項(xiàng)昭保,伍曉玲,鐘 雪

(1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,重慶 400067;2.天然藥物研究重慶高校市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400067;3.重慶工商大學(xué)評(píng)估與督導(dǎo)辦公室,重慶 400067)

中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部首批公布的藥食兩用物種橄欖,是橄欖屬植物橄欖(CanariumalbumL.)的果實(shí),具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]和較多的藥用價(jià)值,如解酒護(hù)肝[2]、抗氧化[3]、抗菌[4]、消炎[5]、抗乙肝病毒[6]、抗HIV[7]、防癌[8]等?！侗静菥V目》的記載,橄欖屬植物橄欖的葉子亦可入藥,現(xiàn)代藥理研究表明,橄欖葉提取物有較好的抑菌作用[9],其內(nèi)含有沒食子酸、穗花杉雙黃酮和槲皮素等單體化合物[10]?？傮w來說,有關(guān)橄欖葉的研究并不多,但有較多油橄欖葉提取物的報(bào)道[11-13],而且報(bào)道題目也多寫成橄欖葉提取物[12-13],易引起混淆,油橄欖俗稱洋橄欖(OleaeuropaeaL.)為木犀欖屬植物,并非本文研究對(duì)象,即中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部首批公布的藥食兩用橄欖(C.album),應(yīng)注意區(qū)分。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界中,具有保護(hù)心血管、保肝、抗氧化、抗菌等多種生理活性,來源于藥食兩用植物中的黃酮用于開發(fā)保健食品[14]是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。橄欖葉中含有黃酮類化合物,且橄欖葉總黃酮(以下簡(jiǎn)稱TFLC)具有較好的抗氧化活性[13],但制備方法不多且得率較低,如劉玉紅等[15-16]采用超聲和微波兩種輔助技術(shù)分別提取TFLC,其得率均不足2%;林烽[17]采用傳統(tǒng)熱回流乙醇浸提法提取TFLC并優(yōu)化工藝,該最佳工藝得率達(dá)4.75%。超聲波與微波同作為現(xiàn)代輔助提取技術(shù),相比于傳統(tǒng)提取技術(shù),具有提取時(shí)間短、得率高等優(yōu)點(diǎn),已在天然產(chǎn)物提取中廣泛應(yīng)用[18-20],在TFLC提取研究的報(bào)道中,超聲或微波提取得率卻低于傳統(tǒng)熱回流乙醇浸提。為進(jìn)一步研究TFLC超聲提取,得到一條制備效率較高的TFLC提取工藝,本文采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取橄欖葉總黃酮的提取工藝,明確超聲波輔助提取技術(shù)對(duì)TFLC的提取效果,為進(jìn)一步開發(fā)和充分利用橄欖葉中黃酮類活性物質(zhì)提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

橄欖葉 2014年7月新鮮橄欖葉采摘,除雜,曬干,粉碎后過60目篩儲(chǔ)存在廣口瓶中備用,重慶市江津區(qū)石蟆鎮(zhèn)橄欖種植基地;蘆丁對(duì)照品 成都普思生物科技有限公司;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KS-150D型超聲提取儀 浙江省寧波市科生儀器廠;T6型新悅分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SQP124型天子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TFLC提取方法 準(zhǔn)確稱取2.0000 g的橄欖葉樣品,按一定的液料比加入一定濃度的乙醇溶液,設(shè)定相應(yīng)的超聲提取時(shí)間、提取溫度和超聲波功率,進(jìn)行超聲輔助乙醇提取TFLC[21]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精確稱取蘆丁對(duì)照品20.0 mg配制成濃度為0.80 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。參照文獻(xiàn)[21]用分光光度法測(cè)定梯度濃度溶液的吸光度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 選取工藝中的超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度、乙醇濃度和料液比為影響因素,平行實(shí)驗(yàn)三次,考察各因素對(duì)TFLC得率的影響。

