高歡歡 馬有寧 林曉燕 柴爽爽 秦美玲 張涵彤 何巧 陳銘學(xué)

摘 要 建立了親水作用-反相二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析水稻葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的方法。利用標(biāo)準(zhǔn)肽段系統(tǒng)分析了液相色譜流動(dòng)相酸堿度對(duì)二維親水作用-反相色譜系統(tǒng)正交性的影響。結(jié)果表明， 第一維親水作用色譜在堿性 （pH 9.3） 和第二維反相色譜在酸性 （pH 3.3） 的條件下，正交性最佳（R2=0.34113）。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合餾分收集技術(shù)進(jìn)一步評(píng)價(jià)了本測(cè)試系統(tǒng)在水稻葉片蛋白質(zhì)分析中的正交性。結(jié)果表明，在所有餾分收集組分中，鑒定次數(shù)小于2次的水稻葉片肽段占總肽段數(shù)目的50%以上，且一維液相色譜餾分收集的肽段在第二維色譜及質(zhì)譜分離分析中，可以較好地分布在不同時(shí)間段的洗脫窗口，表明本研究建立的親水作用-反相二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合餾分收集技術(shù)在復(fù)雜水稻葉片蛋白質(zhì)分離鑒定中可提供良好的的分離正交性。結(jié)合水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共鑒定出207345個(gè)肽段，歸屬于2930個(gè)蛋白質(zhì)簇。

關(guān)鍵詞 親水作用-反相二維液相色譜； 蛋白質(zhì)； 水稻葉片； 納升級(jí)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 正交性

1 引 言

水稻作為重要的糧食作物，是全球超過一半以上人口生存的食物來源，深入了解水稻生長(zhǎng)發(fā)育過程及調(diào)控具有重要意義[1]。蛋白質(zhì)作為基因功能的最終表現(xiàn)者和生物體性狀的直接參與者，在蛋白質(zhì)水平研究水稻發(fā)育生物學(xué)更具有直接性[2，3]。目前，植物蛋白質(zhì)組學(xué)的分離分析主要分為雙向電泳技術(shù) （2-DE） 和多維液相色譜技術(shù)[4，5]。雙向電泳技術(shù)是經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，但是其本身具有對(duì)分離極酸、極堿等蛋白的限制和無法與質(zhì)譜直接聯(lián)用等不足，而近年出現(xiàn)的基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)逐漸在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用[6，7]。多維液相色譜主要通過不同維數(shù)色譜對(duì)肽段的保留機(jī)制差異，提高分辨率及增加系統(tǒng)峰容量，改善復(fù)雜樣品的分離分析[8]。因此，選擇合適的色譜類型組合是建立多維液相色譜系統(tǒng)的關(guān)鍵?，F(xiàn)已建立的多維液相色譜主要是二維液相色譜，如離子交換-反相色譜[9]、反相-反相色譜[10]、親水作用-反相色譜[11]等。離子交換-反相色譜 （SCX-RP） 具有良好的正交性，是最早應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的二維液相色譜。但是，大多數(shù)肽段所帶電荷量相似 （+1、+2、+3），導(dǎo)致保留能力相似，分離效率較低，此外脫鹽過程也會(huì)有蛋白損失。這些因素都使得SCX-RP在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中存在局限[9，10]。研究表明，除選擇不同的固定相外，改變流動(dòng)相酸堿度也可實(shí)現(xiàn)二維液相色譜對(duì)肽段保留的差異，例如二維反相-反相色譜 （RP-RP） 通過色譜間急劇變化的流動(dòng)相酸堿度，實(shí)現(xiàn)肽段電荷分布差異，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)肽段選擇性分離分析[12]。

由于二維反相-反相色譜均通過疏水性實(shí)現(xiàn)對(duì)肽段的選擇，反相-反相系統(tǒng)在復(fù)雜肽段分離中不能提供良好的正交性[12]。依據(jù)對(duì)肽段的不同保留機(jī)制和對(duì)復(fù)雜體系高效的分離能力而建立的親水作用-反相色譜 （HILIC-RP）為多維液相色譜分離技術(shù)開創(chuàng)了新的思路[13，14]。Chen等[15]采用在線親水色譜-反相色譜分析大腸桿菌溶菌酶蛋白質(zhì)組學(xué)。親水作用-反相色譜已廣泛應(yīng)用于人類及動(dòng)物體蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，但在植物蛋白質(zhì)領(lǐng)域應(yīng)用較少，主要是由于植物體本身的次生代謝物等雜質(zhì)一定程度上干擾色譜分離[16]。至今尚未見將親水作用-反相色譜應(yīng)用于水稻器官或組織水平的蛋白質(zhì)組分析的相關(guān)報(bào)道。

