高雅鑫,楊 森,李雨恬,李 點,魏梟雄,淑 英,張志勝

(河北農業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071000)

牡蠣俗稱海蠣子、生蠔等,俗稱“海里的牛奶”，是唯一可生吃的貝類,不僅肉質鮮美,而且營養(yǎng)豐富,富含?；撬?、多糖等多種生物活性物質,是我國衛(wèi)生部第一批批準的食藥兩用的功能性療效品[1],具有抗菌、降血壓和抗氧化等生物活性[2-6]。但由于牡蠣存在易腐難保鮮、深加工技術及利用率低,嚴重限制了牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的高產值的發(fā)展。通過生物技術降解蛋白質不僅可以提高蛋白質的利用率,還能提取出豐富的營養(yǎng)物質和功能性成分。

目前對牡蠣多采用單酶水解法,但在酶解中常存在氨基酸態(tài)氮含量低、風味欠佳等問題,為了提高牡蠣酶解液中氨基態(tài)氮含量低的問題,本實驗采用中性蛋白酶和風味蛋白酶協(xié)同酶解牡蠣,利用Box-Behnken法對牡蠣酶解工藝參數(shù)進行優(yōu)化,得到了牡蠣雙酶協(xié)同酶解的最佳工藝參數(shù),降低了生產成本,為牡蠣的深加工和綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 購自秦皇島嘉輝水產食品有限公司;中性蛋白酶(酶活6萬U/g)、堿性蛋白酶(酶活10萬U/g)、酸性蛋白酶(酶活19萬U/g)、木瓜蛋白酶(酶活50萬U/mg)、胰蛋白酶(酶活250 NF/mg)、風味蛋白酶(酶活20 U/mg) 均購自南寧東恒華道生物科技有限責任公司;乙腈(色譜純)、乙酸、乙酸鈉、2,4-二硝基氟苯、甲醛(37%)、鹽酸、氫氧化鈉等 均購自北京康普匯維科技有限公司;所用試劑 均為分析純。

HH-4電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器公司;PHS-25臺式pH計、CP64電子天平、JD-TGL20MW臺式離心機 昆山吉和力儀器有限公司;79-1磁力攪拌器、JJ-2組織搗碎勻漿機 江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所;7890A-5975C型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Symmetry Column C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)色譜柱 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣的酶解工藝流程及操作要點 牡蠣→流水解凍→搗碎→10 g勻漿→1∶6的比例加蒸餾水,調節(jié)pH為7.0→酶解(酶解溫度為50 ℃,時間為3 h,酶添加量5%)→加熱至100 ℃→滅酶15 min→水浴冷卻→靜置→5000 r/min離心20 min→獲得上清液[7]。

1.2.2 單酶酶解篩選實驗 取牡蠣流水解凍,用組織搗碎機將牡蠣肉勻漿,然后取定量的勻漿,按照1∶6的比例加蒸餾水,在六種酶的最適作用條件下進行酶解,酶解一定的時間,100 ℃滅活10 min,水浴冷卻靜置后,4000 r/min離心15 min,取上清液,六種蛋白酶的最適作用條件如表1。

表1 六種蛋白酶的酶解條件

1.2.3 牡蠣雙酶協(xié)同酶解單因素實驗

1.2.3.1 考察中性蛋白酶與風味蛋白酶的添加量之比對雙酶協(xié)同酶解效果的影響 中性蛋白酶與風味蛋白酶的添加量之比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,提取條件為pH7.0、溫度50 ℃、酶解2 h、加酶總量為勻漿的5%時,比較不同添加量之比對酶解效果的影響[8-9]。

1.2.3.2 考察不同加酶量對雙酶協(xié)同酶解效果的影響 加酶總量分別為2%、3%、4%、5%、6%,提取條件為pH7.0、溫度50 ℃、酶解2 h、添加量之比1∶1時,比較不同加酶總量對酶解效果的影響。

