張少偉 崔紅艷 蘇瑛

摘要：【目的】明確促卵泡激素β亞基（FSHβ）基因在雷州黑鴨群體中的遺傳變異情況，為雷州黑鴨群的品種選育提供分子標(biāo)記。【方法】采用PCR-SSCP對200羽雷州黑鴨FSHβ基因的外顯子2（exon2）和內(nèi)含子l（intl）進行多態(tài)性檢測，通過測序篩查出多態(tài)性位點（SNP位點），同時分析不同基因型與雷州黑鴨產(chǎn)蛋性狀間的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】在雷州黑鴨FSHβ基因的g.1103451A>T（intl）處發(fā)現(xiàn)一個單核苷酸突變位點（A→T），其存在3種基因型（AA型、AT型和TT型），對應(yīng)的基因型頻率分別為0.538、0.359和0.103。T等位基因頻率（0.718）高于A等位基因頻率（0.282），且g.1103451A>T位點在雷州黑鴨群體中符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。雷州黑鴨的開產(chǎn)日齡以TT型個體最早，其次是AT型個體，分別比AA型個體提前5.48和4.00 d，其差異均達顯著水平（P<0.05，下同）；在開產(chǎn)體重和300日齡產(chǎn)蛋數(shù)方面，也表現(xiàn)為TT和AT型個體顯著高于AA型個體，且以TT型個體最高，分別為1299-31g/羽和134.37枚；其他產(chǎn)蛋性狀指標(biāo)在不同基因型個體間的差異均不顯著（P>0.05）?！窘Y(jié)論】雷州黑鴨FSHβ因intl存在一個SNP位點（g.1103451A>T），其與產(chǎn)蛋性能間存在顯著相關(guān)性，主要對早期產(chǎn)蛋和生長發(fā)育具有促進作用，可作為雷州黑鴨品種選育的輔助選擇分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：雷州黑鴨：FSHβ基因：SNP位點：產(chǎn)蛋性能：關(guān)聯(lián)分析

0引言

【研究意義】雷州黑鴨原產(chǎn)于廣東省雷州半島，是經(jīng)自然馴化與當(dāng)?shù)厝嗣耖L期選育而形成的蛋鴨品種，通體烏黑亮澤，產(chǎn)蛋多，蛋個大，蛋殼青綠色，蛋黃橘紅，口感鮮美，且具有耐粗飼、抗病力和覓食力強、環(huán)境適應(yīng)性廣等特點（湯綺明，2013；黃駿騰等，2014）。在標(biāo)準的飼養(yǎng)條件下，母鴨開產(chǎn)日齡為90～120日齡，其中，春鴨在90日齡即可開產(chǎn)，而秋鴨需到120日齡才開始產(chǎn)蛋，產(chǎn)蛋期長達1年，年均產(chǎn)蛋量250枚左右，高峰期產(chǎn)蛋率在90%以上（黃駿騰等，2014）?？梢姡字莺邙喪桥嘤弋a(chǎn)、早熟、抗病型蛋用鴨的珍貴遺傳素材。促卵泡素（FSH）是一種糖蛋白類促性腺激素，由動物垂體前葉嗜堿性細胞分泌（Wang and Bernard，2012；李紅飛等，2017），是由a亞基和特異性β亞基形成的異源二聚體，調(diào)節(jié)下丘腦—垂體一性腺生殖軸中的反饋和負反饋作用（Huanget al，2015）。FSH的a亞基較保守，β亞基則決定種屬特性，故其行使的生物功能主要依賴于β亞基的特異作用，但β亞單位只有與a亞單位結(jié)合才具有生物學(xué)活性（Kato，1988；You et al，1996）。此外，F(xiàn)SHβ基因與畜禽繁殖性狀密切相關(guān)（楊孔等，2014；李俊等，2015；王蒙，2015；秦玉梅等，2017），因此，加強FSHβ基因研究對推進畜禽品種改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，有關(guān)家畜FSHβ基因的研究主要集中在基因多態(tài)性與豬羊產(chǎn)仔數(shù)、牛產(chǎn)奶量等的相關(guān)性分析方面。李俊等（2015）在廣西環(huán)江香豬中未能檢測出FSHβ基因的多態(tài)性位點（SNP位點），表明FSHβ基因型在動物繁殖性能上具有特異性和種屬性特點。Nazifi等（2015）運用PCR-SSCP對3種本地羊的FSHβ基因多態(tài)性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSHβ基因位點在不同種群間存在明顯差異。胡閃耀（2016）對美系和法系大白豬的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ基因存在AA、AB和BB基因型，其關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，無論是初產(chǎn)大白母豬還是經(jīng)產(chǎn)大白母豬，均以BB基因型個體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重最高。Aljuaydi等（2016）研究兩個不同埃及山羊品種FSHβ基因外顯子1（exonl）、內(nèi)含子2（int2）和外顯子3（exon3）位點遺傳多態(tài)性及其與窩產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA基因型在兩個山羊品種中均具有更多的產(chǎn)仔數(shù)。姚毅等（2016）通過分析波爾山羊、成都麻羊FSHβ基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FSHβ基因可能是控制山羊繁殖性能的一個主效基因。在家禽方面，F(xiàn)SHβ基因研究側(cè)重于基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋量（韓厚明等2008）、開產(chǎn)日齡（王青娟，2012）、蛋品質(zhì)（王蒙，2015）等繁殖性能的相關(guān)性。洪坤月等（2007）采用PCR-SSCP檢測太湖雞的FSHβ基因多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSHβ基因型頻率以AA型最高、BB型最低，等位基因頻率A高于B，且FSHβ基因exon3位點不存在多態(tài)性。楊孔等（2014）分析了藏雞FSHβ基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藏雞與羅曼雞一樣，其FSHβ基因exon2和exon3均無突變位點。王蒙（2015）研究表明，在連城白鴨與白改鴨雜交群體的FSHβ基因序列上存在7個新SNPs位點，其中2個為酶切位點（c.82C>G和c.308T>G），酶切位點c.82C>G與雜交群體的鴨蛋品質(zhì)顯著相關(guān)，而酶切位點c.308T>G與雜交群體的產(chǎn)蛋量極顯著相關(guān)。王亞男等（2015）研究表明，京海黃雞FSHβ基因多態(tài)性存在AA、AB、BB、CC、CD和DD基因型，H_AB基因型個體體重顯著高于BB基因型個體，CC基因型個體體重極顯著高于CD基因型個體。【本研究切入點】家禽血漿中FSHB的含量受光照、饑餓和年齡等多種因素影響，進而影響家禽的產(chǎn)蛋性能（Lewis et al，2005；額爾敦木圖等，2007），即FSHβ基因可作為家禽繁殖性狀的候選基因，但至今有關(guān)水禽FSHβ基因多態(tài)性與其產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用PCR-SSCP對雷州黑鴨FSHβ基因多態(tài)性進行檢測，通過測序篩查出SNP位點，繼而分析不同基因型與產(chǎn)蛋性狀間的相關(guān)性，明確FSHβ亞基基因在雷州黑鴨群體中的遺傳變異情況，為雷州黑鴨群的品種選育提供分子標(biāo)記。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試雷州黑鴨由廣東省湛江市坡頭恒成種養(yǎng)合作社提供，共200羽，于300日齡時進行翅靜脈采血（1.0 mL/羽），血樣-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA提取與檢測根據(jù)HiPure BloodDNA Mini Kit說明提取雷州黑鴨基因組DNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果。