近年來，在復(fù)雜的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)際樣品分析中，餾分收集技術(shù)被廣泛應(yīng)用于反相-反相二維液相色譜系統(tǒng)，提高了系統(tǒng)分離正交性[17，18]。首先將復(fù)雜樣品經(jīng)過一維色譜預(yù)分離出多組餾分，各組餾分按照一定的組合方式 （如時(shí)間方式） 組合，再進(jìn)行第二維色譜及質(zhì)譜的分析。Dwivedi等[17]將餾分收集技術(shù)應(yīng)用到反相-反相二維液相色譜，提高了系統(tǒng)正交性，蛋白質(zhì)的鑒定量增加了近30%。此外，餾分收集技術(shù)的引入，解決了由低堿度肽段的信號(hào)抑制和低豐度蛋白的采樣過疏等引起的重現(xiàn)性降低的問題[19]。

本研究建立了親水作用-反相色譜分離-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜的方法，應(yīng)用于水稻葉片蛋白質(zhì)組學(xué)分析。利用特征標(biāo)準(zhǔn)肽段系統(tǒng)考察了各維液相色譜在不同酸堿度條件下對(duì)二維液相色譜系統(tǒng)分離正交性的影響。此外，由于水稻葉片中蛋白復(fù)雜，餾分收集的引入可進(jìn)一步降低由質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴模式掃描對(duì)蛋白質(zhì)的覆蓋，提高鑒定重現(xiàn)性，為獲得更全面的水稻葉片中蛋白質(zhì)種類的研究奠定了基礎(chǔ)，以促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)水稻器官發(fā)育調(diào)控機(jī)理等方面的研究，為植物性蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)用于標(biāo)準(zhǔn)肽段評(píng)價(jià)二維親水作用-反相色譜系統(tǒng)的正交性，包括1260高效液相色譜儀、6545 四極桿飛行時(shí)間液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) （美國(guó)Agilent公司）。水稻葉片樣品的蛋白質(zhì)簇分析采用離線模式HPLC-Nano-RPLC-MS/MS系統(tǒng)，包括1200高效液相色譜儀、餾分收集裝置 （美國(guó)Agilent公司）； Finnigan Surveyor 液相色譜和LTQ線性離子阱質(zhì)譜 （Thermo-Electron Finnigan公司）。真空冷凍干燥機(jī) （美國(guó)Labcinco公司）； UV-2600紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。固相萃取小柱（美國(guó)3M公司）。

二硫蘇糖醇 （Dithiothreitol， DTT）、碘乙酰胺 （Iodoacetamide， IAA）、NH4HCO3、KCl、乙二胺四乙酸 （EDTA）、三 （羥甲基） 氨基甲烷 （Tris-HCl）、蔗糖、3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽 （CHAPS）、甲酸和氨水（美國(guó)Sigma公司）； 飽和酚溶液 （pH 7.9±0.2）、牛血清蛋白 （BSA）、 BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）； 胰蛋白酶 （Trypsin，美國(guó)Promega公司）。21種標(biāo)準(zhǔn)肽段均合成于上海強(qiáng)耀生物科技公司， 基本信息見表1。所用試劑均為分析純或更高純度。實(shí)驗(yàn)用水為Mill-Q水處理系統(tǒng) （美國(guó)Millipore公司） 純化的超純水。水稻葉片收集于自培水稻分蘗期，80℃儲(chǔ)存，備用。

