楊金姬，李紅義

(武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心軍人生殖醫(yī)學(xué)科，天津 100162)

卵母細胞冷凍是輔助生殖的關(guān)鍵技術(shù)之一。卵母細胞具有體積大、表面積與體積比小、含水量高和存在減數(shù)分裂紡錘體等特點，故成熟卵母細胞是最難成功冷凍的細胞之一。與精子和胚胎冷凍相比，卵母細胞冷凍保存技術(shù)的發(fā)展較緩慢。1986年，Chen[1]首次報道，采用慢速冷凍技術(shù)將人卵母細胞進行低溫保存，解凍時將冷凍管浸入37 ℃水浴中進行快速復(fù)溫，隨后進行體外受精和胚胎移植術(shù)，成功獲得雙胎妊娠。卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)可有效解決卵母細胞冷凍過程中因卵母細胞皮質(zhì)顆粒過早釋放造成的透明帶硬化，并可避免冷凍過程對受精率的影響[2]。1997年，Porcu等[3]利用卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射作為人冷凍卵母細胞的體外受精方式，成功獲得妊娠并出生1名健康女嬰。20世紀八九十年代，人卵母細胞冷凍的研究取得了較大進展，但卵母細胞復(fù)蘇存活率仍較低，玻璃化冷凍技術(shù)的出現(xiàn)較大程度上提高了卵母細胞的復(fù)蘇存活率。1999年，Kuleshova等[4]對1名47歲女性成功實施了玻璃化冷凍卵子胚胎移植，使其成功妊娠并獲得1名健康女嬰。此后，多項研究證實，與慢速冷凍相比，玻璃化冷凍技術(shù)可使冷凍卵母細胞獲得更高的存活率和妊娠率[5-7]。2004年，意大利立法禁止進行胚胎冷凍，此措施加速了卵母細胞冷凍技術(shù)的發(fā)展[8]。2013年美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會和輔助生殖技術(shù)協(xié)會執(zhí)業(yè)委員會指出，卵母細胞冷凍-復(fù)蘇不應(yīng)再被認為是實驗性的[9]。卵母細胞冷凍技術(shù)的日趨成熟為醫(yī)學(xué)或非醫(yī)學(xué)原因希望保持生育能力的女性提供了一個新的選擇。但由于卵母細胞本身特殊結(jié)構(gòu)以及冷凍技術(shù)的差異，與新鮮卵母細胞相比，冷凍卵母細胞的臨床結(jié)局尚未達到令人滿意的效果。現(xiàn)對人卵母細胞冷凍的研究進展予以綜述。

1 卵母細胞冷凍的應(yīng)用

胚胎冷凍保存是一種非常穩(wěn)定的現(xiàn)有生育力保存技術(shù)，廣泛應(yīng)用于體外受精治療，但對于無男性伴侶或不愿使用供精者精子獲得胚胎的女性而言，則無法通過胚胎冷凍實現(xiàn)生育力保存，母細胞冷凍技術(shù)可為這部分有生育力保存愿望的女性提供新的選擇。

目前，卵母細胞冷凍主要應(yīng)用于：①面臨放療和化療的腫瘤患者以及需要預(yù)防性切除卵巢的遺傳性疾病患者，卵母細胞冷凍保存使患者疾病治愈后仍有生育可能[10]；②輔助生殖治療的需要：取卵當日男方無法提供足夠精子，可將女方卵母細胞冷凍儲存[11]；③受法律、宗教、倫理的限制而無法進行胚胎冷凍的人群[8]；④因社會因素需要延遲生育的女性，卵母細胞冷凍儲存可為其需要生育時提供幫助[12]；⑤卵巢低反應(yīng)女性可通過卵母細胞冷凍技術(shù)累積卵子。

我國《人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定：禁止單身婦女實施人類輔助生殖技術(shù)，因此目前我國卵母細胞冷凍技術(shù)主要應(yīng)用于輔助生殖治療過程，單身女性尚不能通過卵母細胞冷凍保存生育力[13]。

