dNTP。(3)RT-PCR、Western blot檢測(cè)試劑：30 g丙烯酰胺和0.8 g N,N′-亞甲丙烯酰胺、4×Tris·Cl/SDS,pH 8.8、4×SDS電泳緩沖液，TEMED (N,N,N′，N′-四甲基乙二胺),10%過硫酸銨。(4)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑：MTT 0.5 g，100 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)或無酚紅培養(yǎng)基。(5)腫瘤細(xì)胞重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)試劑：無血清DMEM，1%胎牛血清DMEM,1640完全培養(yǎng)基(也可加到20%血清)，無菌PBS，胰酶，4%多聚甲醛固定液或甲醇，結(jié)晶紫染液[0.1%(g/mL)PBS結(jié)晶紫]。(6)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)：等滲鹽水,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)導(dǎo)板。(7)流式細(xì)胞儀技術(shù)實(shí)驗(yàn)試劑：秋水仙素。

1.3siRNA設(shè)計(jì)與構(gòu)建 將IGFBP-rP1基因的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)通過解螺旋酶進(jìn)行催化裂解打開成單鏈后，對(duì)其中之一的單鏈進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得RNA，將此RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到多條單鏈RNA，向這些多條RNA中加入rRNA進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后，再利用mRNA進(jìn)行核糖體加成，然后形成siRNA[4]。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將CNE1細(xì)胞置入瓊脂培養(yǎng)基中放入細(xì)胞保溫箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的細(xì)胞隨機(jī)分為4組即陰性對(duì)照組、空白組、siRNA32組(siRNA32轉(zhuǎn)染)、siRNA32組(siRNA34轉(zhuǎn)染)。其中空白組不做任何處理；陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染；siRNA32組與siRNA32組分別轉(zhuǎn)染siRNA32轉(zhuǎn)染和siRNA34轉(zhuǎn)染。分別采用RT-PCR、Western blot檢測(cè)各組IGFBP-rP1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，使用細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE1細(xì)胞的遷移能力，應(yīng)用腫瘤細(xì)胞重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE1細(xì)胞的侵襲能力、MTT法檢測(cè)CNE1細(xì)胞的增殖能力、流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。8～10周期后分別對(duì)4組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.5檢測(cè)方法

1.5.1RT-PCR檢測(cè)方法 4組細(xì)胞分別進(jìn)行RT-PCR法檢測(cè)，取凍存CNE1細(xì)胞，5 000 r/min離心40 min后放入無酶RNA，應(yīng)用無酶RNA對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行加速繁殖后，只去除較多的傳代培養(yǎng)的各組細(xì)胞進(jìn)行觀察。

1.5.2蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)方法 4組細(xì)胞分別進(jìn)行Western blot法檢測(cè)，將培養(yǎng)的CNE1細(xì)胞放在2塊干凈的玻璃平板之間離心后備用，配制好的甲基丙烯酸酯分離膠液體并脫氣，然后放入13%的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌，混勻。按所需分離的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的甲基丙烯百分比濃度，以上2種材料進(jìn)行充分混合后將分離的CNE1細(xì)胞與混合液一起37 ℃溫水中孵育40 min，充分清洗，再將硝酸纖維素膜與CNE1細(xì)胞混合顯色。

1.5.3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 4組細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，取凍存CNE1細(xì)胞，12 000 r/min離心30 min后應(yīng)用等滲鹽水制作等滲液細(xì)胞運(yùn)動(dòng)導(dǎo)板，CNE1細(xì)胞懸液滴在導(dǎo)板的同一高度，觀察各組細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)情況[5]。

1.5.4腫瘤細(xì)胞重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn) 4組細(xì)胞分別進(jìn)行腫瘤細(xì)胞重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)，取凍存CNE1細(xì)胞10 000 r/min離心40 min，應(yīng)用基質(zhì)膠鋪板制備CNE1細(xì)胞懸液，檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況[6]。

1.5.5MTT法 4組細(xì)胞分別進(jìn)行MTT法檢測(cè)，取凍存CNE1細(xì)胞15 000 r/min離心40 min，每0.2 mL Trizol試劑裂解樣本中加入0.15 mL氯仿進(jìn)行裂解操作，26 ℃水浴加熱采用無酶RNA沖洗液進(jìn)行洗滌，再次15 000 r/min離心10 min，獲得RNA，將此RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后培養(yǎng)，檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況[7]。

1.5.6流式細(xì)胞儀技術(shù) 4組細(xì)胞分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀技術(shù)實(shí)驗(yàn)，取凍存CNE1細(xì)胞5 000 r/min離心45 min，向各組細(xì)胞中加入秋水仙素溶液，使細(xì)胞增殖的速度減緩從而使細(xì)胞固定在特定的細(xì)胞周期上，檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表達(dá)水平結(jié)果比較 陰性對(duì)照組和空白組IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；siRNA32組和siRNA34組IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著低于陰性對(duì)照組和空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 各組IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表達(dá)水平結(jié)果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP<0.05

注：1表示空白組；2表示陰性對(duì)照組；3表示siRNA34組；4表示siRNA32組

圖1 Western blot法檢測(cè)各組IGFBP-rP1蛋白表達(dá)水平

2.2各組細(xì)胞CNE1細(xì)胞遷移能力結(jié)果比較 陰性對(duì)照組和空白組CNE1細(xì)胞遷移數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；siRNA32組和siRNA34組CNE1細(xì)胞遷移數(shù)目顯著低于陰性對(duì)照組和空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞CNE1細(xì)胞遷移能力結(jié)果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP<0.05

