朱娟娟 馬海軍

摘要：【目的】探討亞硒酸鈉（Na₂SeO₃）對(duì)銅脅迫釀酒葡萄幼苗生理特性的影響，為揭示硒元素緩解釀酒葡萄幼苗銅脅迫作用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳詫幭馁R蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)淡灰鈣土在溫室中盆栽釀酒葡萄赤霞珠，分析添加外源硒（1.0 mg/kg）對(duì)銅脅迫（300.0 mg/kg）釀酒葡萄幼苗葉片光合色素含量、抗氧化酶[過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）]活性、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白含量的影響。【結(jié)果】與對(duì)照（CK）相比，1.0 mg/kg硒處理能提高釀酒葡萄幼苗葉片的葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）和總?cè)~綠素（Chl a+b）含量及POD和CAT活性，降低MDA含量，但對(duì)SOD活性和可溶性蛋白含量無(wú)顯著影響（P>0.05）；300.0 mg/kg銅脅迫可顯著降低葡萄幼苗葉片的葉綠素（Chl）和可溶性蛋白含量（P<0.05，下同），提高Chl a/b、抗氧化酶活性及MDA含量；1.0 mg/kg曬+300.0 mg/kg銅處理的葡萄幼苗葉片Ch1和可溶性蛋白含量與CK相當(dāng)，但均高于300.0 mg/kg銅脅迫處理，SOD、POD和CAT活性比300.0 mg/kg銅脅迫處理略有降低，MAD含量顯著低于300.0 mg/kg銅脅迫處理?！窘Y(jié)論】銅脅迫條件下，低濃度（1.0 mg/kg）硒元素能提高釀酒葡萄幼苗對(duì)逆境的耐受力，提高葉片抗氧化酶活性，降低葉片細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度，進(jìn)而緩解銅對(duì)葡萄幼苗的毒害作用。

