梁 娜,桑亞新,周 妍,劉衛(wèi)華,李田葉,王向紅

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

姜,盛產(chǎn)于亞洲,特別是中國南部和印度地區(qū)[1]。干姜為姜科植物姜(ZingiberofficinaleRosc.)的干燥根莖,其加工過程包括凈制、切制和炮制,以四川犍為產(chǎn)品最佳[2]。藥理研究表明干姜具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗?jié)儭㈡?zhèn)痛、利膽等作用[3-4]。干姜主要的功能因子為姜辣素,它是有刺鼻氣味的一種弱極性的酚類混合物,包括姜酚、姜烯酚、姜酮等,是黃色油狀液體,味辣而苦,是姜特征性風(fēng)味的主要呈味物質(zhì)[5-7]。研究表明,無論是體外還是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)姜辣素都體現(xiàn)了抗癌、抗氧化等藥理活性[8],具有良好的應(yīng)用前景和社會(huì)效益[9-11]。

當(dāng)前,很多學(xué)者在研究姜辣素或姜中有效成分的檢測方法[12-16],現(xiàn)報(bào)道的姜辣素檢測方式一般為高效液相色譜法(HPLC)、反相高效液相色譜(RP-HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)。王維皓等人[15]利用HPLC方法僅測定了生姜中6-姜辣素含量,由于姜辣素是一類酚類混合物,所以對其他姜辣素類化合物物質(zhì)的分析還有待研究。張永鑫等人[14]建立了姜及其炮制品中姜辣素類化合物含量的測定方法(HPLC),但此方法未能成功檢測到含量相對較低的姜酮,在以后的研究中還需提高其檢測靈敏度。雖然GC-MS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于姜的分析且可分析出低含量的物質(zhì)[17-18],但由于姜辣素的低揮發(fā)性,樣品處理方面較為復(fù)雜且可能會(huì)出現(xiàn)分析不全

面的問題。然而,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)可以很好地解決上述所有問題。李峰武[19]用HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS的方法靈敏、簡便快速的分析延胡索水提物中的化學(xué)成分,駱宜等人[20]同樣利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)高效、準(zhǔn)確的鑒定了決明子中的化學(xué)成分。由此可見,液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)分析技術(shù)是一種簡便、快速的分析方法,在食品分析、環(huán)境分析和醫(yī)藥研究等許多領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用[21-23]。本實(shí)驗(yàn)不僅僅局限于姜辣素化合物單一成分的測定,還將對姜辣素類化合物的組成進(jìn)行分析,并采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)對姜辣素類化合物進(jìn)行分離。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干姜,生姜 保定安國中藥材批發(fā)市場;乙腈 色譜純,天津科密歐試劑有限公司;6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚 色譜純,上海源葉生物科技有限公司。

液相色譜-離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀 日本島津公司;Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;QTSX6150超聲波清洗器 天津市瑞普電子儀器公司;TGL16M離心機(jī) 長沙易達(dá)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 姜辣素的制備 將購買的同一批次的干姜粉碎后過60目篩,篩分于干燥器中保存?zhèn)溆谩＞芊Q取制備好的粉末約1.0 g,加入40 mL甲醇,超聲處理30 min,重復(fù)超聲一次,取上清液4500 r/min離心10 min,將離心后的上清液,移入梨形瓶中,將殘?jiān)貜?fù)離心操作一次,合并離心液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,加入1 mL甲醇復(fù)溶,過有機(jī)微孔濾膜(0.45 μm)[15],待用。

1.2.2 LC-MS法分離鑒定姜辣素類化合物

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱:Syncronis C18(5 μm×250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相:乙腈(A相)和0.1%甲酸水(B相),流動(dòng)相梯度見表1;流速:0.3 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量:2 μL;采樣時(shí)間:15 min。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 采用全離子掃描模式方式,電噴霧離子源(ESI),離子源溫度:200 ℃;霧化氣體流速:1.5 L/min;脫溶溫度:200 ℃;掃描范圍:100～1000 m/z;掃描時(shí)間:15 min。

1.2.2.3 樣品測定 按“1.2.2.1”條件下對樣品進(jìn)行姜辣素類物質(zhì)的定性分析,并利用相同的提取檢測方法對同一產(chǎn)地的生姜姜辣素也進(jìn)行了對比分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Office軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品測定

本文用液相色譜確定了干姜姜辣素中5種物質(zhì)的基本含量,同時(shí)與生姜的姜辣素進(jìn)行了對比分析,結(jié)果見表2?？煽闯龈山慕彼睾棵黠@的高于生姜,證明干姜的加工方式會(huì)增加其有效成分的含量,提高其利用價(jià)值。

