尚小紅 嚴(yán)華兵 曹升 張尚文 謝向譽(yù) 王艷 歐昆鵬

摘要：【目的】?jī)?yōu)化葛根SCoT-PCR反應(yīng)體系，篩選適用于葛根的SCoT引物，為利用SCoT分子標(biāo)記進(jìn)行葛根種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支持?！痉椒ā坎捎谜辉O(shè)計(jì)對(duì)SCoT-PCR反應(yīng)體系中的DNA模板量、dNTPs濃度、Mg²⁺濃度、Taq DNA聚合酶量和引物濃度5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，利用最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系篩選出適用于葛根的SCoT引物，并對(duì)該體系進(jìn)行驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】最佳葛根SCOT-PCR反應(yīng)體系20.00 μL：DNA模板50.00 ng，dNTPs 0.25 mmol/L，Mg²⁺1.50 mmol/L，引物0.80μmol/L，Taq DNA聚合酶0.50U。利用該體系從36條SCoT引物中篩選出35條可從葛根中擴(kuò)增出清晰條帶的引物。使用3條引物對(duì)18個(gè)葛根材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物表現(xiàn)出良好的重復(fù)性、穩(wěn)定性和豐富的多態(tài)性?！窘Y(jié)論】建立的最佳葛根SCOT-PCR反應(yīng)體系和篩選獲得的35條SCoT引物可適用于葛根種質(zhì)資種鑒定、遺傳多樣性分析、相關(guān)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等研究。

關(guān)鍵詞：葛根；SCOOPCR；反應(yīng)體系優(yōu)化；引物篩選

0引言

【研究意義】葛根（Pueraria Dc.）是豆科多年生藤本植物，是我國(guó)衛(wèi)生部首批批準(zhǔn)的藥食同源兩用植物（楊旭東等，2014）。近年來(lái)，隨著人們對(duì)藥食同源食物需求量的日益增漲，葛根種質(zhì)資源收集和鑒定、遺傳多樣性分析等相關(guān)研究已成熱點(diǎn)，主要通過(guò)測(cè)定田間性狀等形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行鑒定分析（羅亞紅等，2015；郝建平等，2016；譚燕群等，2016），但易受環(huán)境、主觀判斷等因素的影響。采用分子標(biāo)記技術(shù)可有效、準(zhǔn)確地進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定分析，其中，目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記（SCoT）是結(jié)合了RAPD標(biāo)記和ISSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、通用性強(qiáng)、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)（Collard and Mackill，2009；熊發(fā)前等，2009）。由于不同作物的最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系和適用引物不同，因此，優(yōu)化葛根SCoT-PCR反應(yīng)體系，篩選適用的引物，對(duì)葛根種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析及相關(guān)SCoT標(biāo)記開(kāi)發(fā)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，分子標(biāo)記技術(shù)在葛根上的研究應(yīng)用較少，陳元生和彭建宗（2010）利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了葛根的ISSR反應(yīng)體系，其他研究者則利用RAPD、ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)葛根進(jìn)行遺傳多樣性分析（景戌等，2010；陳大霞等，2011；周精華等，2013；郭艷艷等，2013；魏文愷，2015；袁燦等，2017）。自SCoT標(biāo)記被開(kāi)發(fā)以來(lái)，先后對(duì)葡萄（張君玉等，2011）、枇杷（韓國(guó)輝等，2011a）、牡丹（侯小改等，2011）、柑橘（韓國(guó)輝等，2011b）、草莓（秦國(guó)新等，2012）、鐵皮石斛（趙瑞強(qiáng)等，2012）、大豆（李強(qiáng)等，2013）、芥菜（龍治堅(jiān)等，2013）、藍(lán)莓（韓國(guó)輝等，2014）、荔枝（夏玲等，2014）、藥用菊花（何仁峰等，2014）、辣椒（李寧等，2015）、梨（和世玉等，2016）、木薯（嚴(yán)華兵等，2016）、籽用西瓜（楊靜等，2016）、南瓜（王豐豐等，2017）等作物的SCoT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，將其應(yīng)用于作物的遺傳多樣性分析（陳大霞等，2012，2017；徐旭棟等，2013；楊輝等，2017）、目的基因差異表達(dá)（吳建明等，2010；陳明輝等，2013；賀梁瓊等，2014）等研究，結(jié)果表明，不同作物的最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系和適用的引物數(shù)量均不同，且SCoT分子標(biāo)記具有豐富多態(tài)性，在遺傳多樣性分析、相關(guān)基因表達(dá)分析等相關(guān)研究上均表現(xiàn)出良好的適用性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，尚未見(jiàn)有關(guān)SCoT分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于葛根的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L₁₆（4⁵）對(duì)SCoT-PCR反應(yīng)體系的DNA模板量、Mg²⁺濃度、dNTPs濃度、TaqDNA聚合酶量和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定葛根的最優(yōu)SCoT-PCR反應(yīng)體系，并利用其對(duì)SCoT引物進(jìn)行篩選，以期獲得適用于葛根的SCoT引物，為后期利用SCoT分子標(biāo)記進(jìn)行葛根種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種等提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試的19份葛根材料來(lái)自不同產(chǎn)地，具體見(jiàn)表1，種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建科學(xué)研究基地和生物技術(shù)研究所育種基地。其中，19號(hào)材料（廣西柳州鹿寨野生葛根）用于SCoT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及引物篩選，其他18份材料用于反應(yīng)體系驗(yàn)證。DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、Ex Taq DNA聚合酶、瓊脂糖、50xTAE Buffer等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總DNA提取采集健康葛根植株的無(wú)病蟲(chóng)害幼嫩葉片，參照DNA提取試劑盒說(shuō)明提取其總DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度及完整性，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度。將提取的DNA濃度稀釋至50 ng/gL，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物合成參照Collard和Mackill（2009）的36條SCoT引物序列（表2），編號(hào)分別為SCl～SC36，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以預(yù)擴(kuò)增效果較好的引物SC27作為初選引物、19號(hào)葛根總DNA為模板，進(jìn)行葛根SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化。SCoT-PCR反應(yīng)體系20.00 μL，其中DNA模板量、Mg²⁺濃度、dNTPs濃度、引物濃度和Taq DNA聚合酶量5個(gè)因素分別設(shè)4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)L₁₆（4⁵）（表3），共16個(gè)組合，每個(gè)組合3次重復(fù)，用ddH₂0補(bǔ)足至20.00μL。

