韋會平 鄭毅 韓洪波 尚遠(yuǎn)宏

摘要：【目的】優(yōu)化酯提除雜法提取分離芒果葉芒果苷工藝，為芒果苷相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供原料和技術(shù)支持。【方法】采用原料粉碎→酯提除雜→甲醇提取→濃浸膏洗滌→結(jié)晶沉淀的五步法從芒果葉中提取分離芒果苷，通過單因素試驗(yàn)和L₉（3⁴）正交試驗(yàn)對提取時間、超聲波功率、提取次數(shù)和提取溫度等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。【結(jié)果】酯提除雜法提取分離芒果葉中芒果苷的最佳工藝：將芒果葉粉碎過篩；按3 mL/g加入乙酸乙酯，密封浸泡4 h，超聲波振蕩提取20min（50℃，350w），室溫100目過濾，反復(fù)提取3次；在殘渣中按3 mL/g加入100%甲醇，超聲波振蕩提取4次（20min，350 w，55℃），趁熱100目抽濾；將各次提取液合并，真空減壓濃縮得濃浸膏產(chǎn)品；按4 mL/g加入100%甲醇，室溫攪拌洗滌5 min，靜置10 min，100目過濾，反復(fù)洗滌3次，濾渣60℃干燥得芒果苷粗品；按4 mL/g加入100%甲醇，50℃攪拌洗滌5 min，6℃靜置8 h，取出過濾，濾渣60℃干燥，反復(fù)結(jié)晶2次。按照上述工藝可獲得芒果苷粗品和純品2種產(chǎn)品，粗品的芒果苷純度>64.00%，總回收率83.90%，純品的芒果苷純度>98.00%，總回收率約66.40%?！窘Y(jié)論】優(yōu)化后的酯提除雜法提取分離芒果苷工藝操作簡便、成本低廉、效率高，可用于芒果苷實(shí)際生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：芒果苷；芒果葉；提?。环蛛x；酯提除雜法

0引言

【研究意義】芒果苷（Mangiferin）為帶四羥基吡酮的碳酮苷類物質(zhì)，分子式C₁₉H₁₈O₁₁，具有抗氧化、抗炎、降血糖、降尿酸、抗病毒、抗腫瘤、祛痰止咳等藥理作用（黃瀟和彭志剛，2007；Lee et al，2009；Viswanadh et al，2010），是我國藥典中多種傳統(tǒng)中藥材和中成藥的藥效成分和質(zhì)量指標(biāo)控制成分（國家藥典委員會，2015），具有極高的藥用價值。近年來，對芒果苷的藥理作用機(jī)制及藥用安全性評價已成為研究熱點(diǎn)（鄧幸運(yùn)，2017；胡小勤等，2017；李霞等，2017；劉穎等，2017；王勤等，2017a，2017b，2017c，2017d），充分展示出芒果苷良好的開發(fā)利用前景。芒果葉是至今發(fā)現(xiàn)芒果苷含量最高的植物資源（胥秀英等，2011；韋會平等，2016），因此，探究芒果葉芒果苷的高效提取工藝，對降低其生產(chǎn)成本、促進(jìn)新型產(chǎn)品開發(fā)及提高芒果產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)外對芒果苷提取分離工藝的研究主要集中于2008～2014年，近年來對其相關(guān)研究報道較少。鄧家剛和李學(xué)堅（2008）采用高濃度乙醇回流提取法提取芒果葉中的芒果苷，再以D101和D296兩種大孔樹脂柱層析分離得到純度為97.04%的芒果苷，回收率為58.92%；李學(xué)堅等（2011，2012）對上述工藝進(jìn)行改進(jìn)，采用弱堿性水提取芒果苷，再以D101和D301兩種大孔樹脂柱層析分離得到純度93.96%的芒果苷純品，回收率為65.64%；謝黎崖等（2010）采用乙醇微波提取法從芒果葉中提取芒果苷，結(jié)果顯示微波提取法相對于傳統(tǒng)回流提取法在提取時間和速率等方面更具優(yōu)勢；劉昊（2014）通過乙醇加熱回流提取芒果葉中的芒果苷，以AB-8大孔樹脂柱層析分離得到芒果苷純品，回收率僅為54.60%；鄧幸運(yùn)（2017）以250%乙醇為溶劑，采用超聲波提取法從白木香葉中提取芒果苷，再用AB-8大孔樹脂柱層析分離得到芒果苷，純度為80.00%。【本研究切入點(diǎn)】現(xiàn)有的芒果苷提取工藝均需經(jīng)過復(fù)雜的柱層析分離才能獲得芒果苷純品，但芒果葉中膠質(zhì)含量極高，粗提濃縮液十分黏稠，極易堵塞色譜柱或過濾裝置，分離純化操作難度極高，導(dǎo)致芒果苷提取分離工藝復(fù)雜、效率低、成本高，亟需改進(jìn)以提高芒果苷的提取分離效率，降低生產(chǎn)成本?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于芒果葉中芒果苷含量變化規(guī)律（韋會平等，2016），以乙酸乙酯去除芒果葉中的部分雜質(zhì)（包括大部分膠質(zhì)）（簡稱酯提除雜法），利用芒果苷在冷熱甲醇中的溶解度差異來提取分離芒果苷，為芒果苷相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供原料和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試芒果葉采自攀枝花市仁和區(qū)農(nóng)家芒果園，自然陰干，粉碎過20目篩。芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號100268-200401，純度98.2%）購自中國藥品生物制品檢定所。高效液相色譜（HPLC）流動相用乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純。主要儀器設(shè)備：FW100高速萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）、YM-2000CT多用途恒溫超聲波提取器（上海豫民儀器有限公司）、R-1005Ex真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、Agilent 1200高效液相色譜儀及化學(xué)工作站（安捷倫科技有限公司）、XS205DU電子天平（梅特勒一托利多儀器有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