2 影響卵母細胞冷凍臨床結(jié)局的因素

2.1卵母細胞冷凍方法 目前，人卵母細胞冷凍主要有慢速冷凍和玻璃化冷凍兩種。慢速冷凍也稱程序化冷凍，將卵母細胞在緩沖液中短暫平衡數(shù)秒后放入含滲透性冷凍保護劑中初步脫水10 min，隨后將卵母細胞移至含滲透性和非滲透性冷凍保護劑中進一步脫水5 min，最后將其裝入冷凍載體并放入程序冷凍儀；程序化冷凍的降溫速度為0.2～2.0 ℃/min，緩慢降溫使細胞充分脫水，溫度降至-5～-7 ℃時，行人工植冰并繼續(xù)慢速降溫至-80 ℃左右，最后將冷凍麥管置于液氮中保存[14]。

早期關(guān)于成功卵母細胞冷凍的報道均采用慢速冷凍技術(shù)。慢速冷凍所用的冷凍保護劑的濃度相對較低，對卵母細胞的毒性較低，但降溫速度慢，冷凍時間較長，冷凍和復(fù)蘇過程中易形成冰晶，導(dǎo)致卵母細胞損傷，此外，慢速冷凍所需冷凍設(shè)備價格昂貴，冷凍過程對設(shè)備以及相關(guān)保障措施的要求較高。

玻璃化冷凍是將在較低濃度冷凍保護劑中平衡5～10 min后的卵母細胞轉(zhuǎn)入更高濃度冷凍保護劑中再平衡1 min，隨后將含有卵母細胞的微量冷凍保護液滴裝入冷凍載體直接投入液氮中進行保存直至使用。玻璃化冷凍利用更高濃度冷凍保護劑使卵母細胞充分脫水，通過快速降溫(降溫速率可達20 000 ℃/min)可使細胞內(nèi)外液體均達到玻璃化狀態(tài)，但不會形成冰晶。與慢速冷凍相比，玻璃化冷凍液的濃度更高，高濃度的冷凍保護劑可能對卵母細胞產(chǎn)生毒性影響，為了降低其毒性，通常采用濃度逐漸升高的冷凍液使卵母細胞逐步脫水[14]。玻璃化冷凍的操作步驟相對簡單，但需要在較短時間內(nèi)完成精細操作，對操作人員的技術(shù)要求較高，操作的熟練程度將直接影響卵母細胞存活率。

1999年，人卵母細胞玻璃化冷凍首次獲得成功，標志著卵母細胞冷凍研究取得了突破性進展[4]。據(jù)報道，玻璃化冷凍卵母細胞解凍存活率達90%～97%，體外受精率達71%～79%，移植率為17%～41%，每次移植的臨床妊娠率為 36%～61%[9]。近年來，多項研究表明，與慢速冷凍相比，玻璃化冷凍的卵母細胞存活率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均更高[15-17]。目前玻璃化冷凍已經(jīng)逐步取代慢速冷凍成為人卵母細胞冷凍的首選方法[18]。以意大利為例，2007年，玻璃化冷凍卵母細胞僅占17.8%，慢速冷凍占82.2%，而2013年，慢速冷凍卵母細胞僅占14.4%，玻璃化冷凍卵母細胞占85.6%[19]。有學(xué)者建議，仍使用慢速冷凍的實驗室，應(yīng)該考慮改用玻璃化冷凍技術(shù)進行卵母細胞冷凍[7]。

2.2女性年齡 女性年齡是影響卵母細胞冷凍臨床結(jié)局的重要因素[20-21]。無論采用何種冷凍方法，冷凍卵母細胞的臨床妊娠率和活產(chǎn)率均隨女性年齡的增長而降低[22-23]。一項回顧性研究顯示，35歲及35歲以下女性卵母細胞冷凍活產(chǎn)率為50%，而35歲以上女性卵母細胞冷凍活產(chǎn)率僅為23%；與35歲以上女性相比，35歲及35歲以下女性的累計活產(chǎn)率更高，并隨冷凍卵母細胞數(shù)量的增加，其累計活產(chǎn)率增長速度更快，當冷凍5枚卵母細胞時，35歲及35歲以下女性的累計活產(chǎn)率為15.4%，當冷凍8枚卵母細胞時，35歲及35歲以下女性的累計活產(chǎn)率可升至40.8%，由此可見，每增加1枚卵母細胞，35歲及35歲以下女性的累計活產(chǎn)率可升高8.4%，而35歲以上女性的累計活產(chǎn)率僅從冷凍5枚卵母細胞的5.1%升至冷凍8枚卵母細胞的19.9%。當冷凍卵母細胞為10～15枚時，35歲及35歲以下女性的累計活產(chǎn)率可達60.5%～85.2%，而35歲以上女性卵母細胞數(shù)增至11枚以上時，累計活產(chǎn)率為35.6%[21]。

