王巨龍

摘 要：哺乳動物體細胞核移植技術（Somatic Cell nuclear transfer，SCNT）近幾十年的發(fā)展取得了巨大的成就，但由于需要繁瑣的技術、昂貴的顯微操作儀且核移植效率不理想，阻礙了核移植克隆的規(guī)?；l(fā)展。近年來科學界運用了新的革新方法—體細胞手工克隆（Handmade Somatic Cell Cloning，HCM），其操作無需顯微操作儀，對操作人的技術要求不高，是純手工核移植技術。該技術不僅簡化操作程序，還提高核移植效率，對今后哺乳動物核移植研究有重要的推動作用。該綜述將從核移植技術的研究與進展方面，探討限制手工克?。℉CM）的因子并以此來優(yōu)化手工克隆技術。

關鍵詞：卵母細胞；手工克??；去透明帶；核移植

中圖分類號 S855.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）09-0120-04

The Handmade Cloning Technology and Research Progress on Mammalian

Wang Julong

（Department of Biology Engineering，Wuhu Institute of Technology，Wuhu 241003，China）

Abstract：Mammalian somatic cell nuclear transfer has achieved great accomplishments through the past few decades' development.However，the limitations of industrialization of nuclear transfer are cumbersome technology as well as expensive equipments and unsatisfied with the efficiency of nuclear transfer.In recent years scientists applied a novel somatic cell cloning method，which called handmade somatic cell cloning（HCM）.Zona-free procedure may offer a solution for the latter problem.It is unnecessary micromanipulation for handmade somatic cell cloning and workers don' t require many skills.This technology is not only simplified the operation but also improved the efficiency of somatic cell nuclear transfer，which will advance the development and the industrialization of nuclear transfer to improve the efficiency of somatic cell nuclear transfer in future.This review will from the research progresses on HMC to explore the effects of handmade cloning factors and in order to optimize the handmade cloning technology.

Key words：Oocyte；Handmade cloning；Zona-free oocytes；Nuclear transfer

自Briggs and King（1952）[1]等人手工操作成功地將兩棲類美洲豹蛙（leopard frog）卵母細胞去核以來，科研者不斷地完善哺乳動物的核移植技術。1997年，英國《自然》期刊報道了Wilmut 等[2]利用綿羊乳腺細胞進行核移植實驗，首次獲得世界上第一只克隆綿羊Dolly。這一開創(chuàng)性的實驗證實哺乳動物體細胞具有全能性，為后續(xù)開展的體細胞核移植提供理論基礎。在此之后科學家利用哺乳動物體細胞核移植技術先后成功克隆出豬[3]、牛[4]、兔[5]、小鼠[6]、馬[7]等多種哺乳動物，其中在2017年我國科學家首次成功完成克隆猴-“中中”和“華華”。然而核移植克隆的后代表現出體弱，生存力不強易致病死亡甚至出現衰老跡象[8-9]等特征，這些原因還有待進一步研究。Vajta等[10]認為傳統(tǒng)的核移植技術存在著種種缺陷，無法滿足克隆技術向規(guī)?；l(fā)展，其原因為：（1）核移植效率低；（2）需要昂貴的設備以及熟練的技術操作（3）移植后妊娠率低，出生后死亡率高。1964年Gwatkin.R發(fā)現小鼠囊胚的透明帶暴露于酸性溶液時可以被溶解。研究學者開始嘗試用無透明帶卵母細胞受精進行囊胚發(fā)育，研究表明透明帶并非胚胎發(fā)育所必需的。Peura等[11]首次研究報道，牛的克隆成功應用去核卵且無透明帶的卵母細胞與2-cell卵裂球融合。同時微穴法（well of the well，WOW）[11] 發(fā)展完備培養(yǎng)系統(tǒng)為無透明帶的重構胚單個培養(yǎng)提供可能。Vajta 等[10]改進Peura方法不依靠顯微設備，首次以體細胞為供體，將無透明帶核移植技術成功應用于克隆牛。這一革新的核移植技術便是手工克隆技術（Handmade Somatic Cell Cloning，HCM），利用這項技術已經成功得到了牛[10]、小鼠[13]、豬[14]、馬[15]、綿羊[16]等哺乳動物核移植后代。此后，科研人員不斷完善手工克隆技術，使核移植效率提高，操作程序更簡化，實驗耗資少，使大規(guī)模開展哺乳動物核移植研究成為可能。本文著重從手工克隆技術操作，以及限制手工克隆成功因子等方面進行論述，以期進一步優(yōu)化手工克隆技術。