1.2.3.1 超聲波作用時(shí)間對(duì)TFLC得率的影響 分別準(zhǔn)確稱取2.0000 g的橄欖葉樣品5份,分別按液料比15∶1 mL/g加入75%乙醇溶液,在超聲波功率為200 W,提取溫度40 ℃的實(shí)驗(yàn)條件下依次提取10、20、30、40、50 min,提取液過濾、定容、測(cè)定并計(jì)算TFLC得率,平行實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3.2 超聲波功率對(duì)TFLC得率的影響 分別準(zhǔn)確稱取2.0000 g的橄欖葉樣品6份,分別加入按液料比15∶1 (mL/g)加入75%乙醇溶液,在提取溫度40 ℃,超聲波功率為50、100、150、200、250、300 W的實(shí)驗(yàn)條件下分別提取40 min。提取液過濾、定容、測(cè)定并計(jì)算TFLC得率,平行實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3.3 提取溫度對(duì)TFLC得率的影響 分別準(zhǔn)確稱取2.0000 g橄欖葉樣品5份,分別按液料比15∶1 (mL/g)加入75%乙醇溶液,分別在30、40、50、60、70 ℃溫度下,250 W超聲功率的實(shí)驗(yàn)條件下提取40 min。提取液過濾、定容、測(cè)定并計(jì)算TFLC得率,平行實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3.4 乙醇濃度對(duì)TFLC得率的影響 分別準(zhǔn)確稱取2.0000 g橄欖葉樣品5份,分別按液料比15∶1 (mL/g)加入濃度分別為 55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液,在超聲波功率250 W、提取溫度50 ℃的實(shí)驗(yàn)條件下,分別提取40 min。提取液過濾、定容、測(cè)定并計(jì)算TFLC得率,平行實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3.5 液料比對(duì)TFLC得率的影響 分別準(zhǔn)確稱取2.0000 g橄欖葉樣品5份,分別按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g)加入85%乙醇溶液,在超聲波功率為250 W、提取溫度為50 ℃的實(shí)驗(yàn)條件下分別提取40 min。提取液過濾、定容、測(cè)定并計(jì)算TFLC得率,平行實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化TFLC的超聲輔助提取工藝 基于Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理,選取影響TFLC得率的主要因素,即提取溫度、乙醇濃度、超聲功率,然后進(jìn)行三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn),應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化總黃酮的提取工藝參數(shù),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

表1 Box-Behnken的中心組合因素水平表

1.2.5 TFLC得率的計(jì)算 準(zhǔn)確吸取1 mL TFLC提取液,用濃度為30%的乙醇水溶液定容到25 mL的容量瓶中。根據(jù)1.2.2方法測(cè)定吸光度值。平行實(shí)驗(yàn)三次,橄欖葉樣品中的總黃酮得率按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品計(jì),即:

式中,D:TFLC得率,%;C:待測(cè)液中總黃酮的濃度,mg·mL-1;T:溶液配制的稀釋倍數(shù);V:提取液總體積,mL;M:橄欖葉粉末質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)三次取平均值,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖分析。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)運(yùn)用Design expert 8.0.6軟件進(jìn)行處理、分析,選擇最佳提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法中1.2.2得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示,回歸方程為:A=5.7813C+0.003,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.9993,這表明在所測(cè)濃度范圍(0.032～0.16 mg·mL-1)內(nèi),吸光度值A(chǔ)與蘆丁溶液的濃度C之間線性相關(guān)性很好。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲波時(shí)間對(duì)TFLC得率的影響 根據(jù)圖2可知,在40 min的時(shí)間范圍內(nèi),TFLC得率隨著超聲波提取時(shí)間的增加而增大;超聲提取時(shí)間大于40 min以后,TFLC得率略有下降,這可能是隨著超時(shí)時(shí)間增加,在乙醇溶劑中有些黃酮發(fā)生一些反應(yīng),導(dǎo)致化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞。這也與劉玉紅[16]采用超聲波輔助提取TFLC的最佳提取時(shí)間40 min一致,因此在隨后的單因素實(shí)驗(yàn)中選擇的超聲波提取時(shí)間為40 min,且不作為響應(yīng)面考察條件。

圖2 超聲提取時(shí)間對(duì)TFLC得率的影響

2.2.2 超聲波功率對(duì)TFLC得率的影響 根據(jù)圖3可知,在超聲功率250 W之前,超聲功率增加,TFLC得率也隨之增大,但當(dāng)超聲波功率超過250 W之后,TFLC的得率卻開始出現(xiàn)一定程度的下降。這可能是提取時(shí)間一定的前提下,大功率的超聲波導(dǎo)致有些黃酮在乙醇溶劑中發(fā)生一些反應(yīng)從而某些黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞,最終導(dǎo)致總黃酮得率有所下降,這與王涓等[22]報(bào)道相符,故根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取超聲波功率200、250、300 W作為下一步的響應(yīng)面考察條件。

圖3 超聲功率對(duì)TFLC得率的影響

2.2.3 提取溫度對(duì)TFLC得率的影響 根據(jù)圖4可知,在溫度低于50 ℃之前,隨著提取溫度的增加,TFLC得率也逐漸增大,但當(dāng)提取溫度高于50 ℃后,TFLC得率卻開始逐漸減少,可這能與較高的溫度會(huì)導(dǎo)致某些黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞,從而最終導(dǎo)致TFLC的得率反而有所下降,這與曲中堂等[21]報(bào)道一致,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,因此選擇45、50、55 ℃ 這3個(gè)溫度作為下一步的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)考察條件。

圖4 提取溫度對(duì)TFLC得率的影響

2.2.4 乙醇濃度對(duì)TFLC得率的影響 根據(jù)圖5可知,在乙醇濃度低于85%時(shí),隨著乙醇濃度的增加,TFLC得率也隨之增加,但當(dāng)濃度超過85%后,TFLC得率不再增加,反而開始有所下降,這與劉玉紅[16]乙醇浸提TFLC確定的乙醇濃度為80%相近,這是極性相似相溶原理的結(jié)果,與TFLC的極性大小相關(guān),故根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇80%,85%和90%作為響應(yīng)面考察條件。