目前，對有效冷凍保存卵母細胞的最佳年齡尚不清楚。隨著年齡的增長，女性獲卵數(shù)不斷減少，非整倍體卵母細胞數(shù)量不斷增加，故建議計劃保存生育力女性在30～35歲行卵母細胞冷凍，即在女性自然生育能力下降之前行卵母細胞冷凍[18]。

2.3卵母細胞冷凍載體 高效的卵母細胞存活率是保證卵母細胞冷凍成功的首要條件，極高的冷卻和升溫速率是卵母細胞冷凍的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，故冷凍載體的選擇極其重要。目前，大多數(shù)中心使用的卵母細胞冷凍載體為改良的吸管、毛細管和尼龍環(huán)等，此類載體一般由塑料薄膜連接到桿上，冷凍時將樣本微滴放置于薄膜片末端，將其直接浸入液氮，再使用管狀封套封閉裝載樣本的另一端，可在一定程度上保護樣本，但冷凍樣本仍與液氮長期直接接觸，故稱為“開放系統(tǒng)”。開放式載體的冷卻速率(>20 000 ℃/min)極高，使卵母細胞的存活率較高，但卵母細胞直接暴露于未經(jīng)消毒的液氮中，存在交叉污染的風(fēng)險[15]。目前尚未有開放式載體相關(guān)傳染性疾病擴散的報道，但污染風(fēng)險可隨卵母細胞存儲時間的延長而增加。為了避免交叉污染，另一種“封閉系統(tǒng)”應(yīng)運而生。封閉式載體在樣品和液氮之間提供了一個物理屏障，在理論上提高了生物安全性。但與開放式載體相比，封閉式載體的冷卻/復(fù)溫速率相對較慢，冷凍效果不佳[24]。另有學(xué)者認為，玻璃化冷凍卵母細胞的存活率主要受復(fù)溫速率的影響，提高封閉式載體的復(fù)溫速率也可獲得較好的冷凍效果[25-26]。

開放式和封閉式載體各有優(yōu)缺點，有關(guān)最適合卵母細胞冷凍的載體形式目前尚無定論。有學(xué)者建議通過以下3種方法降低卵母細胞冷凍儲存過程中可能發(fā)生污染的風(fēng)險：①使用經(jīng)紫外線消毒的液氮；②儲存于液氮的氣相中，液氮氣相中環(huán)境空氣污染物的濃度較低；③使用無菌空氣[27]。

2.4卵母細胞成熟度 GV期、MⅠ期卵母細胞為不成熟卵母細胞，MⅡ期卵母細胞為成熟卵母細胞，目前文獻報道的成功案例絕大多數(shù)為MⅡ期的成熟卵母細胞，而未成熟卵母細胞冷凍成功妊娠的報道較少[28-29]。未成熟卵母細胞易獲得且數(shù)量多，其細胞染色體仍處于核內(nèi)，尚未形成易受冷凍損傷的紡錘體，且未成熟卵母細胞的胞膜通透性可能優(yōu)于MⅡ期卵母細胞，因此理論上未成熟卵母細胞冷凍更具優(yōu)勢。但目前未成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)尚不成熟，未成熟卵母細胞解凍后體外培養(yǎng)的成熟率、受精率及妊娠率均較低，多數(shù)研究認為，將GV和MⅠ期未成熟卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)后，再行玻璃化冷凍的效果可能更好[30-31]。

2.5卵母細胞冷凍保存時間 目前，關(guān)于人卵母細胞冷凍保存時限尚無定論，Urquiza等[32]采用慢速冷凍技術(shù)保存了1名24歲不孕患者的6枚成熟卵母細胞，14.5年后經(jīng)患者要求將卵母細胞解凍，其中只有2枚卵母細胞存活，卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射后只有1枚卵母細胞正常受精，胚胎移植后成功獲得妊娠，并足月分娩1名健康女嬰，這是目前報道的儲存時間最長并獲得活產(chǎn)的案例。

