柯斌榕 盧政輝 吳小平 陳發(fā)川 蘭清秀

摘要：【目的】比較秀珍菇退化菌株與正常菌株的生物學(xué)特征并進(jìn)行雙鏈RNA（dsRNA）病毒檢測，為秀珍菇栽培過程中選擇優(yōu)質(zhì)菌種提供參考依據(jù)?！痉椒ā块_展秀珍菇退化菌株菌絲拮抗、菌絲生長速度及出菇試驗(yàn)，與正常菌株進(jìn)行生物學(xué)特征比較，通過ITS擴(kuò)增，利用RAPD、ISSR和SRAP分子標(biāo)記分別進(jìn)行差異性比較，并開展dsRNA病毒檢測，分析秀珍菇菌株的退化原因。【結(jié)果】秀珍菇退化菌株X9和X13與正常菌株X5、X6及對照菌株X15間存在拮抗反應(yīng)，當(dāng)培養(yǎng)基的pH低于5.0時(shí)，退化菌株的菌絲生長速度顯著降低（P<0.05，下同）。退化菌株X13菌絲的生長速度（4.95mm/d）、常溫出菇單袋產(chǎn)量（73.34 g/袋）及低溫刺激出菇單袋產(chǎn)量（107.69g/袋）均顯著低于正常菌株和對照菌株。分子標(biāo)記分析未發(fā)現(xiàn)供試菌株間存在遺傳差異，dsRNA病毒檢測發(fā)現(xiàn)供試菌株均存在dsRNA片段，其中退化菌株x13存在特異的dsRNA片段?！窘Y(jié)論】秀珍菇退化菌株可能受dsRNA病毒感染，適應(yīng)環(huán)境能力變?nèi)?，產(chǎn)量降低，生產(chǎn)上應(yīng)注意菌株來源，避免使用退化菌株。

關(guān)鍵詞：秀珍菇；栽培；退化菌株；dsRNA病毒檢測

0引言

【研究意義】秀珍菇學(xué)名肺形側(cè)耳（Pleurotuspulmonarius），隸屬于真菌門擔(dān)子菌綱傘菌目側(cè)耳菌科側(cè)耳屬，最早由我國臺(tái)灣地區(qū)引進(jìn)，目前已在福建、浙江及上海等地廣泛栽培（林原等，2015），其子實(shí)體形態(tài)纖小優(yōu)美，質(zhì)地細(xì)膩，鮮美可口，且出菇期在夏季，有利于緩解市場鮮菇緊缺狀況。我國主栽的秀珍菇品種親緣關(guān)系十分接近，經(jīng)多年組織擴(kuò)繁后易出現(xiàn)菌種退化和老化現(xiàn)象，制約其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展（盧政輝，2008）。雙鏈RNA（dsRNA）病毒在食用菌中廣泛存在，有研究表明雙孢蘑菇法國病與9個(gè)dsRNA片段有關(guān)（Morten and Hicks，1992）。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)退化的秀珍菇菌株中存在與正常菌株不同的dsRNA片段，但目前有關(guān)dsRNA病毒致使秀珍菇菌株退化的具體機(jī)理尚不清楚。因此，開展秀珍菇退化菌株生物學(xué)特征研究及dsRNA病毒檢測，對選擇秀珍菇生產(chǎn)用種具有重要指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】菌種退化現(xiàn)象在食用菌栽培中普遍存在，如蛹蟲草栽培中菌種退化問題是困擾其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵（林清泉等，2010），雙孢蘑菇菌種退化導(dǎo)致基質(zhì)降解能力下降，影響其栽培質(zhì)量（陳美元等2011）。引起菌種退化的原因較多，如病毒感染（Magae and Hayashi，1999）、長期轉(zhuǎn)管傳代引起堿基錯(cuò)配及交配型因子變異或保藏環(huán)境不適宜導(dǎo)致突變等（丁湖廣，2006；李丹青和王杰，2015）。Krzysz-tof（2010）研究表明，雙孢蘑菇褐色病變及減產(chǎn)與蘑菇病毒x等有關(guān)。此外，Qiu等（2010）報(bào)道從退化的平菇天達(dá)300中提取到4個(gè)dsRNA片段。【本研究切入點(diǎn)】目前，針對秀珍菇菌種退化現(xiàn)象及原因的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分離、觀察秀珍菇生產(chǎn)中易感染木霉和黃菇病的退化菌株，通過與正常生產(chǎn)用種進(jìn)行生物學(xué)特征比較，并進(jìn)行dsRNA病毒檢測，以期從中找出性狀差異，為選擇優(yōu)質(zhì)秀珍菇菌種用于生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試菌株來源：X9和X13退化菌株為本課題組從秀珍菇感病、低產(chǎn)菌包中分離獲得，X5和X6菌株為本課題組從正常出菇秀珍菇菌包中分離獲得，對照菌株X15由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心保藏提供，平菇47菌株為平菇天達(dá)300退化菌株引至河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室，作為dsRNA檢測對照菌株。感染木霉和黃菇病的秀珍菇見圖1。