1.2芒果葉中芒果苷含量測定

參照韋會平等（2016）的標(biāo)準(zhǔn)曲線法精密測定芒果葉中芒果甘含量。Eelipse XDB-C₁₈色譜柱（4.6nlnqx150mm，5μm）；流動相為乙腈和0.2%冰醋酸水溶液（15/85，v/v）；檢測波長258nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量20μL。

1.3芒果苷提取工藝優(yōu)化

1.3.1提取溶劑選擇稱取芒果葉粉100g，共6份，分別加入300mL 6種提取溶劑[堿水（pH9NaOH溶液）、100%甲醇、50%甲醇、無水乙醇、50%乙醇和乙酸乙酯]，室溫密封浸泡8h，超聲波振蕩提取30min（50℃，350w），趁熱100目抽濾，反復(fù)提取5次，合并提取液，真空減壓濃縮得到濃浸膏產(chǎn)品，稱重，并取樣測定其芒果苷純度及提取率（提取后所得產(chǎn)品和提取前原料中所含芒果苷的質(zhì)量百分比），確定最佳提取溶劑。

1.3.2除雜工藝優(yōu)化根據(jù)1.3.1試驗(yàn)結(jié)果，選擇純度和提取率均較低的溶劑為除雜溶劑，除去芒果葉中的部分雜質(zhì)，并對該工藝進(jìn)行優(yōu)化。提取次數(shù)優(yōu)化：稱取芒果葉100 g，加入除雜溶劑300 mL，室溫密封浸泡4 h，超聲波振蕩提取30 min（50℃，350 w），100目過濾，反復(fù)提取5次，將每次提取液分別真空減壓濃縮得到濃浸膏雜質(zhì)，稱重，并測定其芒果苷含量即芒果苷損失量，計算每次提取的芒果苷損失率（每次提取的芒果苷損失量占提取前芒果苷總量的百分比），以確定最佳提取次數(shù)。提取時間優(yōu)化：分別稱取芒果葉粉100g，共3份，加入除雜溶劑300 mL，室溫密封浸泡4 h，超聲波振蕩提取30 min（50℃，350 w），100目過濾，各提取3次，每次提取時間分別為10、20和30 min，將3次提取液合并進(jìn)行真空減壓濃縮得到濃浸膏雜質(zhì)，稱重，并測定其芒果苷含量即芒果苷損失量，計算各提取時間的芒果苷損失率，確定最佳提取時間。