表2 干姜姜辣素液相測定結(jié)果(n=6)Table 2 The content of gingerols in dried ginger(n=6)

2.2 干姜中姜辣素類化合物L(fēng)C-MS分析

與水組合時(shí)乙腈的分離效果和洗脫效果都較好;選用流動(dòng)相為乙腈和0.1%甲酸水進(jìn)行梯度洗脫得到了如圖1、圖2所示的液相結(jié)果圖。由圖可知,在此液相條件下,各化合物分離度高、峰型較好、信號(hào)較強(qiáng),可以實(shí)現(xiàn)干姜總提取物的良好分離。

圖1 姜辣素標(biāo)準(zhǔn)品液相圖Fig.1 Liquid phase diagram of gingerol standard

圖2 干姜樣品液相圖Fig.2 Liquid phase diagram of dried ginger sample

本實(shí)驗(yàn)采用了LC-MS的分析方法對干姜姜辣素類化合物進(jìn)行了質(zhì)譜分析,其總離子流圖如圖3所示。同時(shí),把5種姜辣素類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品做了液質(zhì)分析,總離子流圖如圖4所示,用于對比分析樣品中姜辣素類化合物的成分。對干姜姜辣素樣品進(jìn)行正、負(fù)離子模式分析,發(fā)現(xiàn)姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚在負(fù)離子模式下具有較好的質(zhì)譜響應(yīng),而6-姜烯酚在正離子模式下具有較高的質(zhì)譜響應(yīng)。所以,以負(fù)離子模式為主要結(jié)果分析姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚,而6-姜烯酚則以正離子模式為主要依據(jù)進(jìn)行分析鑒定。而后,分析5個(gè)譜峰的準(zhǔn)分子離子峰(圖5)和二級質(zhì)譜碎片離子峰的精確質(zhì)量信息,再結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖以及一、二級質(zhì)譜圖和相關(guān)參考相關(guān)文獻(xiàn)對干姜中的5種化合物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定,結(jié)果見表3。

圖3 干姜樣品總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of dried ginger sample

圖4 姜辣素標(biāo)準(zhǔn)品總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of gingerol standard

圖5 干姜樣品質(zhì)譜圖姜酮(1)、6-姜酚(2)、 8-姜酚(3)、6-姜烯酚(4)、10-姜酚(5)Fig.5 Mass spectrum of dried ginger samples Zingerone(1),6-gingerol(2),8-gingerol(3)，6-shogaol(4),10-gingerol(5)

表3 干姜姜辣素的HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析Table 3 Analysis of gingerols in dried ginger with HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS

圖3在保留時(shí)間6.567 min附近有峰1,在m/z 193.0933產(chǎn)生[M-H]-峰即姜酮的特征離子峰(圖5-(1)),m/z 137.0570表示的是姜辣素類化合物的主要化學(xué)成分及4′-羥基-3′-甲氧基苯官能團(tuán)[11,18]。初步判定該物質(zhì)為姜辣素類化合物中的一種,且分子量為194.2271。查閱CAS號(hào)可知姜酮(CAS:122-48-5)的分子量為194.23,理論值與液質(zhì)測定值相差1.5×10-5,結(jié)果可信準(zhǔn)確。由此可以得知經(jīng)甲醇提取的干姜姜辣素類化合物中含有少量的姜酮,因其含量很少所以液相并沒有檢出,表明相對于液相色譜的檢測方法,液質(zhì)聯(lián)用的方法靈敏度和分離度更高。

圖3在保留時(shí)間8.240 min處出現(xiàn)分子離子峰2,在m/z 293.1770產(chǎn)生[M-H]-峰(圖5-(2)),同樣在二級質(zhì)譜碎片離子峰中也出現(xiàn)了姜辣素類化合物的基本峰m/z 137.0488,分析可知其分子質(zhì)量為294.1736,又因其出現(xiàn)了6-姜酚的特征離子峰m/z 293.1770可推測該物質(zhì)為6-姜酚,分子式為C17H26O4。查閱Spectral Database for Organic Compounds(SDBS)和參考文獻(xiàn)[24]可知6-姜酚的分子質(zhì)量為294.4,運(yùn)用本方法的實(shí)際測定值與理論值相差7.7×10-4。

圖3在保留時(shí)間9.233 min處出現(xiàn)分子離子峰3,在m/z 321.2064出現(xiàn)8-姜酚特征離子峰(圖5-(3)),二級質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)有姜辣素類化合物的基本峰m/z 137.0489,判斷其分子量為322.2073,推測該物質(zhì)為8-姜酚,分子式C19H30O4。查閱SDBS可知8-姜酚的分子質(zhì)量為322.4,運(yùn)用本方法的實(shí)際測定值與理論值相差6.0×10-4。

