孫巖 肖楠 李光 韓燕燕 劉淑瑩 王恩鵬 陳長寶

摘 要 建立了超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜（UPLC-QQQ-MS）檢測大鼠血漿中G-Re含量的方法，用于比較研究人參皂苷Re（Ginsenoside Re， G-Re）在正常大鼠和UVB輻射損傷模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為。選用Ascentis Express C18 色譜柱（5.0 mm × 3.0 mm，2.7 μm），以0.1%甲酸-乙腈為流動相，梯度洗脫。電噴霧離子源（ESI）在負離子模式下，選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）掃描，內(nèi)標(biāo)法定量，用于G-Re定量分析的離子為m/z 991.54/945.53/475.60。方法檢出限為4.0 ng/mL，定量限為13.5 ng/mL，G-Re在15～20000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r =0.999）；日內(nèi)和日間精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性均能滿足藥代動力學(xué)分析要求。結(jié)果表明，兩組大鼠分別單次口服50 mg/kg G-Re后，體內(nèi)代謝過程表現(xiàn)皆符合二室模型特征， 正常組和模型組t1/2α分別為（0.21±0.04）h和（0.69±0.07）h，t1/2β分別為（17.08±0.53）h和（21.40±16.77）h，AUC（0-t）分別為（321.91±2.27） g/（L·h）和（474.99±194.96）g/（L·h），AUC（0-∞）分別為（332.44±1.66） g/（L·h）和（518.64±231.39）g/（L·h），除t1/2α外，兩組之間的藥代動力學(xué)參數(shù)具有顯著差異（p<0.05）。本方法準(zhǔn)確、靈敏、專屬性強、穩(wěn)定性好，可用于人參皂苷Re的體內(nèi)藥代動力學(xué)比較研究。

關(guān)鍵詞 人參皂苷Re； 中波紫外線輻射； 藥代動力學(xué)

1 引 言

紫外線輻射具有強烈的生物學(xué)效應(yīng)，長期暴露于紫外輻射，尤其是中波紫外線（Ultraviolet B，UVB），對皮膚可產(chǎn)生強烈的光損傷，被照射部位真皮血管擴張，皮膚會出現(xiàn)紅斑、炎癥、老化現(xiàn)象，嚴(yán)重者可引發(fā)皮膚癌[1～5]。過量的UVB照射可導(dǎo)致機體中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）下降，由照射產(chǎn)生的自由基及活性氧可以攻擊免疫器官，導(dǎo)致其氧化損傷，免疫細胞的及細胞因子分泌發(fā)生改變，繼而機體的免疫功能逐漸減弱，甚至產(chǎn)生免疫抑制作用[6～8]。藥物代謝動力學(xué)是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，并運用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時間變化的規(guī)律的學(xué)科。近年來，質(zhì)譜技術(shù)在藥代動力學(xué)研究方面的應(yīng)用較為廣泛[9～11]，但是機體受UVB輻射損傷狀態(tài)下的相關(guān)代謝研究鮮有報道。

人參（Panax ginseng C.A.Mey.）具有良好的抗輻射功效，人參皂苷作為人參的主要活性成分之一，在抗氧化、清除氧自由基和抗衰老等方面具有較強的活性[11～15]。人參皂苷Re的質(zhì)量分數(shù)約占總皂苷的30%，具有清除自由基，保護不飽和脂肪酸等活性，有顯著的抗衰老功效，發(fā)揮著重要的抗腫瘤和抗癌作用[16～20]。

本研究利用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，檢測人參皂苷Re經(jīng)正常和UVB輻射損傷模型大鼠口服后的血藥濃度變化情況，計算相關(guān)的藥代動力學(xué)參數(shù)，比較兩組間的差異，為初步揭示紫外線輻射對機體代謝的影響提供理論依據(jù)，同時也對人參皂苷Re的藥用開發(fā)與基礎(chǔ)研究提供了參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1200型液相色譜系統(tǒng)，6520 Accurate Q-TOF儀， TSQ ENDURA質(zhì)譜儀，配有ESI離子源及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，均購自美國Agilent公司；Thermo UltiMate 3000系統(tǒng)；TDL-5-4型離心機（Anke公司），WS2-261-79高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；超低溫冰箱（美國熱電公司）；窄譜中波紫外線光源采用飛利浦紫外線燈（TL-01，峰值311～313 nm）；紫UV-340A外線輻照計（臺北路昌公司）。

乙腈（色譜級，美國Tedia公司）；甲酸（色譜級，美國Sigma公司）；人參皂苷Re和人參皂苷Rf對照品（純度>98%，吉林大學(xué)有機化學(xué)教研室）；超純水由美國Millipore公司的Milli-Q系統(tǒng)制得。