供試培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，水1.0L，pH自然。栽培料配方：木屑75%，棉籽殼12%，麩皮12%，石灰1%，水含量65%。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌落形態(tài)比較及拮抗試驗(yàn)將秀珍菇菌株活化后，接種于含PDA培養(yǎng)基的90 mm平皿中，倒扣置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲接近長滿時(shí)，觀察菌落形態(tài)。同時(shí)將X5、X6、X9、X13和X15菌株進(jìn)行活化，接種于同一個(gè)含PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，菌種間相距約3 cm，呈三角形排列，并對所有菌株進(jìn)行兩兩拮抗處理，每處理3次重復(fù)。置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察拮抗現(xiàn)象。

1.2.2溫度及pH對菌絲生長速度影響觀測

接種于PDA培養(yǎng)基后，分別置于15、20、25、30和35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（每個(gè)溫度梯度設(shè)5個(gè)重復(fù)），觀察菌絲生長情況。采用PDA培養(yǎng)基，分別調(diào)整pH為4、5、6、7和8，每個(gè)pH梯度設(shè)5個(gè)重復(fù)，接種活化秀珍菇菌株后25℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)生長速度最快的菌絲長滿培養(yǎng)基時(shí)，在菌落邊緣劃終止線。用直尺測量起始線與終止線的距離，計(jì)算各菌株在各溫度及pH下菌絲生長速度的平均值。

1.2.3出菇試驗(yàn)按栽培料配方配置、攪拌、裝袋后，將菌包高壓滅菌2 h，冷卻接種活化秀珍菇菌株后置于菇房中室溫培養(yǎng)，每處理30個(gè)菌包，并記錄菌絲在栽培料中的生長速度，菌絲滿袋后再后熟培養(yǎng)15 d。從各處理中隨機(jī)挑出一半菌包置于8℃菇房，低溫刺激10 h后進(jìn)行室溫出菇管理（低溫刺激出菇），另一半菌包不進(jìn)行低溫刺激直接進(jìn)行室溫出菇管理（常溫出菇）。出菇管理按常規(guī)方式進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)菌包的污染率及產(chǎn)量。

1.2.4ITS擴(kuò)增及遺傳差異性分析取1.0 g菌絲放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入7 mL離心管中，采用CTAB法提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆?，具體操作及ITS-PCR參考鄭秋霞等（201 5）的方法。采用RPAD、SRAP和ISSR進(jìn)行遺傳差異性分析，經(jīng)初步篩選選用如下引物：RAPD引物（S26、S29、S30、S32、S36、S38、S40、S47、S48和S78）；ISSR引物（1、2、3、7、10、13、15、18、19和20）；SRAP引物（em5-me9、em9-me5、em9-me7、em4-me5、em4-me7、em4-me9、em5-me5、em5-me7和em9-me9），上述引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，具體操作參考江玉姬等（2013）的方法。

