陳靜蘭,宋珊珊,孫樹(shù)紅,李學(xué)敏,劉炎俊,李兆杰,*,王玉明,薛長(zhǎng)湖

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.青島市中心醫(yī)院,山東青島 266042)

皂苷廣泛存在于動(dòng)植物中,是天然防御活性物質(zhì)。其中,海參皂苷的分子結(jié)構(gòu)已有700多種被闡明[1-4]。海參皂苷主要是為羊毛甾烷型三萜皂苷,絕大部分屬于海參烷[4-5],其寡糖鏈一般含有2～6個(gè)單糖基,一般為喹諾糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖、3-O-甲氧基葡萄糖及3-O-甲基木糖等單糖。其中海參皂苷Echinoside A(結(jié)構(gòu)如圖1),糖鏈序列Xyl-(-Sul)-β-(1-2)-Qui-β-(1-4)-Glu-β-(1-3)-MeGlu,[M-H]-m/z=1183.5[5-10,14]。海參皂苷具有抗真菌、抗病毒、抗腫瘤,細(xì)胞毒性等生理活性[11-13],但是由于其溶血毒性過(guò)強(qiáng),極大地限制了其在食品及醫(yī)藥中的應(yīng)用。因此研究降低海參皂苷溶血毒性具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

圖1 Echinoside A(EA)化學(xué)結(jié)構(gòu)

目前降低皂苷溶血毒性的方法主要有化學(xué)降解法、酶降解法及微生物降解法。利用化學(xué)制備高生理活性的次級(jí)苷,仍然是目前主要方法。國(guó)內(nèi)已有人利用醋酸和濃硫酸等酸法水解人參皂苷,制備出多種高活性次級(jí)人參皂苷,同時(shí)也有利用三氟乙酸和硫酸對(duì)海參皂苷Echinoside A進(jìn)行水解制備一列的次級(jí)海參皂苷及苷元,但是酸法專一性差,反應(yīng)條件劇烈，不易控制,極易破壞皂苷苷元結(jié)構(gòu),產(chǎn)物混雜,導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物分離困難[15-16]。皂苷分子結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵在堿水溶液中降解較難進(jìn)行,因此通常需要提高反應(yīng)溫度等加以實(shí)驗(yàn)[17]。而酶解法具有反應(yīng)條件溫和、專一性高、產(chǎn)率高、產(chǎn)物單一等特點(diǎn)。人參皂苷如Rb1、Rh2、Rg3等與河參皂苷結(jié)構(gòu)類似，都屬于三萜皂苷。國(guó)內(nèi)外已有多人利用微生物菌體或利用微生物制備人參皂苷酶來(lái)將人參皂苷酶解成稀有人參皂苷C-K、C-Mx等[18-20],但是微生物降解法中微生物篩選及培養(yǎng)非常困難,成本較高,產(chǎn)物較復(fù)雜，不利于單體分離制備。目前,已有利用商品糖苷酶制備高活性的人參皂苷[21],但利用商品糖苷酶進(jìn)行酶解未見(jiàn)報(bào)道。并且利用商品酶進(jìn)行制備低溶血毒性的次級(jí)海參皂苷,比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,同時(shí)有利于工業(yè)化利用。

本文選用5種商品糖苷酶對(duì)海參皂苷Echinoside A進(jìn)行酶解,篩選出有酶解效果的商品糖苷酶,并分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu),確定酶解產(chǎn)物,從而制備出次級(jí)海參皂苷,其溶血毒性明顯降低,有利于海參皂苷作為藥劑型商品開(kāi)發(fā)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菲律賓刺參(Pearsonothuria graeffei) 青島南山市場(chǎng);乙腈(色譜純)、碳酸氫銨(色譜純) 美國(guó)Sigma Aldrich公司;二甲基亞砜(DMSO) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;健康小白鼠(15～20 g,雌鼠,2只) 山東魯抗制藥有限公司;5種商品糖苷酶 見(jiàn)表5。

Aglient 1100型高效液相色譜儀、G6410型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Aglient公司。

表1 5種商品糖苷酶

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EA的制備 稱取菲律賓刺參1 kg在80 ℃烘箱烘干,然后粉碎成粉末,過(guò)200目篩;用60%乙醇在常溫條件下浸泡3 d,取上清液,浸泡三次,將上清液減壓濃縮,60 ℃水浴蒸干;經(jīng)水飽和正丁醇萃取,大孔樹(shù)脂柱層析除雜富集,正相硅膠析純化得到的總皂苷,最后反相硅膠柱層析分離得到海參皂苷EA[22]。EA的純度(%)=EA色譜圖峰面積/總峰面積×100

