楊艷紅,尹華燕,高雨,趙金曉,馬信,王宏偉,李安飛,孔令讓,李憲彬

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黃淮麥區(qū)主要推廣小麥品種(系)DNA指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析

楊艷紅,尹華燕,高雨,趙金曉,馬信,王宏偉,李安飛,孔令讓,李憲彬*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山東 泰安 271018

小麥作為世界上重要的糧食作物，其豐富的遺傳變異對(duì)小麥的遺傳改良工作至關(guān)重要。本研究利用均勻分布在小麥A、B、D基因組上的84對(duì)SSR引物對(duì)119份黃淮麥區(qū)推廣小麥品種進(jìn)行了DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建，并進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，84對(duì)SSR引物共檢測(cè)到170個(gè)等位變異，每對(duì)引物檢測(cè)出1~5個(gè)等位變異，其中有13對(duì)引物可以將某一小麥與其他品種區(qū)分開(kāi)。根據(jù)SSR基因型聚類結(jié)果可將119份小麥品種 (系)分為5大類群，基本能夠分辨各個(gè)推廣品種間的親緣關(guān)系，為小麥親本選擇及雜交組配提供了一定的理論依據(jù)。

小麥; SSR引物; 指紋圖譜; 遺傳相似性

小麥?zhǔn)鞘澜缟现饕募Z食作物之一，在我國(guó)小麥約占糧食總產(chǎn)的27%，是我國(guó)第二大糧食作物。近年來(lái)，由于長(zhǎng)期品種間的雜交選育，現(xiàn)有育成品種間同質(zhì)性較高，種質(zhì)資源多樣性愈來(lái)愈狹窄，小麥遺傳改良難以實(shí)現(xiàn)突破性進(jìn)展[1-3]。前人已利用多種方法對(duì)小麥遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，其中分子標(biāo)記由于不受環(huán)境影響且遍布整個(gè)基因組，被普遍認(rèn)為是研究遺傳差異的理想工具。簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR(Simple Sequence Repeat)，也稱作微衛(wèi)星，是由1~6個(gè)堿基組成的基本序列串聯(lián)重復(fù)組成的短片段，具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好和等位基因多樣性高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成功應(yīng)用于小麥的遺傳差異和遺傳演化研究等諸多方面[4]。DNA指紋圖譜是指建立在DNA標(biāo)記基礎(chǔ)上的某一品種所具有的區(qū)別于其他品種的特異DNA片段，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建、功能基因標(biāo)記和比較作圖等方面具有公認(rèn)的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景[5]。本研究擬采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)均勻分布在小麥A、B、D基因組上的84對(duì)SSR引物對(duì)黃淮地區(qū)119份推廣小麥品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究分析，建立DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，從而掌握小麥品種資源的遺傳基礎(chǔ)和遺傳多樣性狀況，對(duì)于有效促進(jìn)小麥育種工作具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用均勻分布在小麥A、B、D基因組上的84對(duì)SSR標(biāo)記（表2）對(duì)119份近年來(lái)黃淮地區(qū)育成的小麥新品種(系)和其他一些地方品種(表1)進(jìn)行指紋構(gòu)建和遺傳多樣性分析。引物由上海生工生物工程有限公司(Shanghai Sangon Co.Ltd.上海)合成。試驗(yàn)材料種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地。

表1 小麥品種(系)名稱、編號(hào)及系譜信息

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取于小麥分蘗期取新鮮健康的葉片，按照CTAB法提取基因組DNA[6]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增選取均勻分布于小麥A、B、D基因組上的84對(duì)SSR引物對(duì)上述119份推廣小麥品種進(jìn)行PCR分析。PCR反應(yīng)體系為10 μL，含5 μL 2*Taq Plus Master Mix，20 ng-1μL前后引物各1 μL，20 ng-1μL基因組DNA1 μL，2 μL ddH2O[7]。PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55~65 ℃復(fù)性（因不同引物而異）40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.3 電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物PCR結(jié)束后在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量Loading Buffer，混勻后在8%聚丙烯酰胺非變性凝膠上電泳，上樣量為1.5 μL 1xTBE，120 V，電泳3~3.5 h（根據(jù)片段大小適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短電泳時(shí)間）。電泳結(jié)束后將膠塊銀染顯影，用凝膠成像系統(tǒng)照相，對(duì)帶型清晰的膠塊進(jìn)行讀帶。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，將同一引物擴(kuò)增出的大小相同的目的帶視為1個(gè)等位變異[8,9]，并進(jìn)行記錄。用同一引物對(duì)119份材料進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)，相同的帶型用同一數(shù)字進(jìn)行賦值，無(wú)帶賦值為“0”，數(shù)據(jù)采用Powermarker軟件進(jìn)行聚類，繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記在119個(gè)小麥品種之間多態(tài)性分析