卵母細胞玻璃化冷凍的應(yīng)用相對較晚，儲存時間對其臨床結(jié)局影響的報告尚不多。一項大型回顧性研究顯示，超過4.2萬個卵母細胞在玻璃化冷凍6個月以內(nèi)、6～12個月、12～18個月、18～24個月、24～36個月、36～48個月, 48～60個月、60個月以上8種不同儲存時長的存活率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義[33]。有數(shù)據(jù)顯示，卵母細胞較長時間的冷凍保存似乎不會對臨床結(jié)局產(chǎn)生不利影響，但卵母細胞在液氮罐中長期儲存卻存在一定風(fēng)險[34]。因此，每個中心都應(yīng)該安裝儲罐報警系統(tǒng)，并制定應(yīng)急計劃，以應(yīng)對儲罐破裂等突發(fā)事件，減少儲存材料損失。

3 卵母細胞冷凍損傷

由于卵母細胞體積大、含水量高以及其特殊的細胞內(nèi)含物和結(jié)構(gòu)，其對低溫特別敏感，易發(fā)生冷凍損傷。溫度驟降會導(dǎo)致卵母細胞的溫度敏感結(jié)構(gòu)發(fā)生冷休克，影響其功能，如改變膜的通透性或破壞細胞內(nèi)的細胞器[35]。有研究證實,不管是采用何種冷凍技術(shù)，冷凍卵母細胞2/3的皮質(zhì)顆粒均發(fā)生釋放，皮質(zhì)顆粒非生理性釋放導(dǎo)致卵母細胞透明帶過早硬化，影響正常受精[36-37]。為避免冷凍卵母細胞受精失敗，可選擇胞質(zhì)內(nèi)單精子注射作為冷凍卵母細胞的體外授精方式。此外，減數(shù)分裂紡錘體對溫度也極其敏感，即使卵母細胞在室溫下短暫暴露，也會造成紡錘體結(jié)構(gòu)的不可逆破壞，當溫度降到0 ℃時，則發(fā)生快速去極化[38]。在冷凍過程中，將卵母細胞暴露于冷凍保護劑中，紡錘體的結(jié)構(gòu)可能保留下來，但在解凍過程中紡錘體的結(jié)構(gòu)完全喪失[39-40]。進一步研究證實，低溫保存紡錘體可使其恢復(fù)重新組裝的能力[41]。紡錘體微管的重新組裝是受精后染色體正確排列和分離的必要條件。卵母細胞減數(shù)分裂紡錘體的破壞可能導(dǎo)致非整倍體胚胎發(fā)生，但這一假說尚未得到證實。有研究顯示，慢速冷凍和玻璃化冷凍技術(shù)處理的冷凍卵母細胞胚胎中均未觀察到非整倍體率的增加[42]。降低卵母細胞冷凍損傷以及提高卵母細胞冷凍的安全性是目前卵母細胞冷凍研究的熱點之一。

4 冷凍卵母細胞子代的安全性

與其他輔助生殖技術(shù)一樣，冷凍卵母細胞子代的安全性亦非常重要。Noyes等[43]對1986—2008年936名卵母細胞冷凍出生嬰兒(包括慢速和玻璃化)資料的回顧分析發(fā)現(xiàn)，1.3%(12/936)存在出生異常，與同期自然受孕分娩嬰兒相比，兩者出生缺陷率無明顯差異。Cobo等[44]比較玻璃化冷凍卵母細胞出生的804名嬰兒與新鮮卵母細胞出生的996名嬰兒相關(guān)數(shù)據(jù)的研究發(fā)現(xiàn)，兩者的孕期并發(fā)癥、出生體重、Apgar評分、新生兒出生缺陷、重癥監(jiān)護室住院率及病死率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，Levi-Setti等[19]的大樣本研究結(jié)果與此類似。已有證據(jù)表明，卵母細胞冷凍保存與產(chǎn)科和圍生期并發(fā)癥的增加無關(guān)，但尚缺乏長期隨訪研究的支持，臨床應(yīng)用仍需謹慎。

5 結(jié) 語

20世紀80年代，人卵母細胞冷凍取得了第一次成功，隨后，玻璃化冷凍技術(shù)的出現(xiàn)大大改善了人卵母細胞冷凍的臨床結(jié)局。目前，卵母細胞冷凍已成為保存女性生育力的重要方法，并已廣泛應(yīng)用于臨床，但由于卵母細胞本身特殊結(jié)構(gòu)和冷凍技術(shù)的差異，卵母細胞冷凍的臨床結(jié)局仍未獲得令人滿意的一致結(jié)果。冷凍技術(shù)的標準化和(或)自動化是未來卵母細胞冷凍技術(shù)的研究重點，期待相關(guān)研究取得更大進展，以提高卵母細胞冷凍的一致性及效率。