1.2.4 PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃30 s，50℃1 min，72℃90 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。取6.00 μL PCR產(chǎn)物與1.00 μL 6xLoading Buffer混勻后，用含有GelRed核酸染色劑的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，緩沖液為1xTAE，電壓110 v。電泳結(jié)束后，以紫外凝膠成像系統(tǒng)成像后拍照保存。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析參照何正文等（1998）的直觀分析法，根據(jù)電泳圖譜中的電泳條帶清晰度、數(shù)量、亮度及背景干凈程度分別對(duì)16個(gè)組合進(jìn)行打分，其中，最優(yōu)組合（條帶最多，亮度強(qiáng)，背景清晰，無(wú)拖帶雜帶）得16分，最差結(jié)合（條帶少、亮度弱、雜帶多）得1分。利用Excel 2013計(jì)算平均分和極差。

1.2.6引物篩選以19號(hào)葛根的總DNA為模板，SCl-SC36為引物，利用優(yōu)化獲得的最佳葛根SCOT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，從中篩選出適用于葛根的SCoT引物。

1.2.7反應(yīng)體系驗(yàn)證隨機(jī)選取SC4、SC24和SC28引物對(duì)1～18號(hào)葛根材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證最佳葛根SCoT-PCR反應(yīng)體系的可行性和穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1SCoT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

由圖1可知，不同組合擴(kuò)增結(jié)果在條帶數(shù)量、清晰度和亮度方面均存在明顯差異。利用直觀分析法分別對(duì)16個(gè)組合的3次重復(fù)電泳圖進(jìn)行打分，取平均值（表4）。R反映各因素對(duì)SCoT-PCR反應(yīng)體系的影響程度，即R越大，該因素對(duì)SCoT-PCR反應(yīng)體系的影響越大；而K越大，表明該水平擴(kuò)增效果越好（桂騰琴等，2009；嚴(yán)華兵等，2016），因此，5個(gè)因素對(duì)SCOT-PCR反應(yīng)體系的影響程度排序?yàn)椋篢aq DNA聚合酶量>DNA模板量>引物濃度>dNTPs濃度>Mg²⁺濃度，結(jié)合K確定最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系20.00μL：DNA模板50.00 ng，Mg²⁺1.50 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，引物0.80μmol/L，Taq DNA聚合酶0.50U。