1.2.2 商品糖苷酶篩選及酶解產(chǎn)物分離純化 商品糖苷酶在pH5.0、40 ℃及100 U酶活力條件[21]下,酶解海參皂苷EA,每反應(yīng)12 h取樣一次,取5次樣。反應(yīng)60 h,利用TLC、HPLC以及質(zhì)譜檢測(cè)酶解產(chǎn)物。篩選出對(duì)海參皂苷EA有酶解效果的商品糖苷酶,并在此條件下酶解制備次級(jí)海參皂苷,利用制備液相分離純化得次級(jí)海參皂苷單體。

1.2.3 TLC檢測(cè)條件 展開(kāi)劑:氯仿/甲醇/水(70∶30∶3,V/V/V),顯色劑:10%硫酸乙醇。

1.2.4 HPLC-MS、ESI-MS/MS檢測(cè)條件及制備液相條件 HPLC:流動(dòng)相A相為乙腈,B相為0.1% NH4HCO3溶液,A相梯度隨著時(shí)間變化而變化:0～5 min,30%～30%;5～30 min,30%～60%;30～35 min,60%～30%;Aglient Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):205 nm。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,負(fù)離子模式;毛細(xì)管電壓3.0 kV;離子源溫度300 ℃;干燥氣溫度350 ℃;霧化氣(N2)流速10 L/min;壓力276 kPa;質(zhì)量掃描范圍:m/z 100～2000。

ESI-MS/MS:質(zhì)量掃描范圍:m/z 100～1000;碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量:80 eV;碰撞氣為高純氮?dú)狻?/p>

制備液相:流動(dòng)相:60%乙腈;流速:2 mL/min;色譜柱:AA12S05-2510WT ODS C18;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):205 nm。

1.2.5 紅細(xì)胞混懸液的制備 小白鼠麻醉后取腹腔主動(dòng)脈血,取血紅細(xì)胞,4 ℃保存;用時(shí)配制成2%的紅細(xì)胞(將兩只小鼠紅細(xì)胞混合)懸濁液。

1.2.6 受試樣品的配制 分別稱取4 mg海參皂苷EA及其次級(jí)皂苷,并分別溶解于1 mL DMSO配制成儲(chǔ)備液。用時(shí)利用生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的溶液:0、1、1.5、2、3、5、10、20、40 μg/mL。

1.2.7 受試樣品溶血當(dāng)量的測(cè)定 精確吸取各樣品0.5 mL,取0.5 mL蒸餾水作為陽(yáng)性對(duì)照管,取0.5 mL生理鹽水作為陰性對(duì)照管,每管設(shè)3個(gè)平行管。在上述各管中加入0.5 mL的2%紅細(xì)胞懸濁液,混勻,37 ℃水浴保溫2 h,取出立即冰浴終止反應(yīng),離心(3000 r/min,5 min),取上清液,570 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度,并計(jì)算溶血率。溶血率計(jì)算公式:溶血率(%)=(A樣- A陰)/(A陽(yáng)- A陰)×100。以樣品的溶血率對(duì)樣品濃度作圖得到各樣品溶血曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 18.0軟件進(jìn)行相應(yīng)數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EA的制備

按1.2.1的制備方法制得海參皂苷EA,并利用HPLC檢測(cè),得到出峰時(shí)間為15.7 min,根據(jù)DAD色譜圖峰面積計(jì)算,EA純度為93.2%(如圖2),可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 EA的HPLC色譜圖

2.2 商品糖苷酶篩選結(jié)果及產(chǎn)物制備

取60 h后的酶解液進(jìn)行TLC檢測(cè),結(jié)果如圖3。由圖可知,1、2、3號(hào)酶對(duì)海參皂苷EA有明顯的酶解效果,4、5號(hào)酶對(duì)樣品進(jìn)行酶解后,TLC圖中未發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物。2、3號(hào)酶的TLC圖中分別出現(xiàn)一條生成物檢測(cè)條帶,且Rf值皆為0.24,推測(cè)為同一種產(chǎn)物;而1號(hào)酶的TLC圖中出現(xiàn)兩條生成物檢測(cè)條帶,其中一種產(chǎn)物檢測(cè)條帶和2、3號(hào)酶的酶解產(chǎn)物的Rf值相同,推測(cè)與2、3號(hào)酶的酶解產(chǎn)物相同,另一種產(chǎn)物的Rf值為0.53較大,說(shuō)明其極性相對(duì)于前一種產(chǎn)物更小,推測(cè)可能是其被水解掉的糖基較多所致。