圖5 乙醇濃度對(duì)TFLC得率的影響

2.2.5 液料比對(duì)TFLC得率的影響 由圖6可知,當(dāng)液料比在10∶1～25∶1 (mL/g)之間,TFLC的得率與液料比增加成正比,然而當(dāng)液料比超過25∶1 (mL/g)后,TFLC的得率卻基本沒有變化,這可能是在液料比較低時(shí),隨著液料比增大,溶劑量增多,橄欖葉樣品在溶液中的分散程度也增大,接觸面積增大,有利于TFLC的提取。但隨著液料比增大到一定程度后,TFLC得率增長(zhǎng)量開始明顯放緩,而且液料比太大,會(huì)造成溶劑的浪費(fèi),因此本研究中,當(dāng)料液比達(dá)到25∶1 (mL/g)時(shí),溶劑對(duì)TFLC溶解已達(dá)到平衡,增加溶劑量對(duì)增加總黃酮的得率幾乎無影響,這與鄧夢(mèng)琴等[23]報(bào)道一致。故本次實(shí)驗(yàn)中設(shè)定料液比為25∶1 (mL/g),并且不作為響應(yīng)面考察條件。

圖6 液料比對(duì)TFLC得率的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化TFLC的提取工藝

依據(jù)前面的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)一步應(yīng)用三因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。并選擇超聲功率、乙醇濃度和提取溫度作為自變量,TFLC得率作為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用design expert 8.0.6軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果作二次回歸擬合,把獲得的TFLC得率對(duì)自變量超聲功率、乙醇濃度和提取溫度開展二次多項(xiàng)回歸,得到二階多項(xiàng)式的數(shù)學(xué)模型如下:

Y=5.41+0.34A+0.25B-0.45C-0.02AB+0.02AC+0.1BC-1.25A2-0.57B2+0.26C2

該數(shù)學(xué)模型是否可靠,可通過相關(guān)系數(shù)與方差分析結(jié)果來考察。由表3可知,模型的相關(guān)系數(shù)R2=97.37%,大于0.8,表明擬合度很好[24],即響應(yīng)值TFLC得率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有很好的擬合度;模型的P(Pr>F)值<0.0001,遠(yuǎn)小于0.01,這說明所得的回歸方程非常顯著;最后,失擬項(xiàng)的Pr大于0.05,說明在置信度為95%時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果和預(yù)測(cè)模型匹配得很好。因此該數(shù)學(xué)模型成立。而且,一次項(xiàng)A和C對(duì)Y值的影響高度顯著(p<0.01),B對(duì)Y值也有顯著的影響(p<0.05),二次項(xiàng)A2對(duì)響應(yīng)值Y具有極其顯著的影響(p<0.0001),B2對(duì)響應(yīng)值Y也具有高度顯著的影響(p=0.0009),C2對(duì)Y值也有顯著的影響(p<0.05)。

表3 回歸分析結(jié)果

當(dāng)響應(yīng)曲面坡度陡峭,則說明響應(yīng)值受變量交互作用明顯,反之,當(dāng)響應(yīng)曲面坡度平滑,則說明響應(yīng)值受各個(gè)變量變化的影響小。通過比較圖7～圖9,考察超聲功率、乙醇濃度和提取溫度這三個(gè)因素兩兩之間的交互作用對(duì)TFLC得率的影響不顯著。

圖7 超聲功率和提取溫度對(duì)TFLC得率的交互影響

圖8 超聲功率和乙醇濃度對(duì)TFLC得率的交互影響

圖9 乙醇濃度和提取溫度對(duì)TFLC得率的交互影響

2.4 最佳提取工藝的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

通過響應(yīng)面分析結(jié)果,最佳提取工藝參數(shù)如下,即:超聲功率為287.34 W,乙醇溶液濃度為80%,提取溫度為50.57 ℃,預(yù)測(cè)得率為5.68%。為實(shí)際操作的方便,將實(shí)際工藝參數(shù)調(diào)整為超聲功率285 W,乙醇溶液濃度80%,提取溫度51 ℃,并進(jìn)行了5次平行實(shí)驗(yàn),在此提取參數(shù)下,TFLC的實(shí)際得率可達(dá)5.83%,實(shí)際得率與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅有2.64%。

3 結(jié)論

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并通過三因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),得到了超聲波輔助提取TFLC的最佳工藝,即:超聲功率為285 W,乙醇溶液濃度為80%,超聲提取時(shí)間為40 min,提取溫度為51 ℃和液料比為25∶1 (mL/g)。在該工藝條件下TFLC的得率可達(dá)5.83%,表明超聲波輔助提取技術(shù)有助于提高TFLC制備效率。此外,TFLC含量較高、制備較易,原料食用安全,值得進(jìn)一步開發(fā)和利用。

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