1 手工切割卵母細胞去核

1.1 卵母細胞去透明帶 將獲取得到的未成熟的卵母細胞體外培養(yǎng)成熟（IVM），以卵母細胞排出第一極體為成熟標志。然后用移液槍反復吹打成熟卵母細胞吹散粘連的顆粒細胞。選取外膜完整胞質充滿成熟的卵母細胞移入鏈酶蛋白酶（Pronase E）微滴中。去透明帶一般需要5～10min左右，當觀察到大多數卵母細胞開始變形時迅速轉至T20（20%胎牛血清的TCM-199基礎液）清洗終止消化，最后將無透明帶的卵母細胞移至細胞松弛素（Cytochalasin B，CB）微滴中，然后放置37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育20min。Vajta[17]等將成熟的牛卵母細胞用CB 2.5ug/ml+T20處理后并在特定的位置切割細胞，其后期胚胎正常發(fā)育率高達90%以上。

1.2 卵母細胞去核 卵母細胞去核方法有多種，主要有盲吸去核法、DNA染色熒光去核法、化學藥物誘導去核法等，但大部分都要借助顯微操作儀才能完成去核。杜衛(wèi)華等研究利用藥物誘導小鼠卵母細胞的化學去核，其去核率與盲吸法去核無顯著差異。Peura等采用手工切割卵母細胞與Hoechst33342熒光染色去核技術相結合可獲得90%的去核率。Westhusin等實驗表明Hoechst33342染色和紫外線（UV）短時間照射不會影響體細胞在去核卵母細胞發(fā)育的全能性。此后實驗室手工克隆基本采用westhusin方法。將自制的特殊的切割刀片[18]或玻璃針小心將固定的卵母細胞切割兩半，也可以將切割工具安裝在顯微操作臂上，通過顯微操作儀將卵母細胞切割去核。卵母細胞恢復后使用Hoechst33342進行DNA染色，通過顯微鏡的紫外光線短暫照射將含有細胞核的卵細胞去除，無核的胞質卵保留。

2 供體細胞核來源

供體細胞核來源可以從胚胎發(fā)育過程的各個階段獲取如原核受精卵、胚胎的卵裂球（ES細胞）、胎兒細胞、分化成熟的體細胞等。近年的實驗表明，作供體細胞重構胚的早期的ES細胞要優(yōu)于成纖維細胞構建的重組胚發(fā)育潛力。這進一步揭示，供體細胞的來源其細胞核分化的程度越低，構建的重構胚發(fā)育潛力越高。當前研究認為核移植的成功率低，大多歸因于未能完全再程序化供體細胞中的后成性基因印記[19]，因此，為提高核移植成功率，均注重供體細胞來源的選擇。另有研究發(fā)現，供體動物的年齡、供體細胞的類型、供體細胞周期、體外培養(yǎng)傳代次數等諸多因素，均可能影響核移植的效率，但在HCM克隆方面還沒有系統(tǒng)研究。

3 重構胚的融合/激活

卵母細胞的融合與激活是手工克隆技術關鍵的一步，電融合被廣泛的用于供體細胞核融合到受體胞質中。它是將無核的胞質卵與供體體細胞通過電融合的方法，分為一次融合法和二次融合法。

3.1 供體一半卵一半卵一次電融合法 一次融合指通過電融合同時將兩枚無核的半卵和一枚供核體細胞粘連在一起，其排列順序為：無核半卵一無核半卵—供體細胞。其具體做法：將低密度的供體細胞懸浮液先移入植物凝集素（500ug/mL PHA）操作液中，再將無核的半卵移入，進行無核半卵一無核半卵—供體細胞粘和，然后進行電融合，在穩(wěn)定電壓自動排序。譚世儉等在牛的重構胚融合，融合效率達到（95.68±3.97%）[20]。

3.2 半卵—供體—半卵二次電融合法 兩次融合指一枚無核半卵先與供體細胞融合，融合后的半卵再與另一枚無核半卵進行融合。根據Vajta等研究報道，經過兩次融合，其重構胚的融合效率達到76%。

3.3 重構胚的激活 當精子進入卵母細胞過程中，誘導卵母細胞某些化學變化而使其處于激活的狀態(tài)。激活后的卵母細胞開始胚胎發(fā)育，HCM胚胎發(fā)育也需要像精子激活卵母細胞一樣發(fā)育。2001年Vajita等人，通過電脈沖進行HMC胚胎的激活。目前激活的方法主要有化學激活和電激活，研究者常用乙醇作為HCM胚胎的激活劑，將融合后的卵母細胞置于7%乙醇的微滴中培養(yǎng)60～90min以此來激活HMC胚胎。羅光彬等采用8%乙醇處理卵母細胞10min，CB+6-DAMP處理7h，卵裂率為40%左右。Kragh等[21]利用HMC技術使用化學激活和電激活相結合的方法進行豬的體細胞核移植時，激活率為（49±1）%。

4 HCM重構胚的培養(yǎng)

激活后無透明帶卵母細胞培養(yǎng)條件不同于傳統(tǒng)的胚胎培養(yǎng)方法。它要求培養(yǎng)的條件要相對獨立，避免胚胎間相互粘連，因此無透明帶核移植重構胚需要單卵培養(yǎng)。研究者使用共培養(yǎng)或加入有利胚胎發(fā)育的生長因子的方法來進行獨立培養(yǎng)，然而其發(fā)育效果要低于群卵培養(yǎng)。許多培養(yǎng)基用于哺乳動物胚胎的培養(yǎng)，例如小鼠的胚胎可在Whitten培養(yǎng)基培養(yǎng)，Brachett and Oliphant等以BO 培養(yǎng)基作為兔子胚胎的培養(yǎng)液。合成輸卵管液（The synthetic oviduct fluid medium，mSOF）被廣泛的用于牛胚胎的培養(yǎng)。

