楊 斌，周 健，明紅梅

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

我國(guó)釀酒已有幾千年的歷史，用曲釀酒是我國(guó)古代勞動(dòng)人民的重大發(fā)明。目前中國(guó)白酒是以糧谷為主要原料，以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑[1]，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵和蒸餾而制成的飲料酒，在世界六大蒸餾酒中別具一格。酒曲作為釀酒過(guò)程中的糖化、發(fā)酵和生香劑，具有豐富的微生物和酶系，對(duì)形成白酒的香型及質(zhì)量具有重要作用[2]。因此，在我國(guó)傳統(tǒng)釀酒行業(yè)一直流傳著“曲乃酒之骨”[3-4]的說(shuō)法。傳統(tǒng)濃香型大曲以瀘型曲為代表，是以小麥為原料，經(jīng)粉碎、加水拌和壓制成曲醅[5]，經(jīng)天然接種多種微生物共同發(fā)酵而成的微生態(tài)制品。

作為中國(guó)傳統(tǒng)釀造的濃香型白酒大曲，其微生物種類(lèi)是非常豐富的。大曲微生物包括細(xì)菌、酵母、霉菌和放線(xiàn)菌[6-7]。大曲中的細(xì)菌主要有乳酸菌、醋酸菌、芽孢桿菌。高溫大曲中的細(xì)菌多為芽孢桿菌[8]。芽孢桿菌在自然界中廣泛分布，與其他微生物相比，具有耐酸、耐鹽、耐高溫[9-10]等優(yōu)點(diǎn)。大曲中芽孢桿菌群可以產(chǎn)生蛋白酶、液化酶、淀粉酶、酒化酶、纖維素酶等多種酶類(lèi)[11]。醬香型大曲生產(chǎn)過(guò)程對(duì)醬香風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)的芽孢桿菌包括地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等，黃永光等[12]研究表明，芽孢桿菌群提高了固態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物吡嗪類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)的含量。濃香型大曲中的芽孢桿菌群具有分解蛋白質(zhì)和淀粉的功能，是生成芳香族化合物的重要菌源[13]。而大曲作為糖化發(fā)酵劑，發(fā)酵力指標(biāo)是衡量大曲質(zhì)量的重要指標(biāo)，與之相關(guān)的微生物是研究熱點(diǎn)[14]?，F(xiàn)在科學(xué)工作者主要關(guān)注酵母的發(fā)酵力[15]，研究芽孢桿菌的發(fā)酵力相對(duì)較少。據(jù)醬香型白酒研究報(bào)道：芽孢桿菌對(duì)白酒發(fā)酵力具有一定的貢獻(xiàn)。因此，研究芽孢桿菌對(duì)大曲發(fā)酵力的貢獻(xiàn)將成為趨勢(shì)。

本研究采用平板透明圈初篩和固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩的方法，從傳統(tǒng)濃香型大曲的不同制曲階段篩選高發(fā)酵力的芽孢桿菌，為豐富大曲菌種資源庫(kù)和研制強(qiáng)化大曲奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

牛肉膏(生化試劑)，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠(chǎng)；蛋白胨(生化試劑)，北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任公司。氯化鈉(分析純)，成都市科龍化工試劑廠(chǎng)；瓊脂，福建石獅市瓊脂副食品加工廠(chǎng)閩南瓊膠有限公司；葡萄糖(分析純)，成都市科龍化工試劑廠(chǎng)。

1.1.2 濃香型大曲

分別取自瀘州老窖制曲生態(tài)園安曲0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、12 d、15 d、30 d、60 d、100 d的樣品。

1.1.3 培養(yǎng)基

平板篩選培養(yǎng)基[16]：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH7.4～7.6，121 ℃滅菌30 min。

擴(kuò)大種子培養(yǎng)液：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.4～7.6，121 ℃滅菌30 min。