1.2.2 SNP位點篩查根據(jù)GenBank已公布的鴨FSHβ基因（101794876）全長序列查找其外顯子2（exon2）和內(nèi)含子1（intl），采用Primer Primer 6.0設(shè)計對應(yīng)的擴增引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系40.0μL：其中DNA模板1.0μL，Premix Taq DNA聚合酶20.0μL，上、下游引物各1.0μL，ddH20 17.0μL。擴增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，退伙30 s，72℃1 min，進行34個循環(huán)；72℃延伸2 min。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物是否出現(xiàn)在目的條帶的預(yù)期位置，然后將目的基因片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，通過序列比對分析篩查SNP位點。

1.2.3 PCR-SSCP分析根據(jù)篩查到的SNP位點，采用Primer Premier 6.0設(shè)計擴增引物（表2），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系10.0μL：DNA模板1.0μL，Premix Taq DNA聚合酶4.5μL，上、下游引物各1.0μL，ddH20 2.5μL。擴增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，進行34個循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增效果。取3.0μLPCR產(chǎn)物，加入7.0μL變性上樣緩沖液，于PCR儀上295℃變性10 min后取出冰浴5 min，防止復(fù)性。經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，銀染顯色并拍照。

1.3統(tǒng)計分析

統(tǒng)計雷州黑鴨FSHB基因PCR-SSCP分析獲得的各種基因型，計算基因型頻率和等位基因頻率，并進行卡方適合性檢驗。同時采用SAS 9.2對不同基因型個體問的產(chǎn)蛋性狀進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點檢測結(jié)果

由圖1可看出，采用exon2和intl引物進行PCR擴增，均可獲得單一、清晰的目的條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果表明，雷州黑鴨FSHβ基因的g.1103451A>T（int1）處存在一個突變位點（圖2）。以SSCP引物進行PCR擴增，也獲得單一、清晰的目的條帶（圖3），且條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，即可用于后續(xù)的多態(tài)性分析。雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在117羽雷州黑鴨個體中共有3種基因帶型（圖4），經(jīng)測序得知，分別為AA型、AT型和TT型（圖5）。

2.2雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點的等位基因頻率和基因型頻率

由表3可知，F(xiàn)SHβ基因SNP位點（g.1103451A>T）中以TT型的基因型頻率最高，為0.538，AT型為0.359，AA型最低（0.103）。此外，T等位基因頻率（0.718）高于A等位基因頻率（0.282），說明純合的TT型是雷州黑鴨的優(yōu)勢基因型。經(jīng)卡方適合性檢驗發(fā)現(xiàn)，，說明g.1103451A>T位點在雷州黑鴨群體中符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。