4.1 WOW培養(yǎng)系統(tǒng) WOW培養(yǎng)系統(tǒng)（The well of the well（WOW）system）是在Vajta研究的基礎上進行改進。將毛細玻璃管頂端灼燒制成小圓玻璃球（直徑約為0.5～1mm），微熱時立即壓入細胞培養(yǎng)皿底部，利用余熱可在培養(yǎng)皿底部形成500μm以上圓形微孔。利用WOW系統(tǒng)培養(yǎng)法，Taka等[22]分別采用了內徑為500μm和1000μm的圓形微孔培養(yǎng)單精注射的豬受精卵，結果發(fā)現內徑為1000μm的WOW有較高的囊胚率（24.6%）。

4.2 微囊培養(yǎng)法 根據Adinaya等[23]報道進行改進，其制作方法：在10#的注射器內，將胚胎和海藻酸鈉溶液混合，通過推動活塞將混合的胚胎從針頭流出時，液滴被同方向的氣體吹落至含氯化鋇溶液中，發(fā)生交聯反應而形成凝膠，該方法制作的微囊直徑大約是0.5～10mm。Cosby等將無透明帶胚胎用海藻酸鈉包裹以微囊培養(yǎng)法培養(yǎng)，無透明帶胚胎囊胚發(fā)育率低于完整透明帶胚胎的囊胚發(fā)育率。

5 限制HCM操作成功的因子

5.1 不同哺乳動物最適Pronase E濃度 去除卵母細胞透明帶的方法有許多種，現階段主要用酸性臺氏液法與鏈酶蛋白（Pronase E）法。高源等報道，發(fā)現去除透明帶使用酸性臺氏液法和0.5%鏈酶蛋白酶法對小鼠早期胚胎處理兩者沒有差異。目前HCM操作使用的主要是鏈酶蛋白酶法，豬的去除透明帶Pronase E濃度是在3.3mg/ml[24]。Vajta等[25-26]以濃度為1.5～2.0mg/ml Pronase E應用在牛上。

5.2 供體細胞與受體卵母細胞的細胞周期的同步 核移植中無核的受體卵母細胞胞質內儲存大量的能量、mRNA及各種生長因子，這些物質為早期胚胎發(fā)育提供了一切必需的原料。目前哺乳動物體細胞克隆的受體胞質是MⅡ期卵母細胞。特別是供體核進入母體胞質關鍵期，胚胎發(fā)育完全依賴母源性物質，因此受體胞質質量決定著胚胎發(fā)育，然而核移植操作過程中胞質的溶液損失又是很難克服的。有研究報道發(fā)現，受體卵母細胞胞質的過多或過少，都會影響核移植重組胚的囊胚細胞數及其體外發(fā)育率。因此手工克隆切割細胞時要求盡量減少受體胞液外流。供體細胞同步化是無血清培養(yǎng)液處于G0/G1期細胞作為供體細胞核。Renard等研究表明，經過“饑餓”處理的胎兒成纖維細胞能夠獲得高的克隆成功率。

5.3 去透明帶胚胎的問題 透明帶（zona pelluccida，ZP）是一層包繞在所有哺乳動物卵母細胞外圍的非細胞糖蛋白結構，對卵子的發(fā)育、受精以及著床前胚胎發(fā)育起著關鍵性作用。正常發(fā)育的早期胚胎都有透明帶，在體內透明帶可抵御細菌，白細胞或免疫學攻擊，在體外它可以抵御培養(yǎng)基內的有毒物質及細菌。有研究報道指出，在胚胎體外培養(yǎng)條件下，透明帶不是胚胎發(fā)育至關重要的。HCM去透明帶胚胎可能會受到培養(yǎng)基內有害物質的影響，胚胎的發(fā)育受到阻滯。Elsheikhet等通過人工構建透明帶來解決這些問題。

總之，手工克隆較傳統(tǒng)核移植克隆技術操作程序要簡單，不需要昂貴的操作儀器，對克隆感興趣的任何人都可以在簡單的實驗室內操作完成。目前HCM方法獲得克隆動物還不多，但已經在具有經濟價值動物類克隆上取得了成就，豬、綿羊以及小鼠已先后用HCM克隆出。相信在未來將有更好的HCM克隆程序被應用于具有優(yōu)良基因的動物繁殖，挽救瀕危動物，以及開發(fā)具有醫(yī)藥價值的轉基因動物培育。因此哺乳動物HCM克隆將會在未來商業(yè)化規(guī)?；M程中發(fā)揮重要的作用。

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（責編：王慧晴）