2.2 水稻葉片蛋白的提取、酶解

蛋白質(zhì)提取和酶解參照文獻(xiàn)[20]的方法。提取： 研磨分蘗期水稻葉片，稱取3 g 葉片粉末，加入20 mL蛋白提取緩沖液，振蕩混勻； 加入等體積飽和酚，混勻，4℃振蕩后，離心收集上層酚相； 重復(fù)2次上述步驟； 將3次收集酚相匯總，加入0.1 mol/L 乙酸銨的甲醇溶液， 20℃沉淀過夜； 4℃振蕩離心，棄上清液； 甲醇、丙酮清洗沉淀； 晾干，加入蛋白裂解液，離心，取上清液，測(cè)定蛋白濃度。酶解： 為保證二維液相色譜上樣濃度，取適量上述粗蛋白，加入適量1 mol/L DTT，于37℃振蕩； 加入適量IAA，避光放置烷基化； 加入適量50 mmol/L NH4HCO3溶液，保持尿素濃度低于2 mol/L； 按照底物與酶質(zhì)量比50∶1加入胰蛋白酶，于37℃酶解過夜； 加入甲酸終止反應(yīng)。酶解結(jié)束，樣品經(jīng)固相萃取小柱除鹽，冷凍干燥，備用。

2.3 利用標(biāo)準(zhǔn)肽段評(píng)價(jià)二維親水作用-反相色譜系統(tǒng)正交性的液相及質(zhì)譜采集條件

HILIC色譜條件： XBridge Amide色譜柱（250 mm × 4.6 mm， 3.5 μm）； 流動(dòng)相包括3種酸堿度體系，依次為酸性體系： （A）10 mmol/L 甲酸銨 （pH 4.5），（B）10 mmol/L 甲酸銨 （乙腈-水，9∶1，V/V）； 中性體系： （A）10 mmol/L 甲酸銨 （pH 6.8），B： 10 mmol/L 甲酸銨 （乙腈-水， 9∶1， V/V）； 堿性體系： （A） 5 mmol/L NH3·H2O， （B） 5 mmol/L NH3·H2O （乙腈-水，9∶1，V/V）。流速： 0.5 mL/min，進(jìn)樣體積： 5 μL。柱溫： 25℃。液相梯度洗脫程序： 0～60 min，90%～60% B； 60～80 min，60%～40% B； 80～88 min，40%～10% B； 88～103 min，10% B。

RP色譜條件為： XBridge peptide C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm， 3.5 μm）； 流動(dòng)相包括2種酸堿度體系，依次為酸性體系： （A）0.1% 甲酸溶液 （pH 3.3），（B）0.1% 甲酸 （乙腈-水，9∶1，V/V）； 堿性體系： （A）5 mmol/L NH3·H2O （pH 9.3），（B）5 mmol/L NH3·H2O （乙腈-水，9∶1，V/V）。流速：0.5 mL/min，進(jìn)樣體積： 5 μL。柱溫： 25℃。液相梯度洗脫如下： 0～4 min，4%～8% B； 4～106 min， 8%～30% B； 106～116 min，30%～90% B； 116～120 min，90% B； 120～135 min， 4%B。

質(zhì)譜條件： 離子化模式： 正離子模式； 2 GHz，調(diào)諧范圍： m/z 100～1400； 干燥氣溫度及流速： 350℃ 和11 L/min； 鞘氣溫度及流速： 350℃ 和12 L/min； 碎裂電壓： 135 V； 錐孔電壓： 45 V； 采集質(zhì)量范圍： m/z 100～1400。內(nèi)標(biāo)參比離子： 嘌呤 （m/z 121.050873） 與 HP-0921 （m/z 922.009798）。

2.4 水稻葉片樣品分析系統(tǒng)液相及質(zhì)譜條件

第一維液相色譜系統(tǒng)HILIC色譜條件： XBridge Amide色譜柱（250 mm × 4.6 mm， 3.5 μm）； 流動(dòng)相組成： （A） 5 mmol/L NH3·H2O， （B） 5 mmol/L NH3·H2O （乙腈-水，9∶1，V/V），流速： 1 mL/min，進(jìn)樣體積： 50 μL。梯度洗脫： 0～60 min， 90%～60% B； 60～80 min， 60%～40% B； 80～88 min，40%～10% B； 88～92 min， 10% B； 92～107 min， 90%B。 采用自動(dòng)餾分收集器，餾分收集時(shí)間： 0～90 min，按照時(shí)間方式每分鐘收集為1個(gè)組分。 將組分按照時(shí)間順序編號(hào)（V1～V90）。根據(jù)文獻(xiàn)[20]報(bào)道，前10 min，高有機(jī)比例肽段含量較少，按照V1～V5、V6～V10 方式合并成2個(gè)組分； 編號(hào)V11～V90的組分按照順序合并成20個(gè)組分，共計(jì)22個(gè)組分，具體合并方式見圖1。合并后的組分通過真空旋轉(zhuǎn)濃縮至干，以0.1% 甲酸復(fù)溶，離心，取上清液，供第二維液相色譜分析。

