苗淼 呂愛軍 胡秀彩 韓卓然 王景桂 陳成勛 孫敬鋒

摘要：【目的】明確引起錦鯉發(fā)病死亡的原因及其病原菌的藥敏特性，為生產(chǎn)中有效防治該病提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎贸Ｒ?guī)方法從患病錦鯉的肝臟中分離病原菌，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析確定其種屬，通過人工感染試驗判斷病原菌的致病性，并以紙片擴(kuò)散法測定其藥物敏感性?！窘Y(jié)果】綜合分離菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，可確定其為廈門希瓦氏菌。人工感染試驗證明，從患病錦鯉肝臟分離獲得的廈門希瓦氏菌具有較強(qiáng)毒力，其對斑馬魚的半數(shù)致死量（LD₅₀）為2.30x0⁴CFU/mL。廈門希瓦氏菌對阿莫西林、紅霉素、頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、美羅培南、亞胺培南、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素和氟苯尼考等14種藥物高度敏感，但對氨芐西林、左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、利福平、鏈霉素、依諾沙星、磺胺異惡唑和甲氧嘧啶等抗生素已產(chǎn)生耐藥性。【結(jié)論】廈門希瓦氏菌可感染引起錦鯉發(fā)病死亡，且具有較強(qiáng)毒力，實際生產(chǎn)中可選用阿莫西林、美羅培南、亞胺培南、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、頭孢哌酮、頭孢克肟、頭孢噻肟和阿奇霉素等抗生素進(jìn)行防治。

關(guān)鍵詞：錦鯉；廈門希瓦氏菌；分離鑒定；生理生化特性；藥敏試驗

0引言

【研究意義】錦鯉（Cyprinus carpio var.Koi）又稱緋鯉，隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprini-dae），是一種亞熱帶淡水觀賞魚，其體色艷麗、體格健美、泳姿優(yōu)美，具有極高的觀賞價值。隨著社會經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展和人民生活水平的提高，錦鯉在國內(nèi)已擁有廣闊的市場，但因育苗工廠化快速發(fā)展過程中養(yǎng)殖密度過大而造成其患病率和死亡率居高不下，嚴(yán)重制約了錦鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。當(dāng)前，錦鯉皰疹病等病毒性疾病仍是造成其死亡的重要原因，且細(xì)菌性疾病發(fā)生日益頻繁，如銅綠假單胞菌、少動鞘氨醇單胞菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌（李梅等，2010；辛偉濤等，2011；姜娜等，2012；陳凱等，2015）等均可引起錦鯉不同程度的發(fā)病死亡。因此，加強(qiáng)錦鯉的病理學(xué)研究對確保其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】希瓦氏菌屬（Shewanella）是1985年MacDonell和Colwell根據(jù)5srRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析后建立的新屬，為革蘭氏陰性桿菌，主要腐敗魚、蝦類等海產(chǎn)品。廈門希瓦氏菌（S.xiamenensis）隸屬于希瓦氏菌屬，從我國福建省廈門沿海的海洋沉積物中首次分離獲得（Huang et al，2010），此后又在一位胰腺炎患者術(shù)后放置的胰周引流管中檢測出廈門希瓦氏菌（zong，2011）。廈門希瓦氏菌分布廣泛，不僅分布在水體沉積物中，還廣泛存在于淡水、海水和污水中（Huanget al，2010）。目前，國內(nèi)外已有希瓦氏菌引起水產(chǎn)動物發(fā)病的研究報道，包括海藻希瓦氏菌（S algae）和腐敗希瓦氏菌，尤其是腐敗希瓦氏菌已被證實不僅可感染海水魚類如金帶藍(lán)子魚也能感染淡水養(yǎng)殖魚類如鯉魚和鱒魚。秦蕾等（2012）首次從患病異育銀鯽的體表病灶和內(nèi)臟中分離鑒定出腐敗希瓦氏菌，推測腐敗希瓦氏菌作為一種潛在的新病原也會對異育銀鯽養(yǎng)殖造成威脅。此外，周康等（2015）通過建立鯉魚腐敗希瓦氏菌的生長動力學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)以Baranyi模型的預(yù)測效果最佳，能有效地進(jìn)行食品安全預(yù)警；郭全友等（2016）探討了環(huán)境因子對大黃魚腐敗希瓦氏菌生長計數(shù)分析的影響，結(jié)果表明，平板計數(shù)法和濁度法均可對腐敗希瓦氏菌生長/非生長進(jìn)行有效判斷，但環(huán)境因子強(qiáng)度較大時宜采用平板計數(shù)法。【本研究切入點】隨著錦鯉市場需求量的增長和養(yǎng)殖工廠化程度的提高，其病害發(fā)生日趨頻繁，尤其是細(xì)菌性疾病（李梅等，2010；辛偉濤等，2011；姜娜等，2012；陳凱等，2015）已成為制約錦鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一，但至今鮮見廈門希瓦氏菌引起錦鯉發(fā)病死亡的相關(guān)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】2017年6月天津市某錦鯉養(yǎng)殖場的魚群出現(xiàn)大批量發(fā)病死亡現(xiàn)象，且各年齡段錦鯉均有發(fā)病，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，亟需對患病錦鯉進(jìn)行病原分離鑒定和致病性分析。在常規(guī)微生物分類鑒定的基礎(chǔ)上，采用16S rDNA序列分析進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并通過藥敏試驗篩選敏感藥物，旨在為生產(chǎn)中有效防治該病提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