1.2.3.3 考察不同pH對雙酶協(xié)同酶解效果的影響 提取條件為溫度50 ℃、酶解2 h、加酶總量5%、添加量之比1∶1時,pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0時,比較不同pH對酶解效果的影響。

1.2.3.4 考察不同酶解時間對雙酶協(xié)同酶解效果的影響 酶解時間分別為1、2、3、4、5 h,提取條件為溫度50 ℃、加酶總量5%、添加量之比1∶1,pH7.0時,比較不同酶解時間對酶解效果的影響。

1.2.3.5 考察不同溫度對雙酶協(xié)同酶解效果的影響 酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,提取條件為pH7.0、酶解2 h、加酶總量5%、添加量之比1∶1時,比較不同酶解溫度對酶解效果的影響。

1.2.4 雙酶協(xié)同酶解工藝參數(shù)的響應面優(yōu)化實驗設計 根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設計原理[10],在雙酶協(xié)同酶解牡蠣單因素的基礎上,選取與酶解效果密切相關的三個影響因素:溫度、pH、加酶量,以氨基氮含量為響應值,每個因素選取三個對酶解效果影響較大的水平,建立三因素三水平的Box-Behnken中心組合實驗。實驗因素水平如表2所示。

表2 響應面分析因素水平編碼

1.2.5 酶解液的指標檢測

1.2.5.1 牡蠣酶解液的氨基氮測定 采用甲醛電位滴定法測定牡蠣酶解液中氨基氮含量[12]。

1.2.5.2 牡蠣酶解液感官分值評定 通過20人的感官鑒評小組對酶解液的澄清度、色澤、腥味及苦味等感官特性指標進行感官評分[13],感官評定表見表3，之后將相應的評分總和,取其平均值,對六種蛋白酶進行比較,得到適宜的兩種蛋白酶進行協(xié)同酶解。在本試驗中，主要是以氨基氮含量作為評價指標進行酶解條件優(yōu)化，故感官評定僅作為篩選蛋白酶時的參考指標。

表3 牡蠣酶解液的感官評定

1.2.5.3 牡蠣酶解液游離氨基酸測定 采用2,4-二硝基氯苯HPLC法分析牡蠣酶解液進行游離氨基酸含量測定。儀器及色譜條件:色譜柱:Symmetry Column C18(4.6 mm×250 mm×5 μm);紫外檢測器的波長360 nm;流動相A為純乙腈,流動相B為pH6.40的乙酸-乙酸鈉緩沖液,洗脫條件如表4;流速為1.0 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量10 μL。

表4 梯度洗脫程序

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert軟件進行相應的數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 單一品種蛋白酶的酶解效果比較

單一品種蛋白酶的酶解液中氨基氮含量與感官評定分值的比較見圖1和圖2。用木瓜蛋白酶進行酶解,氨基氮含量最小,用中性蛋白酶進行酶解,氨基氮含量最大,其中用風味蛋白酶酶解得到的氨基氮含量較高;另一方面,堿性蛋白酶條件下感官分值最低,風味蛋白酶條件下感官分值最高,其中中性蛋白酶條件下感官結果處于中等水平。用中性蛋白酶氨基氮含量較高,常用于提取海洋生物的生物活性物質,但中性蛋白酶的酶解液在色澤和腥味方面不太理想,因此選用感官評價較高的風味蛋白酶與其協(xié)同酶解,在色澤和腥味上加以調節(jié),并且有利于一些呈味氨基酸的游離,從而達到酶解液感官特性的改善。綜合考慮兩指標,確定選擇中性蛋白酶和風味蛋白酶兩種單酶對牡蠣進行協(xié)同酶解相對較好。