1.3.3提取工藝優(yōu)化稱取芒果葉100g，按1.3.1最佳除雜工藝進(jìn)行除雜，取除雜后的殘渣，加入最佳提取溶劑進(jìn)行超聲波振蕩提取，每次提取均加入300 mL最佳提取溶劑，提取后趁熱100目抽濾，將每次的提取液合并進(jìn)行真空減壓濃縮得到濃浸膏產(chǎn)品，稱重，并計算芒果苷純度及提取率。固定上述條件，以每次提取時間（A）、超聲波功率（B）、提取次數(shù)（C）和提取溫度（D）為考察因素，以提取率作為考察指標(biāo)，設(shè)計L₉（3⁴）正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝條件，并開展3次驗(yàn)證試驗(yàn)（表1）。

1.4濃浸膏洗滌工藝優(yōu)化

1.4.1洗滌溶劑選擇稱取1.3.3最佳提取工藝條件下獲得的濃浸膏產(chǎn)品10 g，共4份，分別加入40 mL 4種洗滌溶劑（100%甲醇、無水乙醇、蒸餾水和乙酸乙酯），室溫攪拌洗滌5 min，靜置10 min，100目過濾，反復(fù)洗滌5次，濾渣60℃干燥得到芒果苷粗品，稱重，并計算芒果苷純度及回收率（芒果苷粗品和洗滌前濃浸膏產(chǎn)品中芒果苷的質(zhì)量百分比），確定最佳洗滌溶劑。

1.4.2洗滌次數(shù)優(yōu)化稱取1.3.3最佳提取工藝條件下獲得的濃浸膏產(chǎn)品10 g，加入最佳的洗滌溶劑按1.4.1方法進(jìn)行5次洗滌，對每次的洗滌濾液進(jìn)行取樣，測定其芒果苷含量，并將每次的洗滌濾液進(jìn)行減壓濃縮得到濃浸膏雜質(zhì)，稱重，計算每次洗滌洗去的雜質(zhì)質(zhì)量及芒果苷的損失率（洗滌液和洗滌前濃浸膏產(chǎn)品中芒果苷的質(zhì)量百分比），確定最佳洗滌次數(shù)。

1.5結(jié)晶工藝優(yōu)化

1.5.1結(jié)晶溶劑選擇稱取1.4最佳提取工藝條件下獲得的芒果苷粗品5 g，共5份，分別加入20 mL5種結(jié)晶溶劑（100%甲醇、50%甲醇、無水乙醇、50%乙醇和蒸餾水），50℃下攪拌洗滌5 min，6℃靜置8 h，取出趁冷過濾，濾渣60℃干燥得到結(jié)晶產(chǎn)品，稱重，并計算結(jié)晶產(chǎn)品中芒果苷純度及回收率（結(jié)晶前后產(chǎn)品中芒果苷的質(zhì)量百分比）。

1.5.2結(jié)晶次數(shù)優(yōu)化稱取按1.4最佳提取工藝條件所得芒果苷粗品5 g，加入20 mL 100%甲醇，按1.5.1方法進(jìn)行結(jié)晶處理，反復(fù)重結(jié)晶3次，測定每次結(jié)晶所得產(chǎn)品的純度及回收率。

1.6統(tǒng)計分析

以SPSS19.0（LSD法）對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1芒果葉中芒果苷含量測定結(jié)果