關(guān)鍵詞：釀酒葡萄；銅脅迫；硒；光合色素；抗氧化酶活性

0引言

【研究意義】銅是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素，其制劑是果樹(shù)上使用最多的一類(lèi)殺菌劑。但銅屬于無(wú)機(jī)元素，在環(huán)境中移動(dòng)性差，不可降解，隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中銅制劑的大量長(zhǎng)期施用，銅脅迫對(duì)葡萄園生態(tài)環(huán)境已產(chǎn)生積累性污染（卜元卿等，2013；徐秋桐等，2014），直接影響葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)和葡萄酒的品質(zhì)。大量研究表明，過(guò)量的銅抑制植物光合作用和呼吸作用，降低酶活性，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，加速H²O²向毒性更強(qiáng)的O^2-轉(zhuǎn)化，增加膜透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，代謝失調(diào)，破壞DNA結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受阻（肖志華等，2012；楊昱和秦樊鑫，2014）。硒元素對(duì)高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的生理和功能性作用（Gasecka et al，2016），低濃度硒可調(diào)控植物的光合和呼吸作用，促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育，提高體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分含量，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及增強(qiáng)植物抗逆性（朱麗琴等，2007；Proiettia et al，2013）。同時(shí)，硒元素不僅能增強(qiáng)殺菌劑的殺菌作用，還具有抗氧化作用并拮抗環(huán)境毒害、減少植物對(duì)重金屬的吸收，從而保護(hù)植物免受重金屬毒害（Li et al，2012）。因此，探討外源硒（Na²Se0³）對(duì)銅脅迫釀酒葡萄幼苗生理特性的影響，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)中提高釀酒葡萄果實(shí)硒含量、改善其品質(zhì)及緩解銅脅迫的毒害具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】林義章等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，銅脅迫小白菜的葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生變形，基質(zhì)類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)膨脹，隨著銅含量的增加，細(xì)胞膜逐步瓦解，葉綠體的基粒消失。銅元素除對(duì)植物光合作用產(chǎn)生顯著影響外，對(duì)植物體根系發(fā)育及養(yǎng)分吸收等也有顯著影響（Lomnardi and Sebastiani，2005）。此外，葡萄酒釀造過(guò)程中，原料中過(guò)量的銅不但影響酵母的存活率，而且顯著影響酵母對(duì)還原糖的發(fā)酵性能，最終影響CO²和酒精的產(chǎn)量（王巧碧等，2016）；同時(shí)，葡萄酒中銅過(guò)量還會(huì)加速酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，導(dǎo)致葡萄酒產(chǎn)生金屬破敗（Sun et al，2016），降低葡萄酒質(zhì)量。葉面噴施硒元素能提高葡萄（朱麗琴等，2007）、蘋(píng)果（寧嬋娟等，2013）和梨（王斐等，2014）等果實(shí)的硒含量，顯著增加果實(shí)可溶性固形物含量，改善果實(shí)品質(zhì)。黃麗美等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，硒具有抗氧化及修復(fù)葉綠體的作用，能清除植物體內(nèi)由重金屬脅迫產(chǎn)生的有害氧化性物質(zhì)，調(diào)節(jié)機(jī)體維持體內(nèi)氧化還原物質(zhì)處于正常水平，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，提高植物抗逆性，達(dá)到緩解重金屬脅迫的目的；硒與金屬元素問(wèn)具有很強(qiáng)的結(jié)合力，可降低砷、汞、鉛、鉻和鎘等重金屬元素對(duì)生物體的毒害。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)硒對(duì)重金屬脅迫的研究主要集中于小麥（李瑞平等，2011）、水稻（劉春梅等，2015）、油菜（彭玲等，2015）、玉米（黃麗美等，2017）和蔬菜（趙秀峰等，2017）等作物上，針對(duì)銅脅迫釀酒葡萄幼苗生理特I生影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn)，探討外源硒對(duì)銅脅迫赤霞珠（Cabemet Sauvignon）葡萄幼苗葉片光合色素含量、抗氧化酶[過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）]活性、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白含量的影響，揭示適量硒對(duì)銅脅迫毒害葡萄幼苗的緩解作用，為生產(chǎn)中提高釀酒葡萄果實(shí)硒含量、改善其品質(zhì)及緩解銅脅迫提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試葡萄品種為歐亞種釀酒葡萄赤霞珠1年生扦插苗，供試土壤為寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)淡灰鈣沙土。供試銅源硫酸銅（CuSO₄·5H₂0）、硒源亞硒酸鈉（Na₄SeO₃）購(gòu)自成都化夏化學(xué)試劑有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

盆栽試驗(yàn)于2016年5～12月在北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院日光溫室中進(jìn)行。選取生長(zhǎng)勢(shì)一致、具6～9片葉片的1年生赤霞珠葡萄扦插苗移栽于高30 cm、盆口直徑25 cm、盆底直徑13 cm的塑料花盆中，每盆盛干沙土10.5kg，施氮磷鉀復(fù)合肥20.0g，每盆移栽1株幼苗，充分灌水使土壤水含量基本一致。待緩苗生長(zhǎng)3個(gè)月后，挑選生長(zhǎng)一致的36盆幼苗進(jìn)行試驗(yàn)處理。依據(jù)《GB15618-1995土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》設(shè)置銅和硒處理水平。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共4個(gè)處理，分別為：對(duì)照（CK，不施銅和硒）、1.0 mg/kg硒處理（硒處理）、300.0 mg/kg銅處理（銅處理）和1.0 mg/kg硒+300.0 mg/kg銅處理（硒+銅處理），每處理3次重復(fù)，每重復(fù)3株幼苗。銅和硒含量折算后配制成對(duì)應(yīng)的溶液，硒或銅處理一次性將硒或銅溶液均勻噴人土壤，而硒+銅處理先一次性均勻噴入銅溶液，平衡24 h后再一次性噴人硒溶液；定期澆水，保持土壤水含量為15%～20%，30 d采集樣品進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。采樣時(shí)隨機(jī)選取幼苗頂部向下3節(jié)位內(nèi)的葉片，每次每株采集1片，用自封袋密封后置于冰盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室用去離子水洗干凈，用吸水紙擦干，去除主葉脈，剪碎混勻后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1抗氧化酶活性測(cè)定粗酶液提?。悍Q(chēng)取0.5 g葉樣品放人研缽中，加5.0mL 0.05mol/L磷酸緩沖液（pH 7.8），冰浴研磨，勻漿倒入離心管中，冷凍離心20 min（10000r/min），取上清液（酶液）分裝于1.5mL離心管中，置于-20℃下保存待用。參照張志良等（2009）的方法，采用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光化學(xué)還原反應(yīng)法測(cè)定SOD活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性，采用紫外分光光度法測(cè)定CAT活性。