圖1 不同蛋白酶的酶解效果

圖2 不同蛋白酶的感官評定分

2.2 牡蠣雙酶協(xié)同酶解單因素實驗

2.2.1 牡蠣雙酶協(xié)同酶解中性蛋白酶與風味蛋白酶添加量之比的確定 圖3可知,中性蛋白酶與風味蛋白酶的比例由1∶1上升到1∶5的過程中,酶解液中氨基氮含量不斷下降,從而說明風味蛋白酶所占的比例越大,在牡蠣雙酶協(xié)同酶解的效果上越不好,也表明風味蛋白酶的主要作用在于改善呈味,對提取氨基氮所起作用較小。因此在酶解液中氨基氮含量的問題上,選擇中性蛋白酶與風味蛋白酶添加量之比為1∶1。

圖3 不同添加量之比對酶解效果的影響

2.2.2 牡蠣雙酶協(xié)同酶解加酶總量的確定 由圖4可知,隨著加酶總量的增大,氨基氮含量雖然有所上升,但是上升趨勢較緩且逐漸趨于平穩(wěn),當加酶總量達到5%時,僅僅有微小的上升趨勢。考慮到成本節(jié)約以及后期處理的問題,不宜過度添加蛋白酶,因此選擇5%作為Box-Behnken設計實驗的一個中心點。

圖4 不同添加量對酶解效果的影響

2.2.3 牡蠣雙酶協(xié)同酶解pH的確定 不同的pH條件下,酶制劑顯示出不同的酶活力,不適宜的pH會導致酶的空間構象發(fā)生改變,當遇到極端pH時甚至可能導致酶失活;酶解體系的pH還決定了底物與酶的結合狀態(tài),促進或抑制酶制劑與底物的結合,從而影響蛋白質的水解程度[14]。由圖5可知,pH由5.0上升到9.0的過程中,在pH達到7.0時,氨基氮含量到一個最大值,pH<7.0時,氨基氮含量隨著pH的升高而上升;但pH>7.0時,氨基氮含量呈下降趨勢。因此選擇pH為7.0作為Box-Behnken設計實驗的一個中心點。

圖5 不同pH對酶解效果的影響

2.2.4 牡蠣雙酶協(xié)同酶解時間的確定 由圖6可知,酶解時間由1 h上升到5 h的過程中,氨基氮含量隨著酶解時間的增加有明顯上升,但酶解時間達到3 h后,氨基氮含量幾乎不再有變化,考慮到時間成本,故選擇最佳協(xié)同酶解時間為3 h。

圖6 不同時間對酶解效果的影響

2.2.5 牡蠣雙酶協(xié)同酶解溫度的確定 由圖7可知,當酶解溫度達到50 ℃左右時,氨基氮含量達到一個最大值,溫度由30 ℃升至50 ℃,氨基氮含量也隨之升高,但當溫度高于50 ℃時,氨基氮含量卻隨之下降,說明蛋白酶存在最適酶解溫度,只有在兩種蛋白酶的最適溫度范圍內,才能達到較好的酶解效果,溫度過高,易引起部分酶失去生物催化活性,不利于酶解反應。因此,選擇50 ℃作為Box-Behnken設計實驗的一個中心點。

圖7 不同溫度對酶解效果的影響

2.3 響應面優(yōu)化結果分析

2.3.1 響應模型的建立與數(shù)據(jù)分析 由Design Expert統(tǒng)計分析軟件設計出的實驗方案及結果如表5所示,以氨基氮含量為響應值,以酶解溫度(A)、加酶量(B)、pH(C)為自變量,建立三因素三水平的Box-Behnken中心組合實驗設計,共包括17個實驗方案。根據(jù)表5的實驗結果,用Design Expert軟件對A、B、C三因素進行二次多元回歸擬合,得到二次多項回歸方程:Y=8.09+0.063A+0.14B+0.11C+2499.87AB+0.11AC+0.038BC-0.15A2-0.15B2-0.19C2;R2=0.9728。