經(jīng)1.2方法精密測定，本研究所用芒果葉原料中芒果苷含量為2.61%。

2.2提取溶劑對芒果苷純度及提取率的影響

由表2可知，使用堿水、100%甲醇、50%甲醇、無水乙醇和50%Z，醇均能從芒果葉提取出芒果苷，其中，堿水的提取率高達(dá)92.3%，顯著高于其他提取溶劑（P<0.05，下同），但提取的芒果苷純度較低，僅7.60%；100%甲醇和50%乙醇提取的芒果苷純度均顯著高于其他提取溶劑，提取率均顯著高于除堿水以外的其他提取溶劑，雖然二者的提取率和芒果苷純度均無顯著差異（P>0.05，下同），但50%乙醇所得濃浸膏產(chǎn)品更黏稠，濃縮過程的耗能更大，因此100%甲醇為提取溶劑提取效果較50%乙醇優(yōu)，確定100%甲醇為最佳提取溶劑。此外，乙酸乙酯作為提取溶劑提取的浸膏產(chǎn)品質(zhì)量高達(dá)20.1g，僅次于堿水（31.7g），但芒果苷純度和提取率均顯著低于其他提取溶劑，可利用該特性來除去芒果葉中大量雜質(zhì)。

2.3提取次數(shù)和提取時間對除雜效果的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選用乙酸乙酯除去芒果葉中的部分雜質(zhì)。由表3可知，在酯提除雜過程中，除去的雜質(zhì)質(zhì)量隨提取次數(shù)增加急劇減少，前3次除去的雜質(zhì)總量占5次除去雜質(zhì)總量的90%以上，每次提取的芒果苷損失量為25.0 mg左右，損失率約1%。綜合考慮，除雜提取次數(shù)以3次為宜。由表4可知，與提取時間20 min相比，提取時間30 min去除的雜質(zhì)質(zhì)量無顯著增加，但芒果苷損失量顯著增加。綜合考慮，提取時間以20 min為宜。

2.4正交試驗(yàn)結(jié)果

如表5所示，提取時間、超聲波功率、提取次數(shù)和提取溫度均對提取率有顯著影響，其影響程度排序?yàn)椋禾崛囟?提取次數(shù)>超聲波功率>提取時間。雖然提取溫度對提取率的影響最大，提取溫度越高，

2.5洗滌溶劑對芒果苷純度及回收率的影響

由表6可知，不同溶劑洗滌所得粗品中芒果苷純度和回收率均存在顯著差異，其中100%甲醇洗滌所得粗品中芒果苷純度顯著高于其他溶劑，達(dá)64.50%，回收率達(dá)85.20%。因此，100%甲醇為最佳的洗滌溶劑。

2.6洗滌次數(shù)對芒果苷純度及回收率的影響

如表7所示，隨著洗滌次數(shù)增加，每次洗去的雜提取率越高，但甲醇沸點(diǎn)低、揮發(fā)性大，從生產(chǎn)安全考慮，提取溫度以不超過55℃為宜；其余3個因素均是1水平顯著低于2水平和3水平，2水平和3水平間無顯著差異。因此，從耗時、成本及安全等因素考慮，最佳方案是A282C2D3，即提取時間20 min，超聲波功率350w，提取次數(shù)4次，提取溫度55℃。對其進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示平均提取率為95.1%，芒果苷純度高達(dá)25.50%。

質(zhì)質(zhì)量急劇降低，前3次洗去的雜質(zhì)總質(zhì)量占5次洗去雜質(zhì)總量的95%以上；每次洗滌的芒果苷損失量為76.0 mg左右，損失率約3%。綜合考慮，確定最佳洗滌次數(shù)為3次，可洗去濃浸膏產(chǎn)品60%以上的雜質(zhì)，芒果苷總損失率約9%，芒果苷純度在64.00%以上。

2.7結(jié)晶溶劑對芒果苷純度及回收率的影響

如表8所示，100%甲醇作結(jié)晶溶劑所得產(chǎn)品的芒果苷純度顯著高于其他溶劑，回收率顯著高于除蒸餾水以外的其他3種溶劑，但以蒸餾水作結(jié)晶溶劑所得產(chǎn)品的芒果苷純度最低。綜合考慮，以100%甲醇為最佳結(jié)晶溶劑。

