郭玲玲， 李鈞敏， 閆 明

(1.山西師范大學生命科學學院，山西臨汾 041004； 2.浙江省植物進化生態(tài)學與保護重點實驗室/臺州學院生態(tài)研究所，浙江臺州 318000)

溫度是植物生長和產(chǎn)量的一個重要限制因子[1]。隨著全球氣候變暖趨勢愈來愈明顯，高溫對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響日益引起人們的關(guān)注，由高溫造成的農(nóng)作物減產(chǎn)問題已經(jīng)在番茄、葡萄、草莓等作物上得到證實[2]。草莓作為一種經(jīng)濟價值較高的作物，其栽培過程忌高溫。有研究表明，高溫條件下草莓苗的膜透性增加，溶質(zhì)外滲，水分平衡失調(diào)，易造成植株萎蔫、葉綠素合成受阻、營養(yǎng)成分和產(chǎn)量下降，甚至植株死亡[3-4]。野生草莓在抗熱性上優(yōu)于草莓栽培種[5]，其抗性因品種不同而有所差異。黃毛草莓(FragarianilgerrensisSchltdl)和五葉草莓(FragariapentaphyllaLosinsk)是2種較為常見的野生草莓，有學者認為黃毛草莓較五葉草莓有更強的耐熱性[6]，但對耐熱性的差異原因鮮有報道。本試驗以二倍體野生黃毛草莓與五葉草莓為材料，研究黃毛草莓與五葉草莓的耐熱性，初步探究其耐熱性差異的原因，為黃毛草莓及五葉草莓的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃毛草莓于2012年7月采自西藏自治區(qū)林芝縣；五葉草莓于同年采自四川省茂縣，植株帶回實驗室于溫室中栽培，待其活棵成壯苗，分別選擇3株植株用于高溫半致死溫度測定。同時，取該3株植株上的匍匐莖苗定植于塑料盆中，人工氣候室栽培，培養(yǎng)條件為光照度400 μmol/(m2·s)、相對濕度75%、光周期14 h/10 h(白天/夜晚)、溫度20 ℃/15 ℃(白天/夜晚)。培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭土、蛭石、松樹皮、沙子以體積比 2 ∶1 ∶1 ∶2 的比例混合而成，植株栽培條件基本一致，每株施以 N ∶P ∶K=13% ∶13% ∶13%的好康多緩釋肥8 g/L，由匍匐莖形成的壯苗用于高溫脅迫試驗。

1.2 高溫半致死溫度的測定

參照張常隆等的方法[7]加以改進，選取黃毛草莓、五葉草莓位置相近的成熟葉片，每種草莓每株用打孔器打取9個圓片，每株各取1個圓片計3個圓片裝入1個帶刻度的具塞試管中，共9支試管；各加入6 mL去離子水，將其中8支試管分別置入35、40、45、50、55、60、65、70 ℃水浴中處理1 h，第9支試管直接置于室溫下1 h為對照；將9支試管抽真空 15 min，25 ℃保溫1 h；充分振蕩，25 ℃條件下測電導率R；將試管沸水浴15 min，取出，冷卻到25 ℃，充分振蕩，第2次測電導率K；以室溫處理的葉片測得的電導率C作為本底，計算相應溫度下的相對電導率，計算公式為

Y=(R-C)/(K-C)×100%。

用Logistic方程y=k/(1+ae-bx)擬合8個處理溫度與相對電導率的回歸模型，參照莫慧棟的方法[8]，計算出k、a、b及擬合參數(shù)r值，求出曲線出現(xiàn)拐點時的溫度，即高溫半致死溫度LT50=(lna)/b。

1.3 高溫脅迫試驗

1.3.1 試材處理 試驗于2015年8月在浙江省臺州學院試驗基地進行。40 ℃高溫脅迫試驗參照Lafta等的方法[9]經(jīng)改良進行，將由匍匐莖苗形成、長勢一致的植株移至人工氣候室，設置人工氣候室初始溫度為20 ℃/15 ℃(白天/夜晚)條件下開始升溫，升溫速度為白天4 ℃/d、夜晚3 ℃/d[10]，達到預期溫度40 ℃/32 ℃(白天/夜晚)后保持溫度恒定，同時，將移至人工氣候室溫度條件為20 ℃/15 ℃(白天/夜晚)正常栽植的草莓植株為對照；培養(yǎng)7 d將植株移出，測定各項指標。每處理6株，重復3次。人工氣候室條件一致，光照度為 400 μmol/(m2·s)、相對濕度為75%、光周期為14 h/10 h(白天/夜晚)。