表5 Box-Behnken實驗設計及結果

由表6可知,該模型F值為32.36,p<0.0001,說明該模型有極顯著意義,失擬項(p>0.05)差異不顯著,說明其他未知因素對酶解效果干擾極小,模型相對穩(wěn)定,擬合程度較高,該模型R2=0.9728,表明該模型擬合程度良好,實驗誤差小,適合對牡蠣蠣酶解中氨基氮含量進行分析和預測,可較好地預測牡蠣協(xié)同酶解液中氨基氮含量的變化。在該回歸模型中,一次項A對協(xié)同酶解影響顯著,B與C對協(xié)同酶解影響極顯著;二次項A2、B2、C2對協(xié)同酶解均有極顯著影響;交互項AB與BC對協(xié)同酶解影響不顯著,而溫度與pH交互項AC對協(xié)同酶解影響顯著。

表6 回歸模型方差分析結果

2.3.2 響應曲面的交互效應分析 酶解溫度、加酶量以及酶解pH三因素之間的相互作用對響應值的影響如圖8所示。響應曲面圖彎曲程度的高低,可反映兩因素交互作用對響應值的影響程度,一般彎曲程度越高,即坡度越陡,說明兩因素的作用越顯著。

由圖8可知,氨基氮含量隨著酶解溫度和pH的增加先增后減,先增加可能由于未達到最適的溫度和pH范圍內,蛋白酶活力發(fā)揮有限,之后減少可能由于過熱、過酸、過堿導致蛋白酶失去活力,從而氨基氮含量下降。結合曲面圖及方程中交互項的顯著性分析,說明,溫度和pH的交互作用相比加酶量與溫度、加酶量與pH的交互作用較強。

圖8 兩因素之間相互作用的響應面圖

2.3.3 最優(yōu)酶解工藝參數(shù)確定 在Box-Behnken分析法的基礎上,由回歸模型計算得出的最優(yōu)酶解參數(shù)為:酶解溫度51.74 ℃、加酶總量4.70%、酶解pH7.42,氨基態(tài)氮的含量為8.162 mg/g。為了檢驗響應面的分析結果與實際結果的一致性以及便于操作和控制各項參數(shù),對參數(shù)進行調整后進行了驗證實驗,在溫度51.7 ℃、加酶總量4.7%、pH7.4、雙酶的添加量之比1∶1的條件下酶解3 h,并進行3次平行實驗,得出的平均氨基氮含量為8.197 mg/g,其標準差SD值為0.0042。與理論值接近,說明優(yōu)化結果良好,可知該模型預測的準確度較高。

2.4 游離氨基酸的種類及含量

采用HPLC法對牡蠣協(xié)同酶解液中游離氨基酸含量進行測定,所得結果如表7所示。通過表7可知,酶解液中異亮氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量較少,而絲氨酸、組氨酸、精氨酸等氨基酸含量較高。除普通的氨基酸外,酶解液中還含有?；撬醄15-18](0.209 mg/g)。WHO/FAO標準規(guī)定人體中的必需氨基酸占總氨基酸的40%,非必需氨基酸60%。當食物中這兩者越接近此值,營養(yǎng)價值相對越高。從表7可知,雙酶協(xié)同酶解液中必需氨基酸的百分比含量基本符合WHO/FAO標準氨基酸模式。說明酶解液中的游離氨基酸符合人體的必需氨基酸代謝要求。

表7 HPLC法測定牡蠣酶解液中游離氨基酸含量

3 結論

本實驗以牡蠣為原料,以中性蛋白酶和風味蛋白酶協(xié)同酶解牡蠣,建立了以氨基氮含量為響應值,以加酶量、pH、溫度三因素為自變量的數(shù)學模型,優(yōu)化了雙酶協(xié)同酶解牡蠣的工藝參數(shù),確定在酶解溫度51.7 ℃、加酶量4.7%、酶解pH7.4的條件下,所獲得酶解液其氨基態(tài)氮的含量為8.197 mg/g，與理論值接近,說明優(yōu)化結果良好。在該酶解條件下,不僅保存了牡蠣酶解液中的營養(yǎng)成分,氨基酸種類豐富,幾乎包含所有的必需氨基酸種類,能夠滿足人體所需的各種氨基酸,為牡蠣的深加工和綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

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