1.2.5 dsRNA病毒感染檢測利用dsRNA在15%無水乙醇條件下能吸附于纖維素粉的特性，通過特異地吸附、洗脫去除雜質(zhì)，進(jìn)行純化，后續(xù)操作則參考王麗等（2009）的方法。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS v7.05對不同菌株間菌絲生長速度及出菇產(chǎn)量等試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1秀珍菇的菌落形態(tài)觀察及拮抗反應(yīng)

從圖2可看出，不同秀珍菇菌株菌落形態(tài)差異不明顯，但X13菌株的菌絲密度較其他菌株稀疏。由表1可知，對照菌株X15與正常秀珍菇菌株間無拮抗反應(yīng)發(fā)生，而退化菌株X9和X13與正常菌株在拮抗試驗(yàn)中表現(xiàn)出拮抗反應(yīng)。雖然退化秀珍菇菌株與正常菌株均源于同一種菌株，但經(jīng)生產(chǎn)過程中的重復(fù)轉(zhuǎn)代擴(kuò)接及組織分離，菌株間可能已出現(xiàn)變異，從而產(chǎn)生拮抗反應(yīng)。

2.2溫度及oH對秀珍菇菌絲生長的影響

從圖3和圖4可看出，各菌株的菌絲均在25～30℃及oH 7-8時(shí)生長最快，但X9和X13菌株的菌絲生長速度顯著低于其他菌株（P<0.05，下同），其中又以X13菌株的菌絲生長最慢；當(dāng)培養(yǎng)基的oH低于5或高于9時(shí)，X9和X13菌株的菌絲生長速度與正常菌株及對照菌株X15差異顯著。說明退化菌株X9和X13對環(huán)境的適應(yīng)能力較其他菌株弱。

2.3秀珍菇出菇試驗(yàn)結(jié)果

選取PDA培養(yǎng)基上菌絲生長緩慢的X13菌株與對照菌株X15及正常菌株X5進(jìn)行出菇試驗(yàn)，從圖5可看出，X5、X13和X15菌株經(jīng)過低溫刺激后出菇產(chǎn)量均有一定程度提高，與實(shí)際生產(chǎn)情況相符，其中，生長速度最快的為X15菌株（6.52 mm/d），單袋產(chǎn)量最高的為經(jīng)低溫刺激的X15菌株（134.78 g/袋）。方差分析結(jié)果表明，X13菌株的生長速度（4.95 mm/d）、常溫出菇單袋產(chǎn)量（73.34 g/袋）及低溫刺激出菇單袋產(chǎn)量（107.69 g/袋）均顯著低于X5和X15菌株，X5與X15菌株的菌絲生長速度、常溫出菇單袋產(chǎn)量及低溫刺激出菇單袋產(chǎn)量間差異不顯著（P>0.05）。同時(shí)，試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)低溫刺激處理后霉菌污染及黃菇病現(xiàn)象。

2.4 ITS鑒定及遺傳差異性分析結(jié)果

從圖6可看出，不同退化菌株、正常菌株與對照菌株X1 5的ITS片段大小一致，采用10個(gè)RAPD引物、10個(gè)ISSR引物和9對SRAP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增均可獲得清晰的目的條帶，且不同菌株間未出現(xiàn)差異條帶。說明RAPD、ISSR和SRAP 3種分子標(biāo)記無法將X5、X6、X9、X13菌株及對照X15菌株區(qū)分開來，表明其親緣關(guān)系十分接近，也與實(shí)際生產(chǎn)情況相符。

2.5 dsRNA病毒感染檢測結(jié)果

以平菇47為對照進(jìn)行dsRNA病毒檢測，其中X5、X6、X9、X13、X15和X47菌株的dsRNA樣品經(jīng)DNase I與RNase A酶解后仍有條帶，說明該條帶為dsRNA條帶。從圖7可看出.平菇47具有較明顯的4個(gè)dsRNA片段，同時(shí)在所有秀珍菇菌株中均檢測到dsRNA片段。正常菌株X5和X6具有兩個(gè)與退化菌株X9相同的dsRNA片段，大小約2300和1900 bp，退化菌株X13不僅具有上述兩個(gè)片段，還有3個(gè)大小分別約8200、1000和600 bp的dsRNA片段。

