林艷寧,陶寧萍,盧瑛,趙勇*,許長(zhǎng)華*

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基于二維相關(guān)紅外光譜強(qiáng)酸性電解水對(duì)三種食源性致病菌的滅菌機(jī)制

林艷寧1,2,3,陶寧萍1,2,3,盧瑛1,2,3,趙勇1,2,3*,許長(zhǎng)華1,2,3*

1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院, 上海 201306 2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心, 上海 201306 3. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306

本研究旨在利用二維相關(guān)紅外光譜結(jié)合紅外光譜差減法探究強(qiáng)酸性電解水（Acidic electrolyzed water，AEW）殺滅食源性致病菌的分子作用機(jī)制。經(jīng)AEW處理后的三種常見(jiàn)食源性致病菌（副溶血性弧菌、沙門(mén)氏桿菌、單增李斯特菌），以其和電解水接觸時(shí)間為微擾條件，分析其和電解水接觸過(guò)程中光譜動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，獲取電解水處理對(duì)其相應(yīng)化學(xué)基團(tuán)的干擾信息。結(jié)果顯示，AEW使致病菌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使折疊含量逐漸增高，轉(zhuǎn)角含量逐漸降低。本研究為以后利用光譜技術(shù)揭示電解水滅菌分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

強(qiáng)酸性電解水; 食源性致病菌; 二維相關(guān)紅外光譜; 滅菌機(jī)制

近年來(lái)由食源性致病菌引起的食品安全問(wèn)題已經(jīng)成為全世界所面臨的一個(gè)巨大威脅和挑戰(zhàn)。存在于水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏桿菌等致病菌是引起世界包括中國(guó)在內(nèi)的食源性疾病的主要致病菌[1,2]。為了給消費(fèi)者生產(chǎn)高質(zhì)量、微生物安全的食物，很多滅菌方法被應(yīng)用于食品工業(yè)的器械、原材料中來(lái)保持商業(yè)無(wú)菌。在眾多滅菌方法中，以低pH(2~3)、高氧化還原電位(900~1200 mV)、高活性氧(10~160 mg/L)為特征的AEW[3]正好滿足了食品工業(yè)中的滅菌需求。AEW對(duì)食品中不同的致病菌都具有良好的滅菌效果，具有廣譜滅菌，操作簡(jiǎn)便，環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。目前，AEW已被廣泛地應(yīng)用于研究和生產(chǎn)當(dāng)中。然而，有關(guān)于AEW的滅菌機(jī)制仍然未被完整揭示。揭示AEW的滅菌機(jī)制對(duì)于將其更好的應(yīng)用到食品工業(yè)，甚至是其它工業(yè)的滅菌中具有重要作用。

研究證明，影響AEW殺菌能力的因素有很多：AEW中過(guò)低的pH環(huán)境嚴(yán)重?cái)_亂細(xì)菌表面的兩性物質(zhì)，增加細(xì)胞膜滲透性，并且妨礙新陳代謝過(guò)程[4]；過(guò)高的氧化還原電位改變細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)電子流，影響細(xì)胞內(nèi)能量代謝和ATP合成[4,5]；AEW中含有活性氧的成分能引起細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白質(zhì)折疊，從而影響細(xì)胞對(duì)電解水的耐受性[6]。然而，很少有研究從揭示AEW和細(xì)菌作用時(shí)細(xì)菌大分子物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)變化的角度來(lái)闡述AEW滅菌機(jī)制。這些結(jié)構(gòu)變化對(duì)于揭示AEW滅菌機(jī)制起著至關(guān)重要的作用。二維相關(guān)紅外光譜分析方法，通過(guò)對(duì)光譜變化分析，可得到分子內(nèi)官能團(tuán)間相互作用和分子間相互作用信息。差譜方法利用混合樣品光譜減去基準(zhǔn)物質(zhì)光譜，可得到目標(biāo)物質(zhì)光譜，降低了光譜中由其它物質(zhì)帶入的干擾[7]。