圖3 酶解產(chǎn)物的TLC分析圖

利用制備液相分離純化酶解產(chǎn)物化合物1、化合物2、化合物3和化合物4,白色晶體狀,不溶于水。

2.3 酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

利用靈敏的HPLC-MS檢測(cè)技術(shù),對(duì)1、2、3號(hào)酶的酶解產(chǎn)物進(jìn)行液質(zhì)檢測(cè),得到其總離子流圖(Total Ion Chromatogram,TIC),如圖4(峰1為底物EA)。由圖可知1號(hào)酶水解EA生成兩種產(chǎn)物化合物1(峰2)和化合物2(峰3),其m/z分別為845.3[M-H]-和699.3[M-H]-,而2、3號(hào)酶分別得化合物3(峰4)和化合物4(峰5),其荷比均為m/z 845.3[M-H]-。由于化合物1,化合物3,化合物4具有相同的保留時(shí)間與質(zhì)荷比,推測(cè)可能為相同物質(zhì)。

圖4 TIC圖和MS圖

根據(jù)分子質(zhì)量計(jì)算,推測(cè)1、2、3號(hào)酶對(duì)海參皂苷EA糖鏈中喹諾糖與葡萄糖之間的β-(1-4)糖苷鍵進(jìn)行了水解(如圖5),使皂苷EA脫去兩個(gè)單糖基MeGlc(176)和Glc(162),因此產(chǎn)物化合物1、化合物3和化合物4應(yīng)是相同物質(zhì);1號(hào)酶同時(shí)對(duì)皂苷EA糖鏈中木糖與喹諾糖之間的β-(1-2)糖苷鍵進(jìn)行了水解,使皂苷EA脫去3個(gè)單糖基Qui(146)、MeGlc(176)和Glc(162),生成產(chǎn)物化合物2。

圖5 商品糖苷酶水解EA的分子裂解模式圖

為了進(jìn)一步證明酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu),進(jìn)行ESI-MS/MS檢測(cè)。在負(fù)離子模式下,對(duì)酶解產(chǎn)物化合物1(m/z 845[M-H]-)和化合物2(m/z 699[M-H]-)母離子進(jìn)行裂解后,生成形成m/z 827、m/z 615和m/z 681、m/z 469的碎片離子(如圖8)。由于海參皂苷EA含有硫酸酯基的存在,其糖鏈沒(méi)有發(fā)生斷裂,而是先失去1個(gè)水分H2O(18 Da)形成m/z 1165[M-H]-的碎片離子,之后苷元上發(fā)生一系列的化學(xué)鍵斷裂,形成了含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的碎片離子,其m/z 953[M-H]-[23](如圖6,圖7)。根據(jù)計(jì)算得,兩種酶解產(chǎn)物的母離子m/z 845[M-H]-和m/z 699[M-H]-先失去一個(gè)水分子H2O(18 Da)后形成m/z 827[M-H]-和m/z 681[M-H]-的碎片離子,然后苷元上發(fā)生一系列的化學(xué)鍵斷裂,形成了含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的碎片離子,m/z 615和m/z 469,其碎裂方式與海參皂苷EA碎裂方式相同,說(shuō)明化合物1,2的苷元部分沒(méi)有發(fā)生改變,僅有糖鏈發(fā)生斷裂。由二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)化合物3和化合物4的斷裂方式與化合物1相同(如圖9)。由此可確定化合物1、化合物3和化合物4是同一種物質(zhì),是二糖基次級(jí)海參皂苷,化合物2是一糖基次級(jí)海參皂苷。

圖6 Echinoside A在負(fù)離子模式下的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖7 Echinoside A負(fù)離子模式下的裂解模式圖