1.3.2 MDA和可溶性蛋白含量測(cè)定參照張志良等（2009）的方法，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量。

1.3.3葉片光合色素含量測(cè)定參照張志良等（2009）的方法，采用丙酮一乙醇法測(cè)定葉片光合色素含量，利用下列公式計(jì)算葉綠素（Chl）和類(lèi)胡蘿卜素（Car）含量。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以LSD法進(jìn)行多重比較，以Excel 2007制圖。

2結(jié)果與分析

2.1硒對(duì)銅脅迫釀酒葡萄幼苗葉片光合色素含量的影響

光化學(xué)反應(yīng)中心是由葉綠體內(nèi)的光合色素組成，其含量直接影響光合速率。從圖1可看出，硒處理能提高釀酒葡萄幼苗葉片的Chl a、Chl b、總?cè)~綠素（Chl a+b）和Car.含量，分別比CK增加0.93%、13.5%、3.76%和6.35%，但差異不顯著（P>0.05，下同）；銅處理能顯著降低釀酒葡萄幼苗葉片的Chl a、Chl a+b和Car.含量（P<0.05，下同），明顯降低Chl b含量；硒+銅處理下釀酒葡萄幼苗葉片的Chl a、Chl b和Chl a+b含量略高于CK，差異不顯著，但顯著高于銅處理，Car.含量低于CK，明顯高于銅處理。從圖1還可看出，各處理問(wèn)的Chl a/b和（Chl a+b）/Car.均無(wú)顯著差異，但硒+銅處理的Chl a/b和（Chl a+b）/Car.略低于銅處理。說(shuō)明土壤中施用1.0 mg/kg硒可提高葡萄幼苗對(duì)300.0 mg/kg銅脅迫的耐受力。

2.2硒對(duì)銅脅迫釀酒葡萄幼苗葉片MDA和可溶性蛋白含量的影響

從圖2-A可看出，硒處理可顯著降低葡萄葉片的MDA含量，銅處理可明顯提高葡萄葉片的MDA含量，但與CK差異不顯著；硒+銅處理葡萄葉片的MDA含量顯著低于CK和銅處理。從圖2-B可看出，硒處理葡萄葉片的可溶性蛋白含量略低于CK，二者差異不顯著；銅處理葡萄葉片的可溶性蛋白含量最低，顯著低于CK，但與硒處理和硒+銅處理差異不顯著。說(shuō)明土壤中施用1.0 mg/kg硒能顯著降低300.0mg/kg銅脅迫葡萄幼苗葉片的MDA含量，明顯提高可溶性蛋白含量，從而降低銅對(duì)葡萄幼苗的細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化作用，提高其保水能力，緩解逆境對(duì)其造成損傷。