患病錦鯉取自天津某錦鯉養(yǎng)殖場；人工感染試驗所用的斑馬魚購白天津市中環(huán)花鳥魚蟲市場，體長3.24±0.5 cm，體重0.354±0.10g。營養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨和酵母提取物購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管及配套試劑購自杭州微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自杭州濱河微生物試劑有限公司，試驗用抗生素：阿莫西林（10μg/片）、氨芐西林（10μg/片）、紅霉素（15μg/片）、頭孢克肟（5μg/片）、頭孢哌酮（75μg/片）、頭孢噻肟（30μg/片）、頭孢氨芐（5μg/片）、美羅培南（10μg/片）、亞胺培南（10μg/片）、萬古霉素（30μg/片）、阿米卡星（30μg/片）、慶大霉素（10μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、鏈霉素（10μg/片）、新霉素（30μg/片）、阿奇霉素（15μg/片）、克林霉素（2μg/片）、四環(huán)素（30μg/片）、左氧氟沙星（5μg/片）、萘啶酸（30μg/片）、諾氟沙星（30μg/片）、恩諾沙星（5μg/片）、氯霉素（30μg/片）、呋喃妥因（300μg/片）、利福平（5μg/片）、依諾沙星（10μg/片）、氟苯尼考（30μg/片）、磺胺異亞唑（300μg/片）、甲氧嘧啶（5μg/片）和復(fù)方新諾明（1.25/23.75μg/片）。

1.2病原菌分離

選取患病癥狀明顯的錦鯉在無菌條件下解剖，取其肝臟，剪碎后在LB固體培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂330g/L，NaCl 1 mol/L，pH 7.0～7.2）上劃線，28℃培養(yǎng)18h；挑選單個優(yōu)勢菌落接種至新的LB固體培養(yǎng)基上，28℃再培養(yǎng)18h，純化獲得的純種菌株命名為JLR。同時將純化后的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)18 h后與40%甘油按1：1的比例進(jìn)行混合，混勻后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3病原菌分類鑒定

1.3.1形態(tài)觀察及生理生化鑒定JLR菌株在LB固體培養(yǎng)基上（294±1）℃培養(yǎng)16h后進(jìn)行革蘭氏染色觀察；生理生化特性采用細(xì)菌微量生化鑒定管對JLR菌株進(jìn)行各項生理生化指標(biāo)測定，具體操作參照細(xì)菌微量生化鑒定管使用說明。

1.3.2 16S rDNA序列分析采用水煮法提取JLR菌株的DNA（馮廣達(dá)等，2013），并以此為DNA模板進(jìn)行16S rDNA序列PCR擴(kuò)增，其通用上游引物為27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物為1492r：5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系20.0μL，包括2xMaster Mix 10.0μL，上、下游引物各1.0μL，DNA模板1.0μL，無菌雙蒸水7.0μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，55℃30 min，72℃90 s，進(jìn)行30個循環(huán)；72℃延伸10 min。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，然后送至金維智生物科技（北京）有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析，并從比對結(jié)果中挑選出與之相關(guān)的種屬菌株序列，采用MEGA 5.0進(jìn)行多序列匹配分析，最后以鄰位相連法（Neighbor-ioining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.4人工感染試驗