1.3.2 測定項目和方法

1.3.2.1 光合指標 選取成熟葉片的中間小葉，用美國 LI-COR 產(chǎn)Li-6400X型便攜式光合測定系統(tǒng)測定凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)，測定條件設定為葉片溫度25 ℃、CO2濃度400 μmol/mol、飽和光照度1 000 μmol/(m2·s)；利用Regent Instrument Inc產(chǎn)的Win Folia葉面積分析儀掃描葉片以獲得有效光合作用面積。每植株測定3次，取平均值。

1.3.2.2 相對葉綠素含量 選取成熟葉片的中間小葉，用美國產(chǎn)CCM-200型手持式葉綠素儀測定相對葉綠素含量。

1.3.2.3 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(malomialdehyde，MDA)含量 選取成熟的新鮮葉片，分別用氮藍四唑光還原法、硫代巴比妥酸比色法測定SOD活性、MDA含量[11-12]。

1.3.2.4 葉片遠軸面表皮角質(zhì)層厚度 選取成熟的新鮮葉片，在葉片中部以垂直于主脈方向?qū)⑵錂M切制成臨時裝片，置于40×的中國產(chǎn)麥克奧迪BA410E型顯微鏡下觀察，選靠近主脈附近的表皮細胞角質(zhì)層用Motic advantages軟件顯微攝像，利用Image J軟件測定其厚度。

1.3.2.5 葉片蠟質(zhì)含量 選取成熟的新鮮葉片，用打孔器打孔獲取固定面積的圓片，用加熱法[13]提取蠟質(zhì)，具體操作方法為稱取質(zhì)量為m1的葉片，將其置于預熱至60 ℃的1.5 mL三氯甲烷提取液中30 s，立即取出，待三氯甲烷自然揮發(fā)，稱取葉片的質(zhì)量為m2，則單位面積的蠟質(zhì)含量=(m1-m2)/葉片表面積。

1.3.2.6 葉片氣孔相關(guān)指標 選取成熟的新鮮葉片，用打孔器打孔獲取固定面積的圓片，置于70%乙醇中保存；圓片復水，置于5 mL由10%鉻酸、10%硝酸銨按1 ∶1比例混合的氣孔解離液中黑暗處理48 h；用鑷子剝離葉片遠軸面的表皮置于水中，于1%番紅染液中染色2 h；倒出染液，制成臨時裝片，置10×BA410E顯微鏡下觀察，用Motic advantages軟件攝像，統(tǒng)計氣孔數(shù)量，同時采用Image J軟件進行顯微測量獲得氣孔長度與寬度，每張葉片取5個視野，取其平均值，計算氣孔密度、氣孔開度，計算公式為：

氣孔密度=5個視野下氣孔個數(shù)的平均值/視野實際面積；

氣孔開度=氣孔寬度/氣孔長度。

1.3.2.7 生物量 將草莓的地上部分、地下部分分別裝入牛皮紙袋中，105 ℃殺青30 min，烘箱中75 ℃烘3 d至恒質(zhì)量，分別稱取地上、地下部分的生物量，計算獲得根冠比。對用于其他指標測定的葉片，通過稱量其鮮樣質(zhì)量，再換算成干質(zhì)量后計入地上部分生物量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用Origin 8.5軟件進行作圖，采用獨立樣本t檢驗分析高溫處理對生理指標、葉片顯微結(jié)構(gòu)等的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃毛草莓和五葉草莓的高溫半致死溫度

由圖1可知，隨著溫度的升高，黃毛草莓、五葉草莓的相對電導率呈上升趨勢。由表1可見，黃毛草莓、五葉草莓2種草莓的Logistic方程擬合系數(shù)呈極顯著，高溫半致死溫度分別為51.43、50.70 ℃。

表1 黃毛草莓和五葉草莓相對電導率的Logistic方程參數(shù)及半致死溫度

注：擬合系數(shù)后**表示相對電導率與溫度回歸相關(guān)性極顯著。

2.2 高溫處理對黃毛草莓和五葉草莓光合生理的影響

由圖2可知，與室溫20 ℃/15 ℃(白天/夜晚)常規(guī)栽培相比，高溫處理的黃毛草莓和五葉草莓其凈光合速率分別極顯著下降56.7%、77.2%，氣孔導度分別極顯著上升80.7%、41.2%，胞間CO2濃度分別極顯著上升17.6%、19.5%(P<0.01)，黃毛草莓蒸騰速率顯著下降67.2%、五葉草莓蒸騰速率顯著上升53.4%(P<0.05)。

2.3 高溫處理對黃毛草莓和五葉草莓相對葉綠素含量的影響

由圖3可知，與對照相比，高溫處理的黃毛草莓和五葉草莓相對葉綠素含量下降，分別較對照極顯著降低56.7%、71.9%(P<0.01)，五葉草莓相對葉綠素含量降幅大于黃毛草莓，高溫處理與室溫處理的黃毛草莓相對葉綠素含量相應高于五葉草莓。