第二維納升液相色譜系統(tǒng)采用Thermo EASY 1000 Nanoflow液相色譜儀，色譜條件： Acclaim PepMap RSLC色譜柱 （15 cm × 50 μm， 2 μm）和Acclaim PepMap 100 Trap柱（2 cm × 70 μm， 3 μm）； 流動(dòng)相： （A） 0.1%甲酸， （B） 0.1%甲酸-乙腈； 流速： 0.3 μL/min； 進(jìn)樣體積： 2 μL。梯度洗脫： 0～4 min， 4%～8% B； 4～106 min，8%～30% B； 106～116 min，30%～90% B； 106～120 min，90% B。

質(zhì)譜鑒定利用Thermo LTQ線性離子阱質(zhì)譜儀，質(zhì)譜條件： Nano源，正離子掃描方式，設(shè)置離子傳輸毛細(xì)管溫度為300℃； 電噴霧電壓： 1.9 kV； 歸一化碰撞能量為35%。數(shù)據(jù)依賴模式對(duì)MS和MS/MS進(jìn)行圖譜信息掃描，掃描方式為全掃描 （m/z 300～2000），全掃描中豐度最高的10個(gè)離子峰進(jìn)行MS/MS掃描。動(dòng)態(tài)排除 （Dynamic exclusion） 設(shè)置為： 重復(fù)次數(shù)為1次，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間 （Exclusion duration） 為30 s，采用Xcalibur軟件進(jìn)行系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理。

2.5 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)通過Proteome Discoverer軟件 （Version 2.0 Thermo Fisher Scientific），利用SEQUEST HT檢索算法在水稻數(shù)據(jù)庫(kù) （Oryza sativa subsp. Japonica （Rice）. fasta） 中進(jìn)行檢索鑒定。檢索參數(shù)為： 胰蛋白酶酶切，允許最大漏切位點(diǎn)為2，前體離子的質(zhì)量容忍度為20 ppm，碎片離子的質(zhì)譜容忍度為0.6 Da，半胱氨酸殘基C端+57 Da設(shè)為固定修飾，Met （M） +15.995 Da設(shè)為可變修飾，使用Percolator卡值保證所有肽段鑒定信息假陽性率≤1%。

3 結(jié)果與討論

多維液相色譜系統(tǒng)由于各維色譜分離機(jī)理的差異，對(duì)復(fù)雜樣品分離表現(xiàn)出較高的分辨率和峰容量。多維液相色譜正交性是衡量各維色譜分離機(jī)理差異的一個(gè)指標(biāo)，也是影響相色譜分離能力的重要因素[11]。

3.1 利用標(biāo)準(zhǔn)肽段評(píng)價(jià)二維液相色譜正交性

目前，肽段保留時(shí)間圖譜法 （Peptide retention time plots） 因其數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)便和直觀，在利用標(biāo)準(zhǔn)肽段評(píng)價(jià)系統(tǒng)正交性分析中廣泛應(yīng)用，以肽段在各維液相色譜的保留時(shí)間 （或相對(duì)保留時(shí)間） 為橫、縱坐標(biāo)，繪制保留時(shí)間圖譜，計(jì)算保留時(shí)間線性回歸系數(shù) （Correlation coefficient，R2），評(píng)價(jià)多維液相色譜正交性[21，22]。本研究在親水作用色譜和反相色譜系統(tǒng)中，利用標(biāo)準(zhǔn)肽段考察了各維液相色譜在不同酸堿度條件下對(duì)二維液相色譜系統(tǒng)分離正交性的影響，并選擇最佳酸堿度組合方式，實(shí)現(xiàn)二維液相系統(tǒng)正交性最大化[23]。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，利用一維納升液相色譜系統(tǒng)預(yù)分離，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù) （相關(guān)儀器參數(shù)見2.4節(jié)），分析肽段的等電點(diǎn)、疏水性、肽段長(zhǎng)度 （氨基酸數(shù)）、質(zhì)譜峰強(qiáng)度以及肽段在色譜中的保留時(shí)間，選擇氨基酸數(shù)目在8～30之間、肽段疏水性 （GAVAY） 在1.675～0.77之間，以色譜保留時(shí)間橫跨前、中、后時(shí)間段且質(zhì)譜響應(yīng)超過105的肽段為特征肽段 （見表1）。