選取游動快速、反應(yīng)敏捷的斑馬魚60尾，于（25±2）℃、pn 6.7-7.3的水箱中暫養(yǎng)1周，養(yǎng)殖期間連續(xù)供氧，試驗前1d停止喂食。感染試驗在25 cmx15cmx5cm的塑料魚槽中進(jìn)行，具體操作參照呂愛軍等（2011）、胡秀彩等（2012）的方法：先以LB液體培養(yǎng)基培育JLR菌懸液[（29±1）℃，16h）]，獲得的菌懸液在4℃下2000 r/min離心10 min，棄上清液，加入0.89%NaCl進(jìn)行稀釋，調(diào)整菌懸液濃度。感染試驗設(shè)6個處理組（1個對照組和5個試驗組），5個試驗組對應(yīng)的菌懸液濃度分別為3.68x10⁷、3.68x10⁶、3.68x10⁵、3.68x10⁴和3.68x10³CFU/mL，每尾腹腔注射10.0μL；對照組注射等量生理鹽水（0.89%NaCl）。試驗期間不喂食，每天觀察和記錄魚體發(fā)病情況，及時撈出死亡個體，連續(xù)觀察7 d。按1.2的方法對死亡魚體進(jìn)行病原菌分離，并采用BLISS方法計算菌株對斑馬魚的半數(shù)致死量（LDso）。

1.5藥敏試驗

采用紙片擴(kuò)散法對JLR菌株的藥物敏感性進(jìn)行檢測，然后根據(jù)藥敏紙片的抑菌范圍標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定（饒穎竹等，2016）。

2結(jié)果與分析

2.1患病錦鯉的癥狀表現(xiàn)

發(fā)病初期，病魚游動緩慢，攝食量減少，有浮頭現(xiàn)象；病魚體表充血，眼球凹陷，肛門兩側(cè)肌肉糜爛，胸鰭和尾鰭均有出血點，魚鰓充血發(fā)紅（圖1）。

2.2 JLR菌株的形態(tài)特征及生理生化特性

JLR菌株經(jīng)LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后可觀察到淡褐色的圓形菌落，邊緣整齊，中央輕微凸起，表面光滑，不透明；其菌體革蘭氏染色呈陰性，無芽孢，短桿狀（圖2）。JLR菌株的生理生化鑒定結(jié)果（表1）表明，其氧化酶反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)和硝酸鹽還原反應(yīng)呈陽性，M.R.試驗、V-P試驗和苯丙氨酸反應(yīng)呈陰性；無動力；可發(fā)酵利用葡萄糖（O-F發(fā)酵型），但不能利用棉籽糖、木糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇和檸檬酸鹽；可發(fā)酵產(chǎn)生硫化氫及鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶，但不產(chǎn)生吲哚，即JLR菌株的生理生化特性與廈門希瓦氏菌高度相似。

2.3 16S rDNA序列分析結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在1500 bp附近出現(xiàn)單一清晰的目的條帶（圖3），其測序結(jié)果顯示，JLR菌株的16S rDNA序列長度為1484 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)JLR菌株與廈門希瓦氏菌的同源性在99.0%以上。從基于16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）也可看出，JLR菌株與廈門希瓦氏菌（HQ418493）聚為一支，即二者的親緣關(guān)系最近。

綜合JLR菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，可確定其為廈門希瓦氏菌（S.xiamenensis）。

2.4人工感染試驗結(jié)果

由表2可知，菌懸液濃度為3.68x10⁷和3.68x10⁶CFU/mL兩個試驗組的斑馬魚在攻毒后48 h內(nèi)全部死亡，3.68x10³CFU/mL試驗組斑馬魚在攻毒后7d內(nèi)的累積死亡率為70%，對照組的斑馬魚在整個試驗期間均未出現(xiàn)病理變化和死亡現(xiàn)象。采用BLISS方法計算得知，JLR菌株對斑馬魚的LD₅₀為2.30x10⁴CFU/mL。發(fā)病初期斑馬魚游動緩慢或沉于水底，體表有明顯出血癥狀；從死亡斑馬魚的內(nèi)臟團(tuán)中可分離出與JLR菌株形態(tài)特征和生理生化特性一致的優(yōu)勢菌株。

2.5藥敏試驗結(jié)果

由表3可知，JLR菌株對阿莫西林、紅霉素、頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、美羅培南、亞胺培南、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素和氟苯尼考等14種藥物高度敏感，對頭孢氨芐、萬古霉素、四環(huán)素、呋喃妥因和阿米卡星等5種抗生素中度敏感，對氨芐西林、左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、利福平、鏈霉素、依諾沙星、磺胺異惡唑和甲氧嘧啶等抗生素已產(chǎn)生耐藥性。