本研究利用二維相關(guān)紅外光譜結(jié)合紅外光譜差減方法，從生物大分子結(jié)構(gòu)改變的角度揭示AEW對(duì)食源性致病菌的滅菌機(jī)制，為AEW滅菌機(jī)制研究開(kāi)辟一種新思路。

1 材料方法

1.1 致病菌樣品制備

實(shí)驗(yàn)所用三種食源性致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，副溶血性弧菌(ATCC17802)，單增李斯特菌(ATCC19115)，沙門(mén)氏桿菌(CMCC50041)。標(biāo)準(zhǔn)菌株用25%的甘油保存管保存于-80 °C冰箱備用。用TSB培養(yǎng)基(TSB，北京市陸橋科技有限公司，中國(guó))在37 °C下培養(yǎng)致病菌18~20 h，使菌株活化后，按1%接菌量將100 μL致病菌接種到10 mL TSB液體培養(yǎng)基中，在37 °C下培養(yǎng)10 h，使致病菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期。在3000 g，25 °C條件下用離心機(jī)(Centrifuge 5417R，Eppendorf，德國(guó))離心10 min，將液體培養(yǎng)基中的菌體富集。富集到的菌體沉淀分別用超純水清洗3次，留下菌體沉淀備用。

1.2 電解水制備

參照之前的研究制備AEW[8]。AEW在電解水生成裝置(FW-200，AMANO，日本)中生成，利用電解池的陽(yáng)極電解0.15%的氯化鈉溶液15 min產(chǎn)生AEW。制備出的AEW的pH和氧化還原電位(ORP)用pH/ORP測(cè)量?jī)x(Mettler-Toledo, Zurich,瑞士)進(jìn)行測(cè)量。有效氯濃度(ACC)通過(guò)比色法，用數(shù)字氯檢測(cè)試劑盒(RC-2Z,笠原化工儀器有限公司，日本)來(lái)測(cè)定。所有操作做三組平行。最終制備的AEW pH值為2.15，ORP為1171.9，ACC為0.0074%。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備以及實(shí)驗(yàn)條件

紅外光譜儀為美國(guó)Thermo Scientific Nicolet公司生產(chǎn)的iS5光譜儀，采用DTGS檢測(cè)器。掃描次數(shù)為16次，分辨率為4 cm-1，掃描范圍為4000~400 cm-1。H2O和CO2的干擾在掃描中被扣除。用電解水與細(xì)菌混合后的樣品光譜減去純電解水的光譜，以3400 cm-1[9]為參照峰，差減因子為0.9932，獲取細(xì)菌樣品和電解水接觸后的動(dòng)態(tài)光譜。采用Perkin-Elmer公司spectrum v3 02操作軟件獲取樣品二階導(dǎo)數(shù)圖譜。

二維相關(guān)紅外光譜（2DCOS-IR）的獲取：將上述處理好的AEW加入ATR(Attenuated Total Reflection)附件中，先采集AEW的紅外光譜，隨后再分別采集三種食源性致病菌的紅外光譜記錄為0 s時(shí)的光譜。將三種食源性致病菌沉淀與電解水混合，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔30 s采集一次紅外光譜，直到3.5 min后停止采集。二維紅外相關(guān)光譜通過(guò)二維紅外光譜分析軟件(Nicolet iN10 SpectraCorr)分析獲得。

2 結(jié)果和討論

2.1 AEW處理過(guò)程中三種致病菌的紅外光譜分析

三種食源性致病菌(單增李斯特菌，沙門(mén)氏桿菌，副溶血性弧菌)的紅外光譜差譜如圖1所示，其特征峰總結(jié)列于表1[10-13]。

1800~1100 cm-1包含了紅外光譜的特征區(qū)域和指紋區(qū)域，可以用來(lái)鑒別檢測(cè)AEW殺滅食源性致病菌過(guò)程中化學(xué)分子發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化。由圖1可知，隨著與AEW接觸時(shí)間增加，三株菌在1800~1100 cm-1范圍內(nèi)表現(xiàn)出差異。特別是以1237 cm-1做歸一化后，三株菌在特征峰1085 cm-1(Cellular proteins)、1398 cm-1(s(CH3))、1455 cm-1(s(C-O-H))處信號(hào)強(qiáng)度在從0~210 s過(guò)程中逐漸降低。這反映出，致病菌在AEW處理過(guò)程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生改變，細(xì)胞壁脂類(lèi)結(jié)構(gòu)也逐漸發(fā)生變化。