2.3硒對(duì)銅脅迫釀酒葡萄幼苗抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶系統(tǒng)是植物處于逆境時(shí)的重要保護(hù)機(jī)制，通過(guò)調(diào)控酶活性的變化，可緩解逆境對(duì)植物的損傷。從圖3-A和圖3-B可看出，硒處理葡萄幼苗葉片的SOD活性和比活力分別為239.6 U/mgFW和5.27 U/mg，均略低于CK。從圖3-C和圖3-D可看出，硒處理葡萄幼苗葉片的POD活性和比活力分別為223.5 U/mgFW和21.88 U/mg，均明顯高于CK。從圖3一E和圖3一F可看出，硒處理葡萄幼苗葉片的CAT活性和比活力分別為110.5 U/mgFW和10.46 U/mg，均顯著高于CK。從圖3還可看出，銅處理可顯著提高葡萄幼苗葉片的SOD、POD、CAT活性及比活力；硒+銅處理與銅處理問(wèn)的SOD、POD、CAT活性及比活力均存在一定差異，但差異不顯著。說(shuō)明硒元素對(duì)釀酒葡萄幼苗的保護(hù)作用可能主要通過(guò)非酶抗氧化物質(zhì)而不是通過(guò)提高抗氧化酶活性完成。

2.4光合色素、MDA含量、抗氧化酶活性及比活力間的相關(guān)性分析結(jié)果

從表1可看出，硒對(duì)銅脅迫葡萄幼苗葉片的Chla+b含量與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，表明葉片的MDA含量越高，其Chl含量越低，MDA含量越低則Chl含量越高；Car.含量與SOD比活力也呈顯著負(fù)相關(guān)，表明葉片的Car.含量越高，其SOD比活力越低，Car.含量越低則SOD比活力越高；其他指標(biāo)間均無(wú)顯著相關(guān)性。

3討論

王婭玲等（2016）研究認(rèn)為，銅離子作為葉綠體質(zhì)體藍(lán)素組成部分參與茶樹(shù)的光合作用，也是某些葉綠素合成酶的活化劑，高含量銅對(duì)茶樹(shù)有明顯的毒害作用，引起茶樹(shù)體內(nèi)酶系統(tǒng)紊亂，葉綠素合成受阻。本研究結(jié)果與其相似，300.0 mg/kg銅脅迫會(huì)降低釀酒葡萄幼苗葉片的Chl a、Chl b、Chl a+b和Car.含量，可能是因?yàn)槠咸延酌缥盏你~離子與合成Chl相關(guān)酶肽鏈中富含巰基的部分結(jié)合，改變了酶的結(jié)構(gòu)，抑制了Chl合成酶的活性，導(dǎo)致光合強(qiáng)度降低（葛淑芳等，2014），也可能是因?yàn)楦邼舛茹~離子促使葉綠體酶體失活，葉綠體分解加快的結(jié)果（李永杰等，2010），與譚明明等（2014）對(duì)甜瓜的研究結(jié)果一致。王麗霞（2010）研究發(fā)現(xiàn)，硒是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的組分，也參與輔酶A和輔酶Q的合成，一定濃度（<0.1 mg/L）的硒可增強(qiáng)線粒體呼吸速率和葉綠體電子傳遞速率，超出閾值（≥1.0 mg/L）時(shí)則導(dǎo)致其速率降低。本研究結(jié)果表明，施用硒能提高葡萄幼苗的Chl含量，單一施人低濃度（1.0 mg/kg）硒可提高葡萄幼苗葉片的Chl a、Chl b、Chla+b和Car.含量，而300.0 mg/kg銅脅迫下施入1.0 mg/kg硒可減小葡萄幼苗葉片Chl a、Chl b、Chla+b和Car.含量的下降幅度，且可降低Chl a/b和提高（Chl a+b）/Car，表明硒能提高葡萄幼苗對(duì)銅脅迫的耐受力，與胡斌等（2011）對(duì)小白菜的研究結(jié)果一致。

植物抗氧化酶系統(tǒng)活性的變化及膜脂過(guò)氧化作用能反映植物對(duì)逆境的響應(yīng)，SOD、POD和CAT等組成的抗氧化系統(tǒng)是植物的重要保護(hù)機(jī)制，當(dāng)植物遭受逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)SOD、CAT和POD活性迅速升高，可有效清除活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的傷害。SOD是植物抗氧化的第一道防線，能將多余的超氧陰離子歧化為H₂O₂和O₂，隨后H₂