3討論

希瓦氏菌是海淡水養(yǎng)殖環(huán)境中常見的細(xì)菌類群，目前有關(guān)希瓦氏菌感染淡、海水魚類的研究報道較多，但感染廈門希瓦氏菌的案例很少。廈門希瓦氏菌與奧奈達(dá)希瓦氏菌（S.oneidensis）的親緣關(guān)系最近，與腐敗希瓦氏菌也具有一定的親緣關(guān)系（秦蕾等，2012）。從希瓦氏菌的生理生化特性來看，奧奈達(dá)希瓦氏菌可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和一氧化氮，表現(xiàn)出過氧化氫酶活性（Venkateswaran et al，1999）。腐敗希瓦氏菌的氧化酶和接觸酶反應(yīng)呈陽性，可發(fā)酵產(chǎn)生鳥氨酸脫羧酶，但不產(chǎn)生脲酶；不發(fā)酵葡萄糖、山梨醇、棉籽糖、側(cè)金盞花醇和木糖；V-P試驗和M.R.試驗呈陰性；能利用檸檬酸鹽，產(chǎn)硫化氫但不產(chǎn)吲哚（Kozifiska and Pekala，2004；Holt et al，2005；秦蕾等，2012）。本研究從患病錦鯉的肝臟中分離獲得廈門希瓦氏菌，其與腐敗希瓦氏菌和奧奈達(dá)希瓦氏菌相比，最明顯的區(qū)別是廈門希瓦氏菌可利用葡萄糖。

藥敏試驗可為疫病防治的科學(xué)用藥提供重要參考依據(jù)，但實際用藥時需嚴(yán)格執(zhí)行國家有關(guān)漁藥使用的規(guī)定及政策，避免抗生素濫用及違禁藥物的使用，防止病原菌產(chǎn)生耐藥性（陳凱等，2015；饒穎竹等，2016）。錦鯉廈門希瓦氏菌的藥敏試驗結(jié)果表明，其對阿莫西林、紅霉素、頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、美羅培南、亞胺培南、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素和氟苯尼考等14種藥物高度敏感，但對氨芐西林、左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、利福平、鏈霉素、依諾沙星、磺胺異惡唑和甲氧嘧啶等抗生素已產(chǎn)生耐藥性。雖然部分抗生素如紅霉素、氯霉素、左氧氟沙星等在養(yǎng)殖過程中已經(jīng)禁用，但對廈門希瓦氏菌的抗菌譜研究及其分類地位鑒定仍具有重要指導(dǎo)意義。廈門希瓦氏菌對亞胺培南、美羅培南、頭孢菌素等抗生素高度敏感，與希瓦氏菌屬對大部分β-內(nèi)酰胺類抗生素較敏感的觀點相符（Sivolodskil et al，2012）。此外，廈門希瓦氏菌對萘啶酸、利福平、恩諾沙星和左氧氟沙星等抗生素不敏感，但秦蕾等（2012）研究發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌對這些抗生素較敏感，具體原因有待進(jìn)一步探究。

本研究的人工感染試驗結(jié)果表明，廈門希瓦氏菌具有較強(qiáng)毒力，其對斑馬魚的LD₅₀為2.30x10⁴CFU/mL，說明廈門希瓦氏菌作為一種條件性致病菌會對錦鯉養(yǎng)殖造成巨大威脅。尤其是養(yǎng)殖過程中，當(dāng)養(yǎng)殖密度過大或水體污染時，魚體因逆境脅迫而造成機(jī)體抵抗力下降，此時為致病菌的入侵創(chuàng)造了有利條件，進(jìn)而導(dǎo)致魚體感染發(fā)病甚至大量死亡。該結(jié)論為進(jìn)一步研究廈門希瓦氏菌的多樣性及分子生物學(xué)特性打下了基礎(chǔ)。

4結(jié)論

廈門希瓦氏菌可感染引起錦鯉發(fā)病死亡，且具有較強(qiáng)毒力，實際生產(chǎn)中可選用阿莫西林、美羅培南、亞胺培南、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、頭孢哌酮、頭孢克肟、頭孢噻肟和阿奇霉素等抗生素進(jìn)行防治。