圖 1 三種食源性致病菌經(jīng)AEW處理3.5 min之內(nèi)的傅里葉紅外光譜

(A）丹增李斯特菌；(B）沙門(mén)氏桿菌；(C）副溶血性弧菌

表1 三種食源性致病菌紅外譜特征譜帶指認(rèn)

2.2 AEW處理過(guò)程中三種致病菌的紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)分析

紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)圖譜可以分開(kāi)原始圖譜中重疊的吸收峰和寬峰，增加光譜分辨率，放大原始圖譜中的細(xì)微差別[14,15]。如圖2所示，隨著食源性致病菌和AEW接觸時(shí)間增加，蛋白質(zhì)中β折疊的特征峰（1694 cm-1）[13]吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。β轉(zhuǎn)角的特征峰（1687 cm-1）[13]信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低。副溶血性弧菌和沙門(mén)氏桿菌蛋白質(zhì)中苯基C-C振動(dòng)（1589 cm-1）[16]逐漸降低，單增李斯特菌中逐漸升高。這證明在電解水和食源性致病菌相接觸過(guò)程中，電解水使細(xì)菌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖 2 三種食源性致病菌經(jīng)AEW處理3.5 min之內(nèi)的紅外光譜（1700~1550 cm-1）二階導(dǎo)數(shù)圖譜

(A）丹增李斯特菌；(B）沙門(mén)氏桿菌；(C）副溶血性弧菌

對(duì)AEW處理0~210 s對(duì)應(yīng)致病菌的酰胺I帶（1600~1700 cm-1）光譜進(jìn)行曲線擬合分析，獲取在此過(guò)程中，致病菌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化量[13]。丹增李斯特菌與AEW接觸時(shí)間從0 s到210 s這一過(guò)程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的曲線擬合結(jié)果如圖3所示。隨著和AEW接觸時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)折疊的含量從45.79%逐漸增加到54.33%，轉(zhuǎn)角的含量從16.51%逐漸減小到12.1%(表2)。沙門(mén)氏桿菌與副溶血性弧菌也呈現(xiàn)出同樣的變化規(guī)律，這證明，在致病菌和AEW接觸過(guò)程中AEW逐漸破壞致病菌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的折疊和轉(zhuǎn)角。

圖 3 單增李斯特菌經(jīng)AEW處理3.5 min之內(nèi)酰胺I帶（1700~1600 cm-1）處的紅外光譜曲線擬合圖

(a) 0 s，(b) 30 s，(c) 60 s，(d) 90 s，(e) 120 s，(f) 150 s，(g) 180 s，(h) 210 s

表 2 單增李斯特菌經(jīng)AEW處理3.5 min之內(nèi)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

2.3 AEW處理過(guò)程中三種致病菌的二維相關(guān)紅外光譜分析

圖 4 三種食源性致病菌經(jīng)AEW處理3.5 min之內(nèi)在1400~1600 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜

Fig.4 Two-dimensional correlation infrared spectroscopy of three food-borne pathogenic bacteria with AEW treatment within 3.5 min in the region of 1400~1600 cm-1