84對(duì)引物在119個(gè)小麥品種中共檢測(cè)出170個(gè)等位變異，每對(duì)引物檢測(cè)出1~5個(gè)等位變異，平均為2.02個(gè)。其中，有13對(duì)引物（gwm124、gwm617、cfa2019、wmc173、wmc752、barc96、barc126、gwm294、barc35、gwm174、cfd22、gwm397、wmc474）可以將某一品種與其他品種( 系 )區(qū)分開(kāi)，如引物gwm124在“山農(nóng)29”中檢測(cè)到的等位變異與其他材料不同（圖1），因此可以將“山農(nóng)29”與其他品種(系)區(qū)分開(kāi)來(lái)；同理，引物gwm617可以將“92145E8”與其他品種(系)區(qū)分開(kāi)來(lái)；引物cfa2019可以將“良星66”與其他品種(系)區(qū)分開(kāi)；引物wmc173可以將“揚(yáng)麥158”與其他品種(系)區(qū)分開(kāi)；wmc752可以將“山農(nóng)15381”與其他品種(系)分開(kāi)。此外，利用同一個(gè)引物還可將2~3個(gè)品種從119份品種(系)中區(qū)分開(kāi)，如引物wmc623可以將“封麥6號(hào)”“鄭麥379”、“周麥27”與其他品種(系)區(qū)分開(kāi)；引物wmc617可以將“揚(yáng)麥158”、“石麥15”、“煙19”與其他品種(系)區(qū)分開(kāi)來(lái)；引物cfd9可以將“徐麥2178”、“邯優(yōu)3475’與其他材料區(qū)分開(kāi)來(lái)；引物gwm480可以將“泰山818”和“煙5158”與其他品種(系)區(qū)分開(kāi)來(lái)，引物gwm164可以將“太麥198”和“山農(nóng)紫麥1號(hào)’與其他品種(系)區(qū)分開(kāi)來(lái)；cfd48可以將“邯6172”“豫農(nóng)949”與其他品種(系)區(qū)分開(kāi)。其他引物單獨(dú)使用時(shí)不能鑒別出119份小麥品種(系)中的任何一個(gè)或幾個(gè)材料。

圖 1 標(biāo)記Xgwm124在部分小麥品種中的擴(kuò)增結(jié)果

M:D2000; 1：濰麥33；2:寧麥13；3:鎮(zhèn)麥168；4：揚(yáng)麥158；5：太麥198；6：山農(nóng)紫麥1號(hào)；7：山農(nóng)20；8：山農(nóng)23；9：山農(nóng)24；10：山農(nóng)25；11：山農(nóng)29；12：山農(nóng)30；13：山農(nóng)31；14：山農(nóng)32；15：山農(nóng)15381

M:D2000; 1:Weimai 33；2:Ningmai 13；3:Zhenmai 168；4:Yangmai 158；5:Taimai 198；6:Shannongzimai1hao；7:Shannong20；8:Shannong 23；9:Shannong 24；10:Shannong 25；11:Shannong 29；12:Shannong 30；13:Shannong 31；14:Shannong 32；15:Shannong 15381

2.2 119份小麥種質(zhì)材料的DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的初步構(gòu)建

由于本試驗(yàn)中單個(gè)引物僅能區(qū)分出少數(shù)品種，因此，為了準(zhǔn)確鑒別119份小麥品種(系)，選擇其中10對(duì)帶型清晰且穩(wěn)定的引物，將每一對(duì)引物擴(kuò)增的帶型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并編號(hào)，得到了119份小麥品種(系)的DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)（附表1）。84對(duì)SSR引物共鑒定出170個(gè)等位變異，所檢測(cè)到的不同等位變異及所處染色體位置等基本信息詳見(jiàn)表2。

表 2 84對(duì) SSR 引物在119份小麥品種中檢測(cè)到的等位基因

2.3 119份小麥種質(zhì)材料的遺傳多樣性分析

利用84對(duì)SSR引物所檢測(cè)出的170個(gè)等位變異，對(duì)其進(jìn)行聚類(圖2)后可以將119份品種(系)基本劃分為5個(gè)類群。