2.3雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點的遺傳多態(tài)性參數(shù)

遺傳特性分析結(jié)果表明，雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點（g.1103451A>T）的期望雜合度（H）為0.405，觀測雜合度（Ho）為0.359，說明該位點呈中等的遺傳多態(tài)性；其有效等位基因數(shù)（Ne）為1.68，多態(tài)信息含量（PIC）為0.323（0.250

2.4雷州黑鴨V基因SNP位點與其產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性

由表4可知，開產(chǎn)日齡以TT型個體最早，較AA型個體提前5.48 d左右，二者差異顯著（P<0.05，下同）；AT型個體比AA型個體提前4.00 d開產(chǎn)，其差異也達顯著水平。在開產(chǎn)體重方面，TT和AT型個體差異不顯著（P>0.05，下同），但二者顯著高于AA型個體。300日齡產(chǎn)蛋數(shù)也以TT型個體最多（134.37枚），其次是AT型個體（132.58枚），AA型個體最少（123.30枚），且TT和AT型個體顯著高于AA型個體。其他產(chǎn)蛋性狀指標(biāo)在不同基因型個體間的差異均不顯著。綜上所述，雷州黑鴨FSHβ基因TT型效應(yīng)與其產(chǎn)蛋性能存在顯著相關(guān)性。

3討論

由于g.1103451A>T位點堿基A→T的突變位于基因內(nèi)含子上，因此不會引起編碼氨基酸的改變。雖然內(nèi)含子在基因轉(zhuǎn)錄過程中被剪切，并不參與功能蛋白合成，但其變異可通過mRNA運輸、基因轉(zhuǎn)錄、定位及翻譯等過程影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達（Nottet al，2003），故推測FSH基因內(nèi)含子變異對雷州黑鴨的產(chǎn)蛋性能也有明顯影響。Haigh等（2007）研究表明，內(nèi)含子參與基因的表達調(diào)控，且對于某些基因的特異表達必不可少。洪坤月等（2007）研究推測，在內(nèi)含子序列中可能存在某些調(diào)控因子的結(jié)合位點。本研究結(jié)果表明，雷州黑鴨FSHβ基因intl上的堿基突變（A→T）對其產(chǎn)蛋量和開產(chǎn)日齡均有顯著影響，說明FSHβ基因在產(chǎn)蛋和早期生長方面具有促進作用，但該突變是否是通過影響FSHβ基因表達而影響其產(chǎn)蛋性能尚需進一步探究。此外，SSCP分型結(jié)果表明，雷州黑鴨FSHβ基因SNP位點（g.1103451A>T）的A、T等位基因頻率分別為0.282和0.718，經(jīng)卡方適合性檢驗發(fā)現(xiàn)g.1103451A>T位點在雷州黑鴨群體中符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，即具有穩(wěn)定的遺傳效應(yīng)；SNP位點（g.1103451A>T）的He、PIC分別為0.405和0.323，屬中度多態(tài)位點?？梢?，雷州黑鴨群體在g.110345 1A>T位點上具有一定的選擇潛力。

本研究利用SAS 9.2對不同基因型個體與其產(chǎn)蛋性能的表型值進行多重比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷州黑鴨的開產(chǎn)日齡以TT型個體最早，其次是AT型個體，分別比AA型個體提前5.48和4.00 d，其差異均達顯著水平；在開產(chǎn)體重和300日齡產(chǎn)蛋數(shù)方面，也表現(xiàn)為TT和AT型個體顯著高于AA型個體，且以TT型個體最高，說明FSHβ基因在雷州黑鴨的產(chǎn)蛋性能和早期生長方面具有促進作用。涂小璐等（2008）研究表明，文昌雞FSH～]基因5端突變位點與開產(chǎn)日齡和42周齡產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)。王青娟（2012）通過分析文昌雞FSHβ基因（intl）SNP位點多態(tài)性與其產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AB基因型個體在開產(chǎn)日齡上表現(xiàn)出比AA基因型個體晚2.97 d的劣勢。王蒙（2015）研究發(fā)現(xiàn)，連城白鴨與白改鴨雜交Ft代FSHβ基因突變位點c.308T>G與120日齡產(chǎn)蛋量極顯著相關(guān)。王亞男等（2015）對京海黃雞FSHβ基因多態(tài)性進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在外顯子上的突變點對產(chǎn)蛋性能無影響，但對早期體重有影響。雖然本研究結(jié)果與上述相關(guān)研究結(jié)果存在不同程度的差異，但可確定FSHβ基因?qū)仪菰缙诋a(chǎn)蛋和生長發(fā)育具有促進作用，即FSHβ基因g.1103451A>T位點可作為雷州黑鴨品種選育的分子標(biāo)記。

4結(jié)論

雷州黑鴨FSHβ基因intl存在一個SNP位點（g.1103451A>T），其與產(chǎn)蛋性能間存在顯著相關(guān)性，主要對早期產(chǎn)蛋和生長發(fā)育具有促進作用，可作為雷州黑鴨品種選育的分子標(biāo)記。