TTC下層培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.4～7.6，121 ℃滅菌30 min。

TTC上層培養(yǎng)基：TTC 0.05 g，葡萄糖0.5 g，瓊脂1.5 g，加入100 mL水，在沸水中溶解。

小麥固體培養(yǎng)基[17]：經(jīng)適度粉碎的小麥粉20 g，蒸餾水20 mL，分裝于250 mL錐形瓶，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003分析天平，上海衡平儀器儀表廠(chǎng)；HHS恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市正基儀器有限公司；LS-50HJ立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Haier醫(yī)用低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司；DHG-140B智能型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上?，樮帉?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；糖度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌的篩選

無(wú)菌條件下取約20 g大曲樣品放入研缽中，待樣品充分分散后于無(wú)菌條件下稱(chēng)取10 g樣品放入裝有90 mL無(wú)菌水的滅菌三角瓶，置于搖床（37℃，200 r/min）振蕩30 min，于85℃水浴鍋中處理10 min，淘汰非芽孢桿菌[18-19]。然后梯度稀釋至10-6，選取10-4、10-5、10-6，3個(gè)稀釋梯度，各取0.5 mL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，將涂布的平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)，直到形成單菌落再接入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，然后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 具有發(fā)酵力的芽孢桿菌平板初篩

將斜面保藏的芽孢桿菌菌株活化后點(diǎn)接到TTC下層培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)好的平板，用TTC上層培養(yǎng)基覆蓋整個(gè)平板，待顯色后觀察菌株的顏色，記錄各菌株的顏色，通過(guò)顏色（紅色）深淺不同初步篩選出具有發(fā)酵力的芽孢桿菌，顏色越深，說(shuō)明發(fā)酵能力越強(qiáng)。

1.3.3 高發(fā)酵力芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩

無(wú)菌操作條件下，用移液槍將具有發(fā)酵力的芽孢桿菌種子培養(yǎng)液以10%(v/m)的接種量接種到固體培養(yǎng)基中，用棉塞封口，將接種好的培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5 d，發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)所接芽孢桿菌的發(fā)酵力指標(biāo)。同時(shí)做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 芽孢桿菌發(fā)酵力的測(cè)定[20]

首先，取適量高粱粉制成7°Be糖化液。然后，取50 mL糖化液于100 mL錐形瓶和發(fā)酵栓一起進(jìn)行滅菌。最后，等滅菌溫度降低到28℃時(shí)將0.5 g固體發(fā)酵產(chǎn)物加到錐形瓶中進(jìn)行發(fā)酵，放在分析天平上稱(chēng)取，讀數(shù)為M1（空白試驗(yàn)讀數(shù)為M3）。置發(fā)酵栓于30℃培養(yǎng)箱中，發(fā)酵72 h，取出發(fā)酵栓，輕輕搖動(dòng)，使二氧化碳逸出，稱(chēng)量后記下讀數(shù)M2（空白試驗(yàn)讀數(shù)為M4），利用計(jì)算公式計(jì)算發(fā)酵力的大小。

發(fā)酵力的計(jì)算公式：

X=（M1-M2）-(M3-M4)

式中：X——試樣的發(fā)酵力，單位為U；

M1——發(fā)酵前發(fā)酵栓與內(nèi)容物總質(zhì)量，單位為克（g）；

M2——發(fā)酵后發(fā)酵栓與內(nèi)容物總質(zhì)量，單位為克（g）；

M3——空白實(shí)驗(yàn)發(fā)酵前發(fā)酵栓與內(nèi)容物總質(zhì)量，單位為克（g）；

M4——空白實(shí)驗(yàn)發(fā)酵后發(fā)酵栓與內(nèi)容物總質(zhì)量，單位為克（g）。

1.3.5 芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

HS-SPME的操作方法：將固相微萃取裝置的萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化，溫度為250℃，時(shí)間為5 min。稱(chēng)取1 g發(fā)酵產(chǎn)物于15 mL裝樣瓶中，在60℃條件下平衡15 min。將固相微萃取萃取頭插入樣品瓶中，萃取30 min后，插入GC-MS進(jìn)樣口中檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性物質(zhì)。