圖8 酶解產(chǎn)物在負(fù)離子模式下的ESI-MS/MS圖

圖9 化合物3、4在負(fù)離子模式下的ESI-MS/MS圖

目前,利用化學(xué)方法來(lái)制備海參次級(jí)皂苷,但其苷元和糖鏈上的官能團(tuán)都會(huì)遭到不同程度破壞,如宋偉等[16]利用稀硫酸水解海參皂苷EA得到10種產(chǎn)物,所有產(chǎn)物都失去了硫酸酯基,其中生成苷元、單糖苷、二糖苷、三糖苷和四糖苷五類次級(jí)海參皂苷,然而每一類次級(jí)海參皂苷依據(jù)苷元結(jié)構(gòu)又分兩種海參次級(jí)苷—三醇型和二醇型;三氟乙酸水解產(chǎn)物單一,僅生成一個(gè)二醇苷元,但苷元上發(fā)生了脫水和雙鍵轉(zhuǎn)移。由于酶具有專一性,不同性質(zhì)的酶作用于不同構(gòu)型、不同組成的糖苷鍵,從而達(dá)到定向水解的目的。并且商品糖苷酶介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化法條件相對(duì)溫和、選擇性高、轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少、污染少[21]。相較于化學(xué)法水解,酶反應(yīng)條件溫和,專一性強(qiáng),較好的保護(hù)了苷元和硫酸酯基的結(jié)構(gòu)完整,產(chǎn)物單一,宜于產(chǎn)物純化分離。另外，利用商品酶進(jìn)行制備低溶血毒性的次級(jí)海參皂苷,比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,且有利于工業(yè)化制備。

2.5 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 溶劑的溶血作用 DMSO是對(duì)血紅細(xì)胞相對(duì)溫和的有機(jī)試劑,由表2可以看出當(dāng)DMSO高達(dá)5%和10%濃度時(shí),其溶血率卻僅有0.9%、1.87%,肉眼可以直接觀察到離心后的兩者上清液均無(wú)紅色現(xiàn)象,這說(shuō)明DMSO溶血毒性濃度在低于5%時(shí),溶劑DMSO對(duì)溶血影響非常小。

表2 DMSO溶血率

2.5.2 海參皂苷EA及酶解產(chǎn)物的溶血作用 由圖10可知,海參皂苷EA及酶解產(chǎn)物均具有溶血作用。在0～5 μg/mL濃度范圍內(nèi),EA的溶血率增長(zhǎng)極快,且在小于5 μg/mL時(shí)其溶血率已達(dá)到60%;當(dāng)溶度在5～20μg/mL范圍內(nèi),其溶血率緩慢增加到100%;在濃度20～40μg/mL范圍內(nèi),其溶血率基本保持不變。而化合物1在0～5 μg/mL濃度范圍內(nèi)溶血率增速明顯放緩,而且在5～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)溶血率保持在60%左右,相對(duì)于EA的溶血率有明顯下降?；衔?的溶血率在0～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)小于10%,當(dāng)濃度達(dá)40 μg/mL(僅含DMSO1%,可以忽略其對(duì)溶血的影響)時(shí)溶血率也小于30%。在相同濃度時(shí),其溶血率:化合物2<化合物1<海參皂苷EA。由此說(shuō)明海參皂苷的溶血率與皂苷糖鏈和皂苷濃度有密切關(guān)系,其中皂苷糖鏈愈短溶血率愈低;在較低濃度范圍內(nèi),海參皂苷EA和化合物1的溶血率增長(zhǎng)較快,而化合物2在濃度較大時(shí),溶血率才有明顯增長(zhǎng)。

圖10 海參皂苷EA及酶解產(chǎn)物的溶血率曲線圖

海參皂苷溶血毒性與其皂苷結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系,尤其是對(duì)其糖鏈的修飾,但是目前主要利用化學(xué)水解法降低皂苷的溶血毒性,而化學(xué)法都對(duì)苷元和糖鏈上的官能團(tuán)有嚴(yán)重破壞作用,并未詳細(xì)闡明硫酸酯基以及保持完整苷元結(jié)構(gòu)的次級(jí)海參皂苷與其溶血毒性的關(guān)系。本文有效地保護(hù)了硫酸酯基以及苷元上的其他官能團(tuán),進(jìn)一步證明了海參皂苷的溶血率與糖鏈有密切關(guān)系,糖鏈愈短其溶血率愈低,為研究次級(jí)海參皂苷化合物的抗腫瘤、抗衰老等其他生理活性,以及硫酸基團(tuán)對(duì)其生理活性的影響研究提供基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本文從五種商品糖苷酶篩選出三種對(duì)海參皂苷EA有專一性酶解作用的商品糖苷酶有果膠酶、果膠酶Ultra SP-L和纖維素酶。其中果膠酶Ultra SP-L和纖維素酶只斷裂寡糖鏈喹諾糖和葡萄糖之間的β-(1-4)糖苷鍵得到二糖基次級(jí)海參皂苷化合物1,即EA→化合物1。果膠酶主要斷裂糖鏈喹諾糖與葡萄糖之間的β-(1-4)糖苷鍵,同時(shí)將木糖與喹諾糖之間的β-(1-2)糖苷鍵斷裂得到一糖基次級(jí)海參皂苷化合物2,即EA→化合物1,EA→化合物2。海參皂苷的溶血率與糖鏈有密切關(guān)系,糖鏈愈短其溶血率愈低。

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