第一類群包括“鄭麥1325”、“山農(nóng)664”、“石03-Y119”三個(gè)品種；第二類群包括“新鄉(xiāng)9852”、“小偃54號(hào)”、“鄭麥306”3個(gè)品種；第三類群包括“德勝508”、“金麥73”、“臨麥8號(hào)”等18個(gè)品種；第四類群包括“周麥26”、“豫麥416”“山農(nóng)3509”、“矮抗58”等42個(gè)品種；第五類群包括“中育211”、“濟(jì)麥23”、“許科129”、“鄭麥379”等53個(gè)小麥品種。將上述SSR標(biāo)記聚類結(jié)果就所選材料的系譜關(guān)系(表1)進(jìn)行比較，聚類結(jié)果在一定程度上反映了品種之間的親緣關(guān)系，如“周麥27”和“許科316”均為“周麥16”作為母本選擇的品種，因此劃分到同一類群，但因?yàn)槠涓副痉謩e為“百農(nóng)64”和“矮抗58”，所以具體分類時(shí)，聚類到兩個(gè)小類群里；“山農(nóng)23”和“山農(nóng)24”均是從創(chuàng)建的Ta1(Ms2)小麥輪選群體中選擇出的小麥品種，二者在同屬一個(gè)大類的同時(shí)也單獨(dú)聚為一小類；同樣，“新麥35”、“新麥36”均由“周麥22”作為母本選育而成，聚類時(shí)聚到同一類群；“孟麥023”、“淮麥39（MS）”、“冠麥1號(hào)”均由周麥13作為母本選育出來(lái)，因此聚為同一類群里。但也有系譜親緣關(guān)系較近的品種與SSR聚類不一致的現(xiàn)象，如“菏麥0643”就是以“矮抗58”為母本、“濟(jì)麥19”為父本雜交選育的，但二者SSR基因型存在一定的差異，因此劃分為不同的兩個(gè)類群。出現(xiàn)這種現(xiàn)象一方面可能因?yàn)楸狙芯窟x用分子標(biāo)記較少，代表性不夠；另一方面可能與當(dāng)下小麥育種資源交流頻繁，導(dǎo)致品種的地域性差異程度降低[10]有關(guān)。

圖 2 119 份材料的SSR聚類分析

3 討論

由于長(zhǎng)期小麥品種間雜交選育，小麥品種遺傳多樣性的降低已成為世界范圍內(nèi)的共識(shí)[11-16]。在我國(guó)1586份小麥初選核心種質(zhì)中，以20世紀(jì)50年代的品種具有最高的遺傳多樣性，到90年代降至最低[17]，因此提高小麥種質(zhì)材料的遺傳多樣性對(duì)促進(jìn)遺傳改良工作至關(guān)重要。分子標(biāo)記被普遍認(rèn)為是研究遺傳差異的最理想工具，新發(fā)展起來(lái)的微衛(wèi)星SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好和等位基因多樣性高等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于小麥遺傳差異和遺傳演化研究等方面[18]。王立新[19]等采用15個(gè)SSR標(biāo)記和20個(gè)AFLP-SCAR標(biāo)記，分析了來(lái)自我國(guó)不同麥區(qū)的455個(gè)小麥品種，證明用分子標(biāo)記建立小麥DNA指紋可以更加全面地反映品種的遺傳多樣性。高睦槍等[20]用53對(duì) SSR引物對(duì)全國(guó)1999~2000年北方冬小麥及黃淮冬麥區(qū)觀察圃中選出的48個(gè)新品種(系)進(jìn)行了遺傳差異分析，共檢測(cè)到367個(gè)等位變異。本研究通過(guò)84對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)119份黃淮地區(qū)推廣小麥品種（系）進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到170個(gè)等位變異，遺傳變異較小，經(jīng)聚類分析后發(fā)現(xiàn)，119份材料主要聚為5個(gè)類群，這種結(jié)果一方面可能因?yàn)槲覀冞x用的分子標(biāo)記較少且部分標(biāo)記在種質(zhì)材料中多態(tài)性較低，另一方面可能也與選用材料大部分為主栽品種有關(guān)系。同時(shí)本研究結(jié)果也為育種工作者選擇親本組配雜交組合提供了一定的理論依據(jù)。

[1] 李興普.不同矮稈基因小麥農(nóng)藝性狀的遺傳差異[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),1995,10(1):1-5

[2] 相吉山,楊欣明,李秀全,等.小麥骨干親本南大2419對(duì)衍生品種(系)HMW-GS的貢獻(xiàn)分析[J].植物遺傳資源學(xué) 報(bào),2013,14(6):1053-1058