2.2引物篩選結(jié)果

由圖2可知，除SC25外，其他35條SCoT引物均能擴(kuò)增出清晰可辨的條帶。其中，SC12、SC31和SC33僅擴(kuò)增出1條清晰可辨的條帶，其原因可能是在19號(hào)葛根DNA模板中結(jié)合的位點(diǎn)較少，其他32條引物的PCR產(chǎn)物條帶清晰、數(shù)量多，且背景干凈。

2.3最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系驗(yàn)證結(jié)果

利用直觀打分法能快速判斷最佳的葛根SCOT-PCR反應(yīng)體系，但易受主觀因素影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性（何仁峰等，2014），因此，需對(duì)建立的最佳反應(yīng)體系進(jìn)行客觀檢測(cè)與驗(yàn)證。本研究隨機(jī)選取SC4、SC24和SC28為引物，對(duì)1～18號(hào)葛根材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，各引物從各材料中均能擴(kuò)增出清晰、多態(tài)性豐富的條帶（圖3、圖4和圖5），表明建立的最佳反應(yīng)體系具有穩(wěn)定性和可靠性，可應(yīng)用于葛根種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析和分子標(biāo)記輔助育種等研究。

3討論

不同作物SCoT-PCR反應(yīng)體系的主要影響因素不同。如柑橘（韓國(guó)輝等，2011b）、葡萄（張君玉等，2011）、枇杷（韓國(guó)輝等，2011a）、大豆（李強(qiáng)等，2013）、藍(lán)莓（韓國(guó)輝等，2014）、荔枝（夏玲等，2014）、梨（和世玉等，2016）和木薯（嚴(yán)華兵等，2016）等作物均以dNTPs濃度為最主要影響因素，南瓜（王豐豐等，2017）和辣椒（李寧等，2015）以引物濃度為最主要的影響因素，籽用西瓜（楊靜等，2015）、草莓（秦國(guó)新等，2012）、芥菜（龍治堅(jiān)等，2013）和牡丹（侯小改等，2011）以Mg²⁺濃度的影響最大，藥用菊花（何仁峰等，2014）和鐵皮石斛（趙瑞強(qiáng)等，2012）以Taq DNA聚合酶量為最主要影響因素。本研究發(fā)現(xiàn)，Taq DNA聚合酶量是葛根SCoT-PCR反應(yīng)體系的最主要影響因素，而Mg²⁺濃度對(duì)其影響最小?？梢?jiàn)，不同作物因其基因組序列不同，導(dǎo)致SCoT-PCR反應(yīng)體系的各因子影響力不同，也可能是不同研究在正交設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的各因子濃度具有較大差異所造成。

不同作物適用的SCoT引物及其數(shù)量也不同?？舍槍?duì)特定作物，通過(guò)引物篩選，選出適用的SCoT引物。侯小改等（2011）從36條SCoT引物中篩選出24條適用于牡丹的引物；李寧等（2015）從80條引物中篩選出24條適用于辣椒的引物；楊靜等（2015）從41條SCoT引物中篩選出22條適用于西瓜的引物；嚴(yán)華兵等（2016）從36條SCoT引物中篩選出19條適用于木薯的引物；王豐豐等（2017）從51條SCoT引物中篩選出適用于南瓜的20條引物。本研究從36條SCoT引物中篩選出35條適用于葛根的引物清晰條帶，與上述前人研究結(jié)果存在差異的原因可能是不同作物的基因組序列不同，導(dǎo)致SCoT引物在不同作物中具有不同的結(jié)合位點(diǎn)，從而產(chǎn)生不同的擴(kuò)增效果。

本研究用于最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系驗(yàn)證的18個(gè)葛根材料中，3、4與18號(hào)材料來(lái)自廣東，其余15份材料來(lái)自于廣西，隨機(jī)選取SC4、SC24和SC28對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，來(lái)自于同一?。▍^(qū)）的葛根材料存在不同的帶型，而來(lái)自于不同省（區(qū)）的葛根材料又存在相同的帶型，表明葛根材料的遺傳背景豐富，但不同區(qū)域的材料可能存在引種現(xiàn)象，需進(jìn)一步利用本研究建立的最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系及篩選的適用于葛根SCoT引物進(jìn)行遺傳多樣性分析。

4結(jié)論

建立的最佳葛根SCoT-PCR反應(yīng)體系和篩選獲得的35條SCoT引物可適用于葛根種質(zhì)資種鑒定、遺傳多樣性分析、相關(guān)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等研究。