參照文獻(xiàn)[21]，本實(shí)驗(yàn)考察了親水作用色譜在酸 （pH 4.5）、中 （pH 6.8）、堿 （pH 9.3） 條件下及反相色譜在酸 （pH 3.3）、堿 （pH 9.3） 條件下對(duì)二維系統(tǒng)正交性的影響。本研究未討論反相色譜在中性條件下對(duì)分離度的影響，因文獻(xiàn)[24]表明反相色譜在中性條件下對(duì)大多數(shù)肽段的保留與在酸性條件下保留相似。如圖2所示，在任一酸堿度下，親水作用色譜和反相色譜均表現(xiàn)出明顯的分離正交性。值得注意的是，相比于反相色譜在堿性條件下，酸性條件的反相色譜與任一酸堿度下的親水作用色譜組合形成的二維液相色譜系統(tǒng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽段保留分布更加分散，校正保留時(shí)間線性擬合系數(shù)越小，正交性越好。因此，選擇pH 3.3作為反相色譜流動(dòng)相的酸堿度。

在反相色譜流動(dòng)相為酸性的基礎(chǔ)上，親水作用色譜從酸性上升到中性，21種標(biāo)準(zhǔn)肽段在二維液相色譜系統(tǒng)的正交性幾乎未受影響（圖2D和2E）； 但當(dāng)親水作用色譜從中性上升到堿性，二維液相色譜對(duì)肽段的保留行為表現(xiàn)出明顯差異，校正保留時(shí)間線性擬合系數(shù)從0.59887降低到0.34113（圖2E和2F）。以肽段2和21為例， 親水性肽段2 （GRAVY=1.625） 從HILIC色譜柱到RP色譜柱的保留時(shí)間從50 min縮短到14 min； 疏水性肽段21 （GRAVY=0.503） 在兩維色譜的保留時(shí)間從25 min延長(zhǎng)到116 min。綜上所述，pH 9.3和pH 3.3分別被選擇為親水作用色譜和反相色譜的流動(dòng)相酸堿度。

此外，反相色譜因分離效率高、流動(dòng)相與質(zhì)譜兼容等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于二維液相色譜系統(tǒng)的最后一維 [12，23]，因此選擇親水作用色譜和反相色譜分別作為二維液相色譜系統(tǒng)的第一維和第二維。

3.2 結(jié)合餾分收集技術(shù)評(píng)價(jià)二維液相色譜技術(shù)在水稻葉片蛋白質(zhì)分析中的正交性

根據(jù)3.1節(jié)的結(jié)果，本研究建立的二維親水作用-反相液相色譜分析21種特征標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)出較好正交性，但其在分析復(fù)雜蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)際樣品的正交性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)際復(fù)雜蛋白質(zhì)組學(xué)樣品在二維液相色譜結(jié)合餾分收集系統(tǒng)中的正交性評(píng)價(jià)主要通過分析質(zhì)譜鑒定到的肽段在所有餾分中出現(xiàn)次數(shù)[19]及肽段在色譜中分離分布情況[24]。本研究通過分析實(shí)際水稻葉片中鑒定到的所有肽段在22個(gè)餾分收集組分中出現(xiàn)的次數(shù)，評(píng)價(jià)二維液相系統(tǒng)在實(shí)際樣品分析中的正交性。如圖3A所示，約50.7%肽段在22個(gè)餾分收集組分中出現(xiàn)次數(shù)不超過2次； 圖3B所示，一維液相色譜餾分收集組合后，肽段在第二維色譜及質(zhì)譜分離分析中，可以較好地分布在不同時(shí)間段的洗脫窗口，此結(jié)果與文獻(xiàn)[13]一致，且21種標(biāo)準(zhǔn)肽段在實(shí)際樣品分析的22個(gè)餾分組分中均勻分布，說明采用親水作用-反相二維色譜法結(jié)合餾分收集技術(shù)分析水稻葉片蛋白質(zhì)具有良好的分離正交性。