2.4 高溫處理對黃毛草莓和五葉草莓SOD活性、MDA含量的影響

由圖4可知，與對照相比，高溫處理的黃毛草莓SOD活性極顯著上升284.8%(P<0.01)，五葉草莓顯著上升 21.9%(P<0.05)，黃毛草莓SOD活性的上升幅度大于五葉草莓；高溫處理的黃毛草莓SOD活性高于五葉草莓；高溫處理的黃毛草莓和五葉草莓MDA含量分別上升14.8%、28.5%，五葉草莓的MDA含量增幅較大；高溫處理的五葉草莓MDA含量高于黃毛草莓。

2.5 高溫處理對草莓葉片氣孔密度及氣孔開度的影響

由圖5可知，與對照相比，高溫處理的黃毛草莓氣孔密度有極顯著下降(P<0.01)，氣孔開度變化不顯著；五葉草莓的氣孔密度和氣孔開度均有顯著上升(P<0.05)。

2.6 高溫處理對黃毛草莓和五葉草莓葉片蠟質(zhì)含量及角質(zhì)層厚度的影響

由圖6可知，與對照相比，高溫處理的黃毛草莓和五葉草莓蠟質(zhì)含量顯著下降14.6%、13.6%(P<0.05)，黃毛草莓的角質(zhì)層厚度極顯著增加37.7%(P<0.01)，五葉草莓的角質(zhì)層厚度略有下降，與對照差異不顯著。

2.7 高溫處理對黃毛草莓和五葉草莓總生物量、根冠比的影響

由圖7可知，與對照相比，高溫處理的黃毛草莓和五葉草莓總生物量有極顯著降低，分別下降37.1%、47.0%，高溫處理的黃毛草莓根冠比較對照極顯著下降41.2%、五葉草莓極顯著上升47.4%(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

測定不同高溫下植物葉片的電導率并擬合Logistic方程來評價植物的耐熱性是最常用的方法，通過擬合曲線獲得的半致死溫度高低可表示植物耐熱性的強弱，而半致死溫度與耐高溫能力往往呈正相關(guān)，夏瑩瑩等根據(jù)半致死溫度的高低確定了4個油茶品種的耐熱性順序[14]。本研究結(jié)果顯示，黃毛草莓的高溫半致死溫度為51.43 ℃，而五葉草莓為 50.70 ℃，表明黃毛草莓的耐熱性要高于五葉草莓，這與李洪雯等的觀點[6]一致。

高溫對植物生長的影響很大程度上歸結(jié)于光合作用的下調(diào)。試驗結(jié)果表明，高溫導致黃毛草莓和五葉草莓的凈光合速率分別較室溫處理極顯著下降56.7%、77.2%，這表明前者在高溫處理下凈光合速率的下降幅度要小于后者，這可能是黃毛草莓具有較高耐受性的一個原因。氣孔是植物體內(nèi)氣體交換的門戶及水氣蒸騰的通道，對光合作用產(chǎn)生明顯的影響，葉片氣孔開度下降會引起葉綠體內(nèi)CO2供應受阻[15-16]，從而導致葉片光合作用下降。氣孔大小和密度變化是快速適應短期惡劣環(huán)境的策略之一[17]，氣孔密度與蒸騰速率、氣孔擴散導度呈正相關(guān)[18]。本試驗結(jié)果表明，高溫處理前后黃毛草莓的氣孔開度沒有顯著變化，而五葉草莓有顯著上升；高溫處理的黃毛草莓和五葉草莓氣孔導度、胞間CO2濃度與凈光合速率變化相反，表明高溫處理下葉片光合作用的下降是由非氣孔因素引起的[16]；高溫處理的黃毛草莓氣孔密度急劇下降、五葉草莓有顯著上升。黃毛草莓通過降低氣孔密度來降低其蒸騰速率，以提高其對高溫處理的耐受性，這與水稻突變體對高溫的耐受策略[19]相似；五葉草莓通過增加氣孔密度、提高氣孔開度來增加其蒸騰速率，40 ℃高溫處理可能會對五葉草莓帶來較大損害，其通過增大氣孔來增加蒸騰作用、降低植物溫度，這也從側(cè)面反映黃毛草莓對40 ℃高溫的耐受性要高于五葉草莓。