圖3在保留時(shí)間9.620 min處出現(xiàn)分子離子峰4,在m/z 277.1842產(chǎn)生[M+H]+峰即6-姜烯酚的特征離子峰(圖5-(4)),二級質(zhì)譜中存在姜辣素類化合物的基本峰m/z 137.0489,由此判斷該物質(zhì)為6-姜烯酚,其分子量為276.1793,分子式C17H24O3。

圖3在保留時(shí)間10.246 min處出現(xiàn)分子離子峰5,在m/z 349.2398產(chǎn)生[M-H]-峰(圖5-(5)),二級質(zhì)譜中有姜辣素類化合物的基本峰m/z 137.0489,根據(jù)特征離子峰判斷該物質(zhì)為10-姜酚,其分子量為350.2378,分子式C21H34O4。查閱SDBS可知10-姜酚的分子質(zhì)量為350.5,實(shí)際測定值與理論值相差7.5×10-4。

綜上,LC-MS的檢測方法可以檢測出含量較少的姜酮,證明其靈敏度精確度要高于單獨(dú)的HPLC檢測。本文所述的HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS檢測方法精確度較高。并且,對比王麗等人[11]、芮雯等人[25]所用到的方法,本文的檢測方法用時(shí)較少,更高效,可以更廣泛地運(yùn)用到其他姜制品的姜辣素檢測中。

2.3 方法的線性關(guān)系及最低檢出限

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,以色譜純甲醇分別稀釋成濃度為1、5、10、12.5、25、50、100、125、200 μg/mL的溶液,在上述液相條件下進(jìn)樣10 μL測定。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),峰面積積分為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性分析。

姜辣素線性關(guān)系及最低檢出限結(jié)果見表4,在0～200 μg/mL范圍內(nèi)五種姜辣素類物質(zhì)得到的線性方程中R2均達(dá)到0.9992以上,表明線性關(guān)系良好。分析五種姜辣素類物質(zhì)的最低檢出限值,分析可知儀器狀態(tài)良好,色譜方法有效可信。

表4 姜辣素線性關(guān)系及最低檢出限結(jié)果(n=6)Table 4 Gingerol linear relationship and the limit of detection(n=6)

2.4 回收率與精密度

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液125 μg/mL、連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣10 μL,記錄其保留時(shí)間和峰面積,計(jì)算姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值來評判此方法的精密度。取同一樣品溶液,按“1.2.1”方法制備供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h以10 μL進(jìn)樣測定,考察其是否穩(wěn)定并分析保留時(shí)間和峰面積,計(jì)算姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值評測方法的穩(wěn)定性。稱取已知含量的同一姜樣品5份,每份約1 g,準(zhǔn)確計(jì)算樣品中姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的含量并分別加入相應(yīng)含量的姜辣素單標(biāo)對照品,按“1.2.1”方法制備供試品溶液,進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析,計(jì)算其加標(biāo)回收率。

如表5,由精密度實(shí)驗(yàn)可知:通過5種代表性姜辣素類物質(zhì)的連續(xù)6次進(jìn)樣分析,發(fā)現(xiàn)其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值較小,表明該法測定姜辣素類物質(zhì)精密度良好,從而能進(jìn)一步證明了本研究方法的可行性。

表5 精密度、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 5 The results of precision and stability and sample recovery rate test(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了一種液相色譜-電噴霧-離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜的方法,成功分析了干姜姜辣素類化合物中的5種主要成分,分別是姜酮、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、10-姜酚。此方法在11 min內(nèi)快速準(zhǔn)確地分離出了5種主要的姜辣素類化合物,前處理過程簡單且所需樣品量少,5種姜辣素標(biāo)樣在設(shè)定濃度范圍內(nèi)均線性良好(R2≥0.9992),加標(biāo)回收率均在95.48%～99.46%之間,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和儀器精密度較好。

相對比HPLC的檢測方法,LC-MS的方法檢測出了含量較低的姜酮,同時(shí)也準(zhǔn)確的檢測到了其他四種姜酚化合物,體現(xiàn)了較高的分離度和靈敏度?？梢詫⒋朔椒ㄟ\(yùn)用到更多的姜及姜類炮制品中姜辣素類化合物的檢測中。

[1]Semwal RB,Semwal DK,Viljoen AM,et al. Gingerols and shogaols:Important nutraceutical principles from ginger[J]. Phytochemistry,2015:117:554-568.