3.3 水稻葉片蛋白質(zhì)結(jié)果分析

分蘗期水稻葉片根據(jù)2.2節(jié)樣品前處理后進(jìn)行二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。由于實(shí)際樣品的復(fù)雜性以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴模式無法在有限時(shí)間內(nèi)分析所有的共洗脫肽段[19]，本研究每組分樣品進(jìn)行3次重復(fù)質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)在水稻蛋白質(zhì)庫(kù)中進(jìn)行檢索，3次重復(fù)共鑒定到207345個(gè)肽段，歸屬于2930個(gè)蛋白質(zhì)簇，其中3次共同鑒定到的蛋白質(zhì)簇為1374個(gè)，占3次鑒定蛋白質(zhì)簇總數(shù)的51.1%，而單次鑒定到的蛋白質(zhì)簇從第一次的235個(gè)逐漸減少到第三次的60個(gè)，第三次鑒定蛋白質(zhì)簇?cái)?shù)目?jī)H約占鑒定總數(shù)的2.2%，說明3次重復(fù)質(zhì)譜分析可實(shí)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)簇 （86.6%） 的可靠鑒定（圖4）。相比于Breci等[25]采用陽離子交換-反相二維液相色譜鑒定水稻葉片蛋白，本研究多鑒定到200349個(gè)肽段和2352個(gè)蛋白質(zhì)簇。可能是由于相比于陽離子交換色譜，親水作用色譜更能提供較為特異性的分離能力[21，26]，使得肽段在梯度時(shí)間內(nèi)均勻分布，相對(duì)延長(zhǎng)了質(zhì)譜采集時(shí)間，因而增加了蛋白鑒定量。在陽離子交換-反相系統(tǒng)中，為實(shí)現(xiàn)與質(zhì)譜的良好匹配，色譜分離得到的高鹽分肽段混合物需要經(jīng)過多步脫鹽，此過程可能會(huì)導(dǎo)致肽段損失，降低鑒定效率。

根據(jù)生物信息學(xué)工具PANTHER進(jìn)行聚類分析[27，28]，考察了水稻葉片蛋白質(zhì)的細(xì)胞組分、生物進(jìn)程以及分子功能，具體分布如圖5所示，圖中數(shù)值代表具有該功能的蛋白質(zhì)占總鑒定蛋白質(zhì)的百分比。從分子功能分布圖（圖5B）可見，鑒定到的蛋白質(zhì)其分析生物學(xué)功能主要有催化活性 （Catalytic activity）、結(jié)合活性 （Blinding activity）、結(jié)構(gòu)組成 （Structural molecule activity）、運(yùn)輸活性 （Transporter activity） 等，其中催化活性相關(guān)的蛋白質(zhì)鑒定量約占55.1%，例如具有酶催化活性的蛋白質(zhì)包括異構(gòu)酶、氧化還原酶和水解酶等。

4 結(jié) 論

建立了親水作用-反相二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定水稻蛋白質(zhì)的方法。堿性條件下 （pH 9.3） 的親水作用色譜和酸性條件下 （pH 3.3） 的反相色譜組合，提高了分離正交性； 在實(shí)際復(fù)雜水稻葉片樣品分析中，引入餾分收集技術(shù)，進(jìn)一步提高了色譜分離的正交性，最終鑒定到207345個(gè)肽段，歸屬于2930個(gè)蛋白質(zhì)簇。 結(jié)果表明，本方法是一種高正交性、高分辨率的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，適用于大規(guī)模的蛋白質(zhì)鑒定分析，為植物蛋白質(zhì)組學(xué)提供了新思路和技術(shù)方法。

References

1 Maertens M， Velde K V. World Dev.， 2014， 95： 73-87

2 Pandey A， Mann M. Nature， 2000， 405（6788）： 837-846

3 Tyers M， Mann M. Nature， 2003， 422（6928）： 193-197

4 Weiss W， Grg A. Methods Mol. Biol.， 2007， 355： 121-143

5 Rabilloud T， Lelong C. J. Proteom.， 2011， 74 （10）： 1829-1841

6 MI Wei， WANG Jing， YING Wan-Tao， JIA Wei， CAI Yun， QIAN Xiao-Hong. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（2）： 241-244