2.3各組細(xì)胞CNE1細(xì)胞侵襲能力結(jié)果比較 陰性對(duì)照組和空白組穿過PVP-F膜的CNE1細(xì)胞數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；siRNA32組和siRNA34組穿過PVP-F膜的CNE1細(xì)胞數(shù)目顯著低于陰性對(duì)照組和空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞CNE1細(xì)胞侵襲能力結(jié)果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP<0.05

2.4各組細(xì)胞CNE1細(xì)胞增殖能力結(jié)果比較 培養(yǎng)24、48 h后，陰性對(duì)照組和空白組CNE1細(xì)胞增殖OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；siRNA32組和siRNA34組CNE1細(xì)胞增殖OD值顯著低于陰性對(duì)照組和空白組(P<0.05)。見表4。

表4 各組細(xì)胞CNE1細(xì)胞增殖能力OD值結(jié)果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP<0.05

2.5各組細(xì)胞CNE1細(xì)胞增殖周期結(jié)果比較 培養(yǎng)48 h后，siRNA32組和siRNA34組G0/G1期、G2/M期細(xì)胞所占比例顯著高于陰性對(duì)照組和空白組(P<0.05)；siRNA32組和siRNA34組S期細(xì)胞所占比例顯著低于陰性對(duì)照組和空白組(P<0.05)。見表5。

表5 各組細(xì)胞CNE1細(xì)胞增殖周期結(jié)果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP<0.05

3 討 論

鼻咽癌病理病因目前認(rèn)為與3種因素有關(guān)，即遺傳因素、病毒因素(主要為EB病毒感染)、環(huán)境因素，臨床對(duì)鼻咽癌的治療方法很多，但治療效果都不確切，現(xiàn)抑制鼻咽癌相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)鼻咽癌進(jìn)行靶向治療[8]。

IGFBP-rP1是一種近年來被發(fā)現(xiàn)的胰島素樣生長(zhǎng)因子泛素偶聯(lián)蛋白，該蛋白翻譯攜帶的鼻咽癌基因的獨(dú)特高表達(dá)性與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切關(guān)相[9]。IGFBP-rP1通過CNE1細(xì)胞上皮間充質(zhì)胚胎轉(zhuǎn)化后在鼻咽癌疾病進(jìn)程中起癌基因作用，IGFBP-rP1能通過促鼻咽癌原癌基因表達(dá)而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲[10-11]。本研究結(jié)果證實(shí)，IGFBP-rP1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性具有調(diào)控作用，且證明IGFBP-rP1能經(jīng)特異性siRNA載體而調(diào)控鼻咽癌相關(guān)基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)其增強(qiáng)鼻咽癌干細(xì)胞特性的作用。本研究結(jié)果顯示，可以通過抑制IGFBP-rP1表達(dá)而抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。IGFBP-rP1培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞遷移能力較強(qiáng)，說明IGFBP-rP1表達(dá)后有較多CNE1細(xì)胞進(jìn)行遷移，提示鼻咽癌在該基因的調(diào)控下可發(fā)生較快遷移至其他組織器官，甚至?xí)奂暗捷^多的淋巴細(xì)胞。

CNE1細(xì)胞RNA中的琥珀酸還原酶，能使外源性MTT氧化還原為不溶性的甲瓚并沉積細(xì)胞，但死細(xì)胞無此功能[12]。當(dāng)細(xì)胞增殖時(shí)并不影響甲瓚在CNE1細(xì)胞中的數(shù)量，會(huì)隨著細(xì)胞增殖而分裂增多，伴隨細(xì)胞質(zhì)中不斷裂解為更小的粒子，當(dāng)CNE1細(xì)胞增殖趨向最大化完成時(shí)，二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活CNE1細(xì)胞增殖的數(shù)量[13-15]。本研究結(jié)果顯示，IGFBP-rP1相對(duì)表達(dá)量均值較低，說明表達(dá)基因產(chǎn)物與鼻咽癌的特異性較高。而IGFBP-rP1增殖較多CNE1細(xì)胞，說明該蛋白表達(dá)后鼻咽癌相關(guān)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)高增殖效率。不同細(xì)胞周期進(jìn)行抑制IGFBP-rP1時(shí)所產(chǎn)增殖的細(xì)胞數(shù)量、遷移、侵襲性不同，表明在特定時(shí)期對(duì)該蛋白進(jìn)行抑制能有效治療鼻咽癌。

本研究創(chuàng)新性在于通過抑制IGFBP-rP1基因表達(dá)對(duì)鼻咽癌系細(xì)胞進(jìn)行靶向定位治療，可避免臨床其他手術(shù)治療的不確定性。該手術(shù)利用基因抑制法可增強(qiáng)患者預(yù)后，鼻咽癌系細(xì)胞增殖率、轉(zhuǎn)移率、侵襲周圍其他組織的概率極大地降低，值得臨床其他難治性手術(shù)的借鑒。

綜上所述，探討抑制IGFBP-rP1可有效抑制鼻咽癌細(xì)胞系CNE1細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力，安全可靠，值得臨床推廣使用。

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