3討論

食用菌的菌種性狀與活力關(guān)系到后期出菇的產(chǎn)量、質(zhì)量及抗病能力。當(dāng)前我國食用菌生產(chǎn)對菌種的使用尚不夠規(guī)范，同種異名、同名異種的問題十分普遍，生產(chǎn)用種存在自行擴(kuò)繁保藏現(xiàn)象，忽視菌種老化、退化等問題，進(jìn)而影響食用菌的商品生產(chǎn)質(zhì)量。本研究通過比較秀珍菇退化菌株與正常生產(chǎn)用菌株的生物學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)退化菌株受溫度及pH影響明顯，進(jìn)一步采用分子標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分，未發(fā)現(xiàn)退化菌株在遺傳上存在明顯差異，與李丹青和王杰（2015）對退化草菇的研究結(jié)果存在差異，可能與選用的食用菌品種不同有關(guān)。在秀珍菇生產(chǎn)過程中為保證每批次菌包的出菇質(zhì)量，常采取低溫刺激菌包方式促進(jìn)原基形成，易引起雜菌污染，尤其當(dāng)菌絲活力不足，加之環(huán)境中雜菌基數(shù)過高，極易引起霉菌污染和黃菇病發(fā)生（郭倩等，2004）。

食用菌病毒主要由擔(dān)孢子傳播，且具有潛隱性，在受感染后并未立即表現(xiàn)出明顯的危害癥狀（郭杰和吳小平，2013）。但許多研究表明，dsRNA病毒感染會(huì)造成菌株退化進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p失，如蘑菇病毒病導(dǎo)致大面積減產(chǎn)、子實(shí)體畸形或出現(xiàn)顏色變異等（Morten and Hicks，1992；Krzysztof，2010）。潘迎捷等（1992）研究發(fā)現(xiàn)，香菇感染病毒后菌絲生長退化，畸形菇比例增加。Yu等（2004）的研究也證實(shí)，感染病毒的平菇出現(xiàn)菌種退化、子實(shí)體畸形及菌絲生長緩慢等現(xiàn)象。本研究中，不同秀珍菇菌株中均檢測到dsRNA片段，但有些菌株如X9和X13表現(xiàn)出退化現(xiàn)象，而有些菌株如X15表現(xiàn)正常。菌株退化與dsRNA病毒問是否存在相關(guān)性，還需通過脫毒試驗(yàn)和侵染性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

快速進(jìn)行退化菌株甄別及有效消除退化菌株給食用菌生產(chǎn)帶來的隱患，防止因退化菌株流人生產(chǎn)環(huán)節(jié)造成的損失，一直是食用菌生產(chǎn)需面對和解決的問題。結(jié)合本研究中退化菌株表現(xiàn)的一些特征和生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，可考慮從以下幾方面對生產(chǎn)用種進(jìn)行管控。一是從有正規(guī)資質(zhì)的菌種廠家引進(jìn)菌種；二是對生產(chǎn)用種進(jìn)行生物學(xué)特性及出菇試驗(yàn)，淘汰長勢不良、抗性較差的菌株；三是謹(jǐn)慎使用試管或培養(yǎng)皿中出現(xiàn)角變等異?，F(xiàn)象的菌株；四是采用尖端復(fù)壯（陳發(fā)川等，2011）、組織分離、原生質(zhì)體再生（關(guān)圓圓等，2011）等方法適當(dāng)進(jìn)行菌種復(fù)壯。

4結(jié)論

退化秀珍菇菌株菌絲的生長速度變慢，出菇產(chǎn)量降低，且在退化菌株中檢測出不同大小的dsRNA片段，因此，dsRNA病毒感染可能是引起秀珍菇菌種退化的重要因素，生產(chǎn)上應(yīng)避免使用退化菌株。