米 薇， 王 晶， 應(yīng)萬濤， 賈 偉， 蔡 耘， 錢小紅. 分析化學(xué)， 2010， 38（2）： 241-244

7 Heck A J. R. J. Proteom.， 2012， 75（13）： 3791-3813

8 D'Attoma A， Grivel C， Heinisch S. J. Chromatogr. A， 2012， 1262（21）： 148-159

9 Betancourt L H， De Bock P J， Staes A， Timmerman E， Perez-Riverol Y， Sanchez A， Besada V， Gonzalez L J， Vandekerckhove J， Gevaert K. J. Proteom.， 2013， 91（1）： 164-171

10 Wang Y X， Yang F， Gritsenko M A， Wang Y C， Clauss T， Liu T， Shen Y F， Monroe M E， Lopez-Ferrer D， Reno T， Moore R J， Klemke RL， Camp DG， Smith R D. Proteomics， 2011， 11（10）： 2019-2026

11 Zhao Y， Kong R P， Li G， Lam M P， Law C H， Lee S M， Lam H C， Chu I K. J. Sep. Sci.， 2012， 35（14）： 1-9

12 Spicer V， Ezzati P， Neustaeter H， Beavis R C， Wilkins J A， Krokhin O V. Anal. Chem.， 2016， 88（5）： 2847-2855

13 Simon R， Enjalbert Q， Biarc J， Lemoine J， Salvador A. J. Chromatogr. A， 2012， 1264（22）： 31-39

14 Liu J， Pan Y H， Xu Q， Luo J， Xu S C， Zhao K J. Scienntia Agricultura Sinica， 2009， 42（3）： 772-780

15 Chen B， Peng Y， Valeja S G， Xiu L， Alpert A J， Ge Y. Anal. Chem.， 2016， 88（3）： 1885-1891

16 Boersema P J， Divecha N， Heck A J， Mohammed S. J. Proteome Res.， 2007， 6（3）： 937-946

17 Dwivedi R C， Spicer V， Harder M， Antonovici M， Ens W， Standing K G， Wilkins J A， Krokhin O V. Anal. Chem.， 2008， 80（18）： 7036-7042

18 Stephanowitz H， Lange S， Lang D， Freund C， Krause E. J. Proteome Res.， 2012， 11（2）： 1175-1183

19 Zhou F， Sikorski T W， Ficarro S B， Webber J T， Marto J A. Anal. Chem.， 2011， 83（18）： 6996-7005

20 Inders S， Andrewrs R， Douglasjh O， lson， Vipen K. Sawhneya. Plant Sci.， 2009， 176（1）： 99-104

21 Gilar M， Olivova P， Daly A E， Gebler J C. Anal. Chem.， 2005， 77（19）： 6426-6434

22 Gilar M， Fridrich J， Schure M R， Jaworski A. Anal. Chem.， 2012， 84（20）： 8722-8732

23 Cai X， Guo Z， Xue X， Xu J， Zhang X， Liang X. J. Chromatogr. A， 2012， 1228（5）： 242-249

24 Gilar M， Olivova P， Daly A E， Gebler J C. J. Sep. Sci.， 2005， 28（14）： 1694-1703

25 Breci L， Haynes P A. Plant Proteomics. Humana Press， 2007： 249-265

26 D'Attoma A， Grivel C， Heinisch S. J. Chromatogr. A， 2012， 1262（21）：148-159

27 CHEN Xia， WEN Hong-Mei， LIU Rui， ZHU Dong， LI Wei， ZHOU Hong-Guang， WU Mian-Hua. Chines J. Anal. Chem.， 2014， 42（2）： 239-243

陳 霞， 文紅梅， 劉 睿， 朱 棟， 李 偉， 周紅光， 吳勉華. 分析化學(xué)， 2014， 42（2）： 239-243

28 HAN Xiao-Yan， ZHAO Dong. Chin. J. Liq. Crys. Disp.， 2017， 32（1）： 69-75

韓曉艷， 趙 東. 液晶與顯示， 2017， 32（1）： 69-75