[3] 劉玉平,李亞軍,陳希勇,等.河北省審定優(yōu)質(zhì)麥主要性狀分析[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,10(2):50-53

[4] Lelley T, Stachel M, Grausgruber H,. Analysis of relationship between Aegilops tauschil and the D genome of wheat utilizing microsatellites[J]. Genome, 2000,43:661-668

[5] 張學(xué)勇,李大勇.小麥及其近親基因組中的DNA重復(fù)序列研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,33(5):14-24

[6] 樓巧君,陳亮,羅利軍.三種水稻基因組DNA快速提取方法的比較[J].分子植物育種,2005,3(5):749-752

[7] 梁宏偉,王長(zhǎng)忠,李忠,等.聚丙烯酰胺凝膠快速、高效印染方法的建立[J].技術(shù)與方法,2000,30(10):1379-1382

[8] 李根英, Susanne D, Marilyn LW,等.小麥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及SSR分子標(biāo)記試劑盒的研發(fā)[J].作物學(xué) 報(bào),2006,36(12):1771-1778

[9] Nei M, Li WH. Mathematical mode for studying genetic varia-tion in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Ameri-ca, 1979,76:5269-5273

[10] 程保山,徐海風(fēng),顧正中,等.淮安地區(qū)主栽小麥品種指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué) 報(bào),2011,23(1):20-24

[11] Fu YB, Peterson GW, Richards KW,. Allelic reduction and genetic shift in the Canadian hard red spring wheat germplasm re-leased from 1845 to 2004[J]. Theor Appl Genet, 2005,110:1505-1516

[12] Huang XQ, B?rner A, R?der MS,. Assessing genetic diversity of wheat(L.) germplasm using microsatellitemarkers[J]. Theor Appl Genet, 2002,105:699-707

[13] Orabi J, Jahoor A, Backes G. Changes in allelic frequency over time in European bread wheat(L. ) varieties re-vealed using DArT and SSR markers[J]. Euphytica, 2014,197(3):447-462

[14] Roussel V, Koenig J, Beckert M,. Molecular diversity in Frenchbread wheat accessions related to temporal trends and breeding pro-grammes[J]. Theor Appl Genet, 2004,108:920-930

[15] 謝煒,郭青云,郭小敏,等.同名地方品種小紅芒和小紅芒麥形態(tài)學(xué)和HMW-GS組成的演變分析[J].植物遺傳資源 學(xué)報(bào),2011,12(3):381-388

[16] 李遠(yuǎn),趙檀,王睿輝,等.河北省小麥品種基于SSR 標(biāo)記的遺傳多樣性研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,4(35):1-5

[17] Smale M, Reynolds MP, Warburton M,. Dimensions of diver-sity in modern spring bread wheat in developing countries from 1965[J]. Crop Sci, 2002,42:1766-1779

[18] 郝晨陽(yáng).五十年來(lái)我國(guó)小麥育成品種的遺傳多樣性演變及西北春麥區(qū)核心種質(zhì)的構(gòu)建[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2004

[19] 王立新,李云伏,常利芳,等.建立小麥品種DNA指紋的方法研究[J].作物學(xué)報(bào),2007,33(10):1738-1740

[20] 高睦槍,劉冬成,郭小麗,等.我國(guó)部分冬小麥新品種(系)SSR標(biāo)記遺傳差異的研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué) 報(bào),2001,9(1):49-54

附表1 10對(duì)SSR引物構(gòu)建的 119個(gè)小麥品種(系)的SSR指紋圖譜

Attached list 1 Data of the SSR fingerprint bands with 10 pairs of SSR primer among 119 wheat cultivars