2.2 實驗動物

雄性Wistar大鼠12只，體重（180±20） g，動物合格證號：SCXK-（遼）2015-0001，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司動物中心提供。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下（濕度 50%±10%；溫度（25±2）℃；12 h 晝夜循環(huán)）進食進水，放入代謝籠內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，實驗前禁食12 h，實驗過程中所有動物都受到精心養(yǎng)護。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

Ascentis Express C18 色譜柱（5.0 mm×3.0 mm，2.7 μm），柱溫35℃。流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序：0 min，20% B；0～2 min，20% B；2～4 min，20%～35% B；4～7 min，35%～41% B； 7～9 min，41%～70% B；9～10 min，70%B。 流速 0.3 mL/min；進樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：碰撞氣為超純氦，鞘氣和輔助氣為高純氮；電噴霧電離（ESI），檢測模式為負離子模式；鞘氣壓力：35 psi；輔氣壓力：10 psi；離子轉(zhuǎn)運管溫度：325℃；氣化溫度：275℃；采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式檢測。

2.4 溶液配制及樣品處理

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制 稱取人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，用甲醇稀釋至1.0 mL，配成濃度為1.0 mg/mL母液，然后用甲醇稀釋成0.5、1.0、10.0和100.0 μg/mL的工作液。稱取人參皂苷Rf 標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，以甲醇定容至1.0 mL，配制成1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，然后用甲醇稀釋成1.0 μg/mL的工作液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取空白大鼠血漿100 μL 于1.5 mL Eppendorf 管中，每個樣品中加入不同質(zhì)量的人參皂苷Re，配成15、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000和20000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入100 μL 1 μg/mL人參皂苷Rf 作為內(nèi)標(biāo)， 混勻，加入200 μL冰甲醇，渦旋30 s，12000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進樣檢測。以G-Re 濃度為橫坐標(biāo)x，以G-Re 與G-Rf的峰面積比值（A/Ai）為縱坐標(biāo)y，進行直線回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 實驗方法

參考文獻[21]的方法對大鼠造模[21]，取上述雄性大鼠12只，用嬰兒理發(fā)器剃除整個大鼠背部（尾部至頸部）的絨毛，每2天剃毛1次，實驗前隨機分成空白對照組與UVB模型組，每組6只。UVB照射時，大鼠背部暴露在距光源30～42 cm處，每次劑量為170 mJ/cm2，連續(xù)UVB照射5天，從第6天開始，每2天照射一次，共14天（10次），UVB總劑量為2.38 J/cm2，照射后送回動物飼養(yǎng)室。

空白對照組與UVB模型組繼續(xù)按照上述照射條件飼養(yǎng)至第15 d，口服G-Re皂苷（混懸于0.5% CMC-Na） 50 mg/kg劑量混合液，在0.08、0.17、0.33、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12、24、36、48和72 h眼眶取血，每個時間點取血0.5 mL，血液冷卻后3000 r/min離心10 min，取上清血漿100 μL，測定前加入100 μL G-Rf內(nèi)標(biāo)液和 300 μL冰甲醇，渦旋30 s，以12000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，于4℃保存， 待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的鑒定及優(yōu)化

利用高分辨飛行時間質(zhì)譜儀在負離子模式下對人參皂苷Re、Rf進行定性分析，結(jié)果見圖1。分別在正、負離子模式下，采用直接進樣方式，優(yōu)化G-Re和內(nèi)標(biāo)G-Rf的三重四級桿質(zhì)譜的分析條件：毛細管電壓為2.0 kV；離子傳輸管溫度為200400℃；霧化器溫度為200400℃；鞘氣流速2050 psi；輔助氣流速0.3 L/min；自動優(yōu)化G-Re和內(nèi)標(biāo)G-Rf在多反應(yīng)檢測（MRM）時所產(chǎn)生的碎片離子種類和所需碰撞能量。本研究選擇負離子模式進行分析，詳細參數(shù)見表1。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 專屬性 將供試空白血漿與空白血漿中加入待測物和內(nèi)標(biāo)物后得到的總離子流圖（Total ion chromatorgram， TIC）和給藥后不同時間實測色譜圖進行比較。結(jié)果表明，血漿中所含內(nèi)源性物質(zhì)不干擾被測物和內(nèi)標(biāo)物的測定，被測物峰形良好。G-Re和內(nèi)標(biāo)G-Rf 的保留時間分別為4.61和6.52 min。空白大鼠血漿樣品，空白大鼠血漿中加入G-Re和內(nèi)標(biāo)G-Rf樣品，給藥1 h后的大鼠血漿樣品如圖2所示。