植物處于高溫脅迫時，葉綠體的形成和含量會受到擾亂[20]。Feierabend等證實，在大麥、玉米等5個作物中，除玉米外其他4個作物在溫度超過28 ℃時葉綠素含量開始降低[20]。Mohanty等進一步分析原因認為，在脅迫條件下，葉綠素的快速降解是其含量降低的因素之一[21]；杜國棟等也認為，50 ℃高溫脅迫引起仁用杏葉綠素含量降低的原因是葉綠素的快速降解[16]。有研究進一步指出，耐熱性強的小麥在高溫下可保持較高的葉綠素含量[22]。五葉草莓經(jīng)高溫處理，其葉綠素含量下降幅度較黃毛草莓大，表明其葉綠素降解速率高于后者，這可能也是其耐熱性相對較差的原因之一。

改變生物量分配格局是植物適應逆境脅迫的一個重要策略，生物量分配的可塑性決定植物對異質(zhì)性資源的獲取能力，具有重要的生態(tài)學意義[23]。干旱脅迫下，早熟禾可將更多的生長分配到根系以促進根系的生長，增加根冠比[24]，而高溫對植物生長的抑制會體現(xiàn)在生物量的降低上[25]。本試驗結(jié)果表明，五葉草莓在高溫處理前后生物量下降幅度大于黃毛草莓，表明其對高溫處理的耐受性低于后者；40 ℃高溫處理的黃毛草莓將更多的生物量分配到地上部分以促進莖、葉的生長，而高溫處理帶來的土壤水分脅迫由于并不是很強，可通過促進地上部分的生長來彌補光合作用下降帶來的生物量損失；而五葉草莓將更多的生物量分配到地下部分以促進根的生長，高溫處理已顯著影響其土壤水分狀況，需要更多的根系以增強其從土壤中獲取更多水分的能力[26]，這從側(cè)面進一步說明黃毛草莓比五葉草莓具有更強的高溫耐受性。

高溫處理常會造成活性氧的積累，引起膜脂過氧化，導致丙二醛累積，從而破壞細胞膜。膜完整性的維持與植物體內(nèi)的保護性酶有關(guān)，而超氧化物歧化酶(SOD)是植物的一種重要保護酶，是清除體內(nèi)活性氧的第一道防線。Wahid等認為，膜完整性是植物耐熱性的主要機制之一[27]。孫震認為，丙二醛含量與抗熱性呈負相關(guān)[15]。本試驗結(jié)果表明，高溫處理的五葉草莓丙二醛含量增幅相對較大，表明其膜受到的破壞程度比黃毛草莓嚴重；黃毛草莓SOD活性增幅大于五葉草莓，表明黃毛草莓通過提高SOD活性來緩解膜脂過氧化的能力要高于五葉草莓，這也能一定程度上反映黃毛草莓的耐熱性為何高于五葉草莓。

角質(zhì)層包括蠟質(zhì)和角質(zhì)，是覆蓋于陸生植物表面、與外界環(huán)境接觸的重要保護性障礙物，在植物抵抗防止水分丟失、抵抗病菌入侵、抵抗紫外輻射和霜凍等各種生物、非生物脅迫中起著非常重要的作用[28]。40 ℃高溫處理的黃毛草莓角質(zhì)層厚度有顯著增加，而五葉草莓無明顯變化，表明高溫處理的黃毛草莓通過增加角質(zhì)層厚度來增強其抗逆性，這與王家訓等的研究結(jié)果[29]一致。有關(guān)高溫處理影響植物蠟質(zhì)的相關(guān)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，40 ℃高溫處理的黃毛草莓、五葉草莓蠟質(zhì)含量有顯著下降，兩者之間的降幅差異不顯著，表明黃毛草莓、五葉草莓葉片蠟質(zhì)對高溫的響應較為相似。周玲艷等研究發(fā)現(xiàn)，40 ℃高溫處理可造成水稻葉片角質(zhì)層蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變和蠟質(zhì)覆蓋減少，導致非氣孔性失水增加，這種響應可能既是一種保護，也是一種傷害[30]。

綜上所述，黃毛草莓的耐熱性要高于五葉草莓，40 ℃高溫處理對黃毛草莓的有害效應要低于五葉草莓。黃毛草莓與五葉草莓對高溫的響應策略有所不同，黃毛草莓可能通過增加角質(zhì)層厚度、降低氣孔密度和蒸騰速率來減少高溫所引起的水分丟失，通過將更多物質(zhì)分配到地上部分、提高超氧化物歧化酶活性來提高植株抗高溫脅迫的能力；而五葉草莓可能通過增加氣孔密度、提高氣孔開度、增加蒸騰速率來降低高溫對植株的傷害，并通過將更多的物質(zhì)分配到地下部分來增強植株對高溫脅迫的耐受能力。野生黃毛草莓具有的較高耐熱性及抗熱能力可用作我國草莓品種改良的特異種質(zhì)資源，對改善我國草莓品種遺傳背景簡單、抗逆、抗病性差等缺點具有重要的價值。

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