GC-MS測(cè)定條件：最高溫度為230℃，程序升溫；進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣方式為手動(dòng)不分流，進(jìn)樣口溫度為230℃；質(zhì)譜電離源EI；采集方式為全掃描；溶劑延遲3 min；離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度為150℃；增益系數(shù)1。

1.3.6 芽孢桿菌的分子生物學(xué)（16S rDNA）鑒定

引物：27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，由上海生物工程公司合成，PCR反應(yīng)體系（30.2 μL）：Template 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，酶 0.2 μL,F 0.5 μL，R 0.5 μL，加雙蒸H2O 25 μL,PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃退火 45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，4℃保存。

基因測(cè)序由上海生物工程公司完成，采用DNAstar將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接和去除多余的堿基后，登錄NCBI進(jìn)行BLAST分析，采用MEGA6進(jìn)行發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，重復(fù)取樣1000次進(jìn)行bootstrap。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型大曲中具有發(fā)酵力芽孢桿菌的初篩結(jié)果

從取自瀘州老窖制曲生態(tài)園不同發(fā)酵階段的樣品，共篩選到43株芽孢桿菌，經(jīng)過(guò)TTC顯色初篩，共篩到11株芽孢桿菌顯色深，結(jié)果見(jiàn)表1。其中菌株X13、菌株X22顯色對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖1。

由表1可知，有11株芽孢桿菌顯色顏色為深紅色，可初步判定有11株芽孢桿菌發(fā)酵能力較強(qiáng)，有27株芽孢桿菌發(fā)酵能力相對(duì)弱，其余5株芽孢桿菌無(wú)發(fā)酵力。從圖1可以看出，編號(hào)為X13形成的菌落顯色顏色為深紅色，編號(hào)為X22形成的菌落顯色顏色為淺紅色。

傳統(tǒng)濃香型制曲工藝翻曲大概在10 d；本實(shí)驗(yàn)取樣在冬季，濃香型大曲翻曲在第12天。在這11株顯深紅色的菌株中，編號(hào)為X23菌株僅出現(xiàn)在制曲0～12 d時(shí)間段，編號(hào)為X11、X38、X40菌株僅出現(xiàn)在制曲15～100 d時(shí)間段，其余7株菌株在整個(gè)制曲時(shí)間段都存在。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，制曲0～100 d，每個(gè)時(shí)間段都有可能出現(xiàn)高發(fā)酵力的芽孢桿菌。通過(guò)平板顯色可以初步體現(xiàn)菌株發(fā)酵力的高低，發(fā)酵力大小還需要進(jìn)一步檢測(cè)。

表1 芽孢桿菌的TTC平板初篩結(jié)果

圖1 菌株X13、X22菌落TTC顯色結(jié)果圖

2.2 高發(fā)酵力芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩

選取初篩結(jié)果中顏色顯深紅色的菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可見(jiàn)，固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩所得菌株X13發(fā)酵力最高為0.49 g/0.5 g·72 h，達(dá)到了傳統(tǒng)大曲指標(biāo)[21]的優(yōu)良等級(jí)。因此，選取發(fā)酵力最高的菌株X13進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物的GS-MS和16S rDNA的鑒定實(shí)驗(yàn)。

表2 芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩檢測(cè)結(jié)果

2.3 菌株X13發(fā)酵產(chǎn)物的GS-MS分析結(jié)果

對(duì)菌株X13進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，用HS-SPME-GCMS方法對(duì)菌株X13發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，初步探尋芽孢桿菌和風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性?？瞻讓?shí)驗(yàn)揮發(fā)性化合物和菌株X13揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 空白實(shí)驗(yàn)揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖

圖3 菌株X13揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖

菌株X13的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物采用HS-SPMEGC-MS的方法，得到的揮發(fā)性化合物有23種，在愛(ài)化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比物質(zhì)標(biāo)號(hào)能查到的揮發(fā)性物質(zhì)有17種（見(jiàn)表3），包括吡嗪類(lèi)、酚類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)和酯類(lèi)等物質(zhì)；空白實(shí)驗(yàn)得到的揮發(fā)性化合物有6種，其中能在愛(ài)化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)查到的風(fēng)味物質(zhì)有3種；菌株X13揮發(fā)性化合物相對(duì)含量大于5%且在愛(ài)化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)可以查到的揮發(fā)性化合物在圖3均已標(biāo)注。菌株X13固態(tài)發(fā)酵和空白實(shí)驗(yàn)揮發(fā)性物質(zhì)相比較多了14種風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)含有大曲主要香味成分。吡嗪類(lèi)物質(zhì)一般都具有堅(jiān)果香味[22]，醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)均會(huì)產(chǎn)生一些令人愉快的氣味，有些醇類(lèi)和醛類(lèi)具有水果香味，這些風(fēng)味對(duì)濃香型大曲曲香的形成有一定的貢獻(xiàn)[23]。固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)到苯乙醇、愈創(chuàng)木酚為優(yōu)質(zhì)濃香型大曲的主要香味成分[24-25]。吡嗪類(lèi)物質(zhì)、愈創(chuàng)木酚、苯甲醛的形成與淀粉水解及蛋白質(zhì)水解作用相關(guān)。菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的揮發(fā)性物質(zhì)，經(jīng)過(guò)大曲多菌共酵以及窖池發(fā)酵的轉(zhuǎn)化過(guò)程，可能成為大曲和白酒風(fēng)味成分的前體或中間轉(zhuǎn)化物。因此，菌株X13與大曲的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生以及白酒風(fēng)味具有一定的內(nèi)在聯(lián)系。

表3 菌株X13揮發(fā)性化合物及空白實(shí)驗(yàn)相對(duì)含量

2.4 菌株X13的菌落形態(tài)及其16S rDNA的鑒定

2.4.1 菌株X13的菌落形態(tài)（圖4）

圖4 菌株X13菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)

從圖4可知，菌株X13在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后形成淡白色、不規(guī)則橢圓形、透明、濕潤(rùn)的菌落，菌落中間透明，邊緣相對(duì)于中間透明度降低，不產(chǎn)色素。同時(shí)，菌株X13在電鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞呈桿狀。

2.4.2 菌株X13的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株X13進(jìn)行DNA提取，PCR后跑凝膠電泳，其PCR凝膠電泳圖見(jiàn)圖5。菌株X13的16S rDNA基因序列進(jìn)行測(cè)定后，經(jīng)BLAST對(duì)比，采用MEGA6進(jìn)行發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，菌株X13的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，菌株X13的基因序列與Bacillus velezensis相似度較高，X13可鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖5 菌株X13 PCR凝膠電泳圖

3 結(jié)論

從濃香型大曲中分離出1株高發(fā)酵力細(xì)菌，其發(fā)酵力為0.49 g/0.5 g·72 h。經(jīng)過(guò)16S rDNA鑒定結(jié)果顯示，該菌株與Bacillus velezensis（貝萊斯芽孢桿菌）同源性最高，達(dá)100%，可鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。HS-SPME-GC-MS結(jié)果顯示，菌株X13發(fā)酵產(chǎn)物中含有大曲的主要風(fēng)味成分，如2,5-二甲基吡嗪、苯乙醇、愈創(chuàng)木酚等化合物。菌株X13不僅具有高的發(fā)酵力而且發(fā)酵產(chǎn)物含有濃香型大曲的主要風(fēng)味成分，可以確定X13為大曲的功能菌株。

圖6 菌株X13的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

本研究從濃香型制曲的不同時(shí)間點(diǎn)取樣，篩選出高發(fā)酵力功能的菌株，該菌株為白酒釀造豐富菌種資源庫(kù)。由于時(shí)間和實(shí)驗(yàn)條件原因，本研究?jī)H對(duì)主要功能特性和代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步探究，關(guān)于菌株的其他功能特性，其代謝產(chǎn)物和濃香型大曲風(fēng)味成分之間的相互關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

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