3.2.2 線性關(guān)系 將G-Re與內(nèi)標(biāo)G-Rf的峰面積比值（y）與G-Re濃度（x）進行最小二乘線性回歸。結(jié)果表明，在15～20000 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，得到標(biāo)準(zhǔn)曲回歸方程為y=0.0003x+0.0009（R=0.999）， 檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為4.0 ng/mL和13.5 ng/mL。

3.2.3 精密度與準(zhǔn)確度 采用高、中、低3個濃度的G-Re血漿QC樣本，每個濃度進行6個樣本分析，連續(xù)測定3天，計算日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。日內(nèi)和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，表明本方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

3.2.4 回收率 分別取G-Re高、中、低3個濃度的QC樣本，每個濃度進行6個樣本分析，將空白血漿中先加入G-Re，處理后計算所測得峰面積，與空白血漿處理后加入相同量G-Re所測得峰面積比值的百分率進行比較，考察樣品的提取回收率，結(jié)果見表2。G-Re回收率范圍為89.6%～91.9%， RSD<15%， 表明本方法可以滿足血漿類生物樣本的檢測要求。

3.2.5 基質(zhì)效應(yīng) 分別取G-Re高、中、低3個濃度的QC樣本，與等量G-Re的純標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積相對應(yīng)，測量基質(zhì)效應(yīng)， 基質(zhì)效應(yīng)（%）=A/B×100， 其中A為QC樣本中測得G-Re的峰面積， B為等量G-Re標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，每個濃度進行6個樣本分析，結(jié)果如表2所示，G-Re在3個濃度下的基質(zhì)效應(yīng)在93.2%～97.8%之間，表明本方法可有效避免基質(zhì)對人參皂苷Re測定的影響。

3.2.6 穩(wěn)定性 分別取G-Re高、中、低3個濃度的QC樣本，在不同的儲存條件（室溫24 h，20℃至少15天，3次凍融循環(huán)后和4℃下保存8 h）下， 3個QC水平的測定結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在上述條件下，人參皂苷Re樣本溶液較為穩(wěn)定，可滿足分析要求。

3.3 人參皂苷Re的藥代動力學(xué)比較研究

利用本方法研究大鼠口服50 mg/kg的G-Re后的藥代動力學(xué)行為。用DAS 2.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，其主要藥代動力學(xué)參數(shù)詳見表4。圖3為口服后空白組和模型組大鼠的平均血液藥物濃度-時間曲線， 通過赤池信息標(biāo)準(zhǔn)（Akaike's information criterion， AIC） 進行房室模型分析，結(jié)果表明，G-Re在兩組大鼠體內(nèi)代謝符合二室模型特征。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)t檢驗分析，與正常狀態(tài)下的藥動學(xué)參數(shù)比較， 在UVB輻射條件下， G-Re在大鼠體內(nèi)的t1/2β、 AUC、 Tmax和K21均高于正常組，兩者之間有顯著性差異（p<0.05），提示在UVB狀態(tài)下G-Re在大鼠體內(nèi)的吸收明顯升高，而Cmax、 K12和K10無統(tǒng)計學(xué)差異，提示在大鼠體內(nèi)的消除沒有發(fā)生明顯變化[22]。有研究報道，在輻射劑量為800 mJ/cm2 UVB急性照射下，即可導(dǎo)致裸鼠肝細胞GSH與SOD活性水平顯著下降[23]。本實驗在UVB照射劑量下，模型組大鼠肝臟可能造成了一定的氧化損傷，從而導(dǎo)致其對G-Re的吸收、分布、代謝及排泄過程產(chǎn)生了影響[23] 。

本實驗建立了UPLC-QQQ-MS/MS 法對正常和UVB輻射損傷模型大鼠體內(nèi)G-Re含量的快速檢測方法。利用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用的優(yōu)勢，對質(zhì)譜參數(shù)進行了優(yōu)化，對檢測的G-Re和內(nèi)標(biāo)G-Rf都分別選擇一個定性離子對和一個定量離子對，最終實現(xiàn)對G-Re的定量分析。此方法可在10 min內(nèi)完成G-Re的分析，檢測時間短、線性關(guān)系較好、方法回收率高、穩(wěn)定性良好，可滿足分析要求。本實驗對正常大鼠和UVB輻射大鼠體內(nèi)的人參皂苷Re藥代動力學(xué)比較研究，對比兩組代謝檢測結(jié)果，UVB輻射條件下測得大鼠體內(nèi)的人參皂苷Re含量較高，說明中波紫外線影響人參皂苷Re在動物體內(nèi)代謝過程，其詳細機制有待于進一步研究。

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