編號(hào)No.名稱Varieties引物名稱及條帶編號(hào) Primers and band numbergwm294wmc317wmc622gwm369gwm617cfa2019wmc623cfd48wmc752cfd7 1中麥1751114112111 2許科1292114112112 3冠麥1號(hào)1114131111 4中育11234114211111 5周麥305114211111 6封麥6號(hào)3114233111 7洛麥291113231111 8鄭麥3791114113112 9鄭麥08561124111111 10鄭麥76981111111121 11山農(nóng)146281533111212 12山農(nóng)35091312241212 13濟(jì)麥221424141212 14山農(nóng)221424112212 15山農(nóng)26581121111222 16鄭麥13421114111321 17鄭麥3691121142221 18良星661111122121 19山農(nóng)281121141112 20鄭麥18601111232111 21徐農(nóng)0291112211211 22徐農(nóng)21781412132111 23存麥181112132111 24國(guó)麥1271114111111 25柱麥3051314212121 26孟麥0231314132111 27中原181111131111 28濮興1114132112 29偃展11101341112122 30中麥661112112121 31良星5181124112222 32盈滿2081124142212 33淮麥39（MS）1414111211 34河北4158*4453112131 35菏麥20*1521142132 36菏麥0643*1124142212 37中育12111411212111 38中育14281314131111 39新麥351114112121 40新麥361111112121 41百農(nóng)4161112232111 42周麥361111212111 43豫麥1581114131111 44鄭品麥241112131111 45濟(jì)麥231124142111 46濟(jì)麥441114242111 4792145E83121432111 48豫農(nóng)2111111131111 49魯原5021114312102 50Classic2144132101 51德盛5084531112101 52濟(jì)麥191141312101 53濟(jì)寧13號(hào)2111231101 54金麥6號(hào)4111112101 55金麥731132131101 56科信8號(hào)1112112101 57萊農(nóng)03011421212202 58聊17091151312101 59聊98313414311102 60聊麥16號(hào)1143111101 61臨麥7號(hào)1424341102 62臨麥8號(hào)1423332102 63魯麥211124212101 64魯麥222211211101 65山農(nóng)6641112212102 66石03-Y1194541111111 67素農(nóng)24133422131111 68泰山8181121111131 69濰麥8號(hào)1141342132 70汶農(nóng)141124142112 71汶農(nóng)151124131112 72西農(nóng)5號(hào)1552132112 73西農(nóng)9791111111131 74小偃54號(hào)1454131111 75小偃6號(hào)3114211132 76新鄉(xiāng)98523113112112 77徐州40431121131112 78煙1801121211111 79煙193421131111 80煙51581111111111 81煙農(nóng)1811411311111 82矮抗581112132111 83邯61721124131311 84鄭麥3063121131111 85周麥221111111131 8602H171141131131 87鄭麥8831111212131 88鄭麥13251214231312 89國(guó)麥3011414211211 90豫農(nóng)9492111142131 91良星991421131212 92安農(nóng)11241114211131 93衡觀352131111131 94邯優(yōu)34753114111132 95滄麥193122112132 96中麥1551124242112 97登海50481104131131 98豫農(nóng)8021102232131 99宿12642101231111 100許科3164201211131 101豫麥4161104111111 102周麥261304132111 103周麥27（粉）1102113111 104石麥151102311131 105濰麥333104112231 106寧麥131403112212 107鎮(zhèn)麥1681401112312 108揚(yáng)麥1581101111112 109太麥1983102112111 110山農(nóng)紫麥1號(hào)1103112111 111山農(nóng)201414111111 112山農(nóng)231414111112 113山農(nóng)241114112112 114山農(nóng)251114112111 115山農(nóng)291413141112 116山農(nóng)303114111112 117山農(nóng)313414111111 118山農(nóng)321414141111 119山農(nóng)153813412111131

Establishment of DNA Fingerprinting and Genetic Diversity Analysis of Main Wheat Cultivars in Huanghuai Region

YANG Yang-hong, YIN Hua-yan, GAO Yu, ZHAO JIN-xiao, MA Xin, WANG Hong-wei, LI An-fei, KONG Ling-rang, LI Xian-bin*

271018,

Wheat is an important food crop in the world, its rich genetic variation is crucial to wheat improvement. Eighty-four SSR primers distributed on A, B, Dgenome were used to build DNA fingerprinting database and genetic diversity analysis in 119 samples of main wheat cultivars in Huanghuai region. The study showed that 170 variations were detected by using the 84 pairs of SSR primers, and each pair of primers exhibited 1-5 alleles in 119 wheat cultivars in Huanghuai region. Out of the 84 pairs of SSR primers, 13 pairs of primers can detect one of wheat cultivars different from the other varieties respectively. According to SSR gene clustering dendrogram, 119 wheat varieties could be divided into 5 groups to some extent, which could provide some theoretical information for wheat improvement in the future.

Wheat; SSR primers; fingerprinting; genetic diversity

S512.1

A

1000-2324(2018)03-0371-08

2017-12-1

2017-12-18

山東省自主創(chuàng)新重大關(guān)鍵技術(shù)(2014GJJS0201-3-1);山東省農(nóng)業(yè)良種工程

楊艷紅(1993-),女,碩士研究生,主要從事小麥種質(zhì)資源創(chuàng)新工作. E-mail:yyh19930106@163.com

Author for correspondence. E-mail:lqlwlxb@163.com