(A）丹增李斯特菌；(B）沙門(mén)氏桿菌；(C）副溶血性弧菌

使用二維相關(guān)紅外光譜可以觀察到食源性致病菌對(duì)AEW擾動(dòng)的響應(yīng)，獲得比普通紅外光譜更多的信息，增強(qiáng)譜圖分辨率。由圖3中可見(jiàn)，在從0~210 s的逐漸增時(shí)過(guò)程中，三種致病菌在1600~1400 cm-1內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜在1560 cm-1（ring base）、1636 cm-1（sheet）[10]處有強(qiáng)自動(dòng)峰，在1419 cm-1（Vs(COO-)）、1406 cm-1（as(CH3)）[11]處有比較弱的自動(dòng)峰(圖3 A)。在1489 cm-1（V（CH））、1480 cm-1（AmideⅡ）、1472 cm-1（CH2）[13]處有強(qiáng)自動(dòng)峰，1456 cm-1（δas(CH3)）、1435 cm-1（δ（CH2））、1418 cm-1（Vs(COO-)）[11]處有弱的自動(dòng)峰（圖3 B）。在1571 cm-1（AmideⅡ）、1550 cm-1（AmideⅡ）、1540 cm-1（AmideⅡ）[13]處有強(qiáng)的自動(dòng)峰，在1565 cm-1（ring base）[13](圖3 C)處有弱的自動(dòng)峰。在和AEW接觸的過(guò)程中蛋白質(zhì)受到的擾動(dòng)最大，尤其是苯基的響應(yīng)最大，這證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到的破壞最顯著。除此之外，脂類(lèi)亞甲基，多糖類(lèi)等也出現(xiàn)相應(yīng)的自動(dòng)峰，即致病菌中的脂類(lèi)和多糖類(lèi)也遭到破壞。

3 結(jié)論

隨著三種食源性致病菌與AEW接觸時(shí)間增加，利用紅外光譜差譜結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜方法，可以檢測(cè)到致病菌從存活到死亡過(guò)程中對(duì)應(yīng)的光譜變化。從原始圖譜到二階導(dǎo)數(shù)圖譜，再到二維相關(guān)紅外光譜，樣品圖譜的分辨率逐級(jí)提高。原始圖譜與二階導(dǎo)數(shù)圖譜均得出致病菌在和電解水作用過(guò)程中其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即β折疊含量逐漸增高，轉(zhuǎn)角含量逐漸降低。二維相關(guān)紅外光譜證明，其蛋白質(zhì)的苯基等官能團(tuán)對(duì)電解水的響應(yīng)最大，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)受到電解水的擾動(dòng)最大，其次脂類(lèi)，多糖類(lèi)也出現(xiàn)響應(yīng)，即AEW還破壞脂類(lèi)和多糖類(lèi)。本研究初步證明紅外光譜差譜結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜方法可以用于研究電解水滅菌機(jī)制，同時(shí)這種方法有望以后用于研究生物體與外界環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化作用機(jī)制中。

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Sterilization Mechanism of AEW on Three Kinds of Food Borne Pathogenic Bacteria by Using Two Dimensional Infrared Correlation Spectroscopy

LIN Yan-ning1,2,3, TAO Ning-ping1,2,3, LU Ying1,2,3,ZHAO Yong1,2,3*, XU Chang-hua1,2,3*

1.201306,2.201306,3.201306,

The purpose of this study was to explore the molecular mechanism of killing foodborne pathogenic bacteria (AEW) in strongly acidic electrolytic water (Acidic electrolyzed water) by two dimensional correlation infrared spectroscopy (IR) and infrared spectral subtraction (IR). Three common foodborne pathogenic bacteria (and) treated with AEW were used as perturbation conditions to analyze the dynamic changes of spectrum during contact with electrolytic water. The interference information of electrolytic water treatment on the corresponding chemical groups was obtained. The results shown that AEW changed the secondary structure of protein, increased the content of β -fold and decreased the content of β -corner. This study laid a foundation for revealing the molecular mechanism of electrolytic water sterilization by spectral technique.

Acidic electrolyzed water (AEW); food-borne pathogenic bacteria; two dimensional correlation infrared spectroscopy; sterilization mechanism

Q93-334

A

1000-2324(2018)03-0424-05

2016-11-07

2016-12-22

中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金(31401571); 上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(滬農(nóng)科攻字(2016)第4-4號(hào)); 上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)部分地方院校能力建設(shè)項(xiàng)目(15320502100); “十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2015BAD17B01,2015BAD17B02)

林艷寧(1990),女,碩士研究生,主要從事紅外光譜拉曼光譜檢測(cè)研究. E-mail:yanninglinlin@163.com

Author for correspondence.E-mail:yzhao@shou.edu.cn; chxu@shou.edu.cn