2.8結(jié)晶次數(shù)對芒果苷純度及回收率的影響

如表9所示，隨著結(jié)晶次數(shù)的增加，產(chǎn)品的芒果苷純度也逐漸升高，但結(jié)晶次數(shù)超過2次后，產(chǎn)品的芒果苷純度升高不顯著?？紤]到結(jié)晶次數(shù)越多，芒果苷損失量越大，因此，以結(jié)晶2次為宜，此時產(chǎn)品的芒果苷純度達(dá)98.23%，回收率達(dá)88.13%。

2.9驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

綜上所述，從芒果葉中提取分離芒果苷的最佳工藝為：（1）原料粉碎：芒果葉干燥，粉碎過20目篩；（2）酯提除雜：在芒果葉中按3 mL/g加入乙酸乙酯，密封浸泡4 h，超聲波振蕩提取20 min（50℃，350w），100目過濾，反復(fù)提取3次得到芒果葉殘渣；（3）甲醇提取：在芒果葉殘渣中按3 mL/g加入100%甲醇，超聲波振蕩提取4次（20 min，350 w，55℃），趁熱100目抽濾，將每次提取液合并進(jìn)行真空減壓濃縮得到濃浸膏產(chǎn)品；（4）濃浸膏洗滌：在濃浸膏產(chǎn)品中按4 mL/g加入100%甲醇，室溫攪拌洗滌5 min，靜置10 min，100目過濾，反復(fù)洗滌3次，濾渣60℃干燥得到芒果苷粗品；（5）結(jié)晶干燥：在芒果苷粗品中按4 mL/g加入100%甲醇，50℃攪拌洗滌5 min，冰箱6℃靜置8 h，取出趁冷過濾，濾渣60℃干燥，反復(fù)結(jié)晶2次。按照上述工藝可得芒果苷粗品和純品2種產(chǎn)品，粗品的芒果苷純度>64.00%，總回收率83.90%；純品的芒果苷純度>98.00%，總回收率約66.40%。

3討論

目前，從芒果葉或其他植物中提取芒果苷的工藝均需進(jìn)行柱層析分離純化（鄧家剛和李學(xué)堅，2008；李學(xué)堅等，2011，2012；鄧幸運(yùn)，2017），但芒果苷在單一強(qiáng)極性、弱極性和非極性溶劑中溶解度均較差，且芒果葉中膠質(zhì)含量高，對芒果苷提取分離干擾大，提取后的濃縮液黏度高，過濾難度大，分離時易堵塞色譜柱，因此，整個提取過程耗時、耗資、效率低。李學(xué)堅等（2012）采用弱堿性水提取芒果苷，經(jīng)過2次柱層析分離純化后，僅得到純度93.96%的芒果苷純品，總回收率65.64%。本研究從芒果葉中提取芒果苷工藝中，無需進(jìn)行柱層析分離純化，僅在甲醇提取芒果苷前利用酯提除雜法除去部分雜質(zhì)（包括大部分膠質(zhì)），所得的提取液中芒果苷純度高，且濃縮后其黏度較低，提取率較高，后續(xù)僅利用芒果苷在冷熱甲醇中溶解度差異的原理，通過結(jié)晶和重結(jié)晶手段實(shí)現(xiàn)芒果苷的高效分離，大幅度簡化其分離純化工藝，得到純度>98.00%的芒果苷純品，總回收率約66.40%，表明本研究的芒果苷提取分離效率更高。綜上所述，本研究不僅大幅度簡化芒果苷提取分離工藝，降低工藝要求和生產(chǎn)成本，還明顯提高提取分離的效率，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，但不足的是總回收率偏低，需對工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化，將每個工藝步驟中產(chǎn)生的雜質(zhì)廢棄物進(jìn)行回收和重復(fù)提取分離，提高提取效率。

4結(jié)論

優(yōu)化后的酯提除雜法提取分離芒果苷工藝操作簡便、成本低廉、效率高，可用于芒果苷實(shí)際生產(chǎn)。