[2]周靜,楊衛(wèi)平. 干姜的臨床應(yīng)用及藥理研究進(jìn)展[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志,2011(2):70-72.

[3]于華蕓,吳智春,季旭明,等. 干姜溫中功效的分子機(jī)制[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2012(1):184-186.

[4]Nilesh Pawar,Sandeep Pai,Mansingraj Nimbalkar,et al. RP-HPLC analysis of phenolic antioxidant compound 6-gingerol from different ginger cultivars[J]. Food Chemistry,2011,126(3):1330-1336.

[5]項(xiàng)敏,郭嘉,劉競博,等. 姜辣素提取與分離純化工藝的研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)與生物工程,2015(5):7-10,13.

[6]趙晉. 生姜姜辣素的提取及其功能性質(zhì)研究[D].重慶:西南大學(xué),2008.

[7]Farzad Shidfar,Asadollah Rajab,Tayebeh Rahideh,et al. The effect of ginger(Zingiberofficinale)on glycemic markers in patients with type 2 diabetes[J]. Journal of Complementary and Integrative Medicine,2015,12(2).

[8]Hong-bo Mi,Xin Guo,Jian-rong Li. Effect of 6-gingerol as natural antioxidant on the lipid oxidation in red drum fillets during refrigerated storage[J]. LWT-Food Science and Technology,2016,74:70-76.

[9]蔣蘇貞,宓穗卿,王寧生. 姜辣素的化學(xué)成分研究概述[J].中藥新藥與臨床藥理,2006(5):386-389.

[10]Sushila Bhattarai,Van Hoan Tran,Colin Charles Duke. The

stability of gingerol and shogaol in aqueous solutions[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences,2001,90(10):1158-1664.

[11]王麗,方磊,趙恒強(qiáng),等. 高效液相色譜-電噴霧四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析生姜中的姜辣素類化合物[J]. 中國中藥雜志,2011(24):3467-3471.

[12]S Yudthavorasit,K Wongravee,N Leepipatpiboon. Leepipatpiboon characteristic fingerprint based on gingerol derivative analysis for discrimination of ginger(Zingiberofficinale)according to geographical origin using HPLC-DAD combined with chemometrics[J]. Food Chemistry,2014:158:101-111.

[13]周記磊,韋紅言,梁冰麗,等. HPLC法測定生姜配方顆粒中6-姜辣素的含量[J]. 中藥與臨床,2013(5):6-7,19.

[14]張永鑫,李俊松,陳麗華,等. 高效液相色譜法同時(shí)測定姜及其不同炮制品中5種姜辣素的含量[J]. 中國藥學(xué)雜志,2012(6):471-474.

[15]王維皓,王智民,徐麗珍,等. HPLC法測定生姜中有效成分6-姜辣素的含量[J]. 中國中藥雜志,2002(5):31-32.

[16]陳艷,周冬翠,張梅. 三種方法提取生姜有效部位群并測定6-姜辣素含量[J]. 中國藥師,2014(7):1099-1102.

[17]梅樹蓮,鄭秋霞,鄒綱明. 姜精油的GC-MS分析[J]. 吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào),2005(1):11-12,35.

[18]戰(zhàn)琨友,王超,徐坤,等. 氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析姜油樹脂中的揮發(fā)性及非揮發(fā)性成分[J]. 色譜,2008(6):692-696.

[19]李峰武. 高效液相色譜-電噴霧-四級桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法分析延胡索水提物中的化學(xué)成分[J]. 西北藥學(xué)雜志,2017,32(1):13-17.

[20]駱宜,張樂,王衛(wèi)華,等. 高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定決明子化學(xué)成分[J]. 藥物分析雜志,2015(8):1408-1416.

[21]Jiang H,Sólyom A M,Timmermann B N,et al. Characterization of gingerol-related compounds in ginger rhizome(ZingiberofficinaleRosc.)by high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry,2005，19(20)：2957-2964.

[22]陳曉雨,李銀峰,林秀云,等. LC-MS技術(shù)在化學(xué)藥雜質(zhì)分析中的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床,2014(6):696-700.

[23]姜艷彬,單吉浩,王瑩,等. LC-MS/MS技術(shù)在藥物代謝研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 藥物分析雜志,2014(3):385-391.

[24]薛文靜,張燕,楊龍華,等. UPLC-MS/MS測定姜辣素中的6-姜酚[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2010(9):2178,2181.

[25]芮雯,馮毅凡,吳妍,等. 干姜油中姜酚類成分的UPLC/Q-TOFMS分析[J]. 中草藥,2008(5):667-668.

全國中文核心期刊 輕工行業(yè)優(yōu)秀期刊