郭愛玲，寧慧娟，秦子芳，譚曉妍，苗雨欣，張秀清*

（1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 529156；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

靈芝（Ganoderma lucidum），在中國古代被稱為“仙草”或“瑞草”，隸屬于真菌門（Eumycota）擔子菌亞門 （Basidiomycotina）層菌綱 （Hymenomycetes）非褶菌目 （Aphyllophorales）靈芝菌科（Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma），具有獨特的藥用和保健價值[1]。

靈芝多糖是靈芝的重要化學成分和主要的生理活性成分，目前國內外關于靈芝的大量研究表明，靈芝多糖具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、免疫調節(jié)等多種作用[2－5]，其多糖含量的高低可以作為靈芝質量評價指標之一[6]。靈芝多糖的生物活性與多糖的種類、單糖的組成和多糖分子量范圍等有關[7]。倪力軍等[8]研究了8種中藥材的多糖組成與活性，發(fā)現(xiàn)8種中藥材多糖的單糖組成和含量具有較大差異，單糖組成與體外抗氧化活性之間存在較強的整體相關性。徐雪峰等[9]從赤靈芝多糖分離純化得到的GLPa-2（365 kDa）、GLPb-1 （39 kDa）、GLPc（14 kDa）3個組分，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖組成，分子量最大的GLPa-2抗氧化活性最佳，表明赤靈芝多糖的抗氧化活性與其組成相關。

由于野生靈芝有限，20世紀60年代，我國開始著手靈芝人工栽培。早期的栽培方式以段木栽培為主，之后以木屑為基質進行瓶栽和袋栽，目前大多利用短段木進行栽培[10]。通過比較大段木、小段木和袋料靈芝栽培方式靈芝多糖的含量、單糖組成和分子量的差異，旨在為進一步探究不同靈芝栽培方式下靈芝多糖的生理學活性和藥理價值奠定理論基礎，為靈芝的合理栽培和適時采收提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：赤靈芝子實體由天方?。ㄖ袊┧帢I(yè)有限公司提供，大段木靈芝采收于安徽省大別山種植基地；小段木靈芝采收于安徽省金寨種植基地；袋料靈芝采收于山東冠縣種植基地，靈芝放入烘箱經(jīng)60℃烘干（水分含量＜17%），樣品粉碎后過24目篩，備用。

試劑：葡聚糖（Dextran系列）標準品，美國Sigma公司；蒽酮，北京藍弋化工產(chǎn)品有限責任公司；D-葡萄糖、L-阿拉伯糖等8種單糖標準品（純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），美國Sigma公司；三氟乙酸（TFA），北京化學試劑公司；其他試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200高效液相色譜儀，安捷倫公司；LC-20A液相色譜儀，島津公司；HHSY21-NY電熱恒溫水浴鍋，北京長風儀器儀表公司；BS200S電子天平，北京賽多利斯天平公司；DHG-9240A鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；TG16-WS高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；TM-1901型雙光束紫外可見光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；RE52AA旋轉蒸發(fā)器，上海振捷實驗設備有限公司；TYS-100高速多功能粉碎機，永康市紅太陽機電有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 靈芝多糖的制備和測定

采用蒽酮-硫酸法[11]。稱取2.000 g過24目篩的靈芝粉末，置于100 mL圓底燒瓶中，加去離子水60 mL靜置1 h，沸水加熱回流4 h，趁熱過濾，用少量去離子水洗滌濾器和濾渣，將濾渣和濾紙置燒瓶中，加去離子水60 mL，加熱回流3 h，趁熱濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣用5 mL去離子水溶解，邊攪拌邊緩慢滴加95%乙醇75 mL，搖勻，在4℃放置12 h，8 000 r·min-1離心10 min，取沉淀烘干即為靈芝多糖樣品。靈芝多糖樣品用去離子水溶解并轉移至50 mL容量瓶中，定容至刻度。取適量溶液，離心，精密量取上清液3 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。

標準曲線的繪制：精密稱取無水葡萄糖對照品0.120 g，用去離子水定容至1 L。精密稱取蒽酮0.250 g，加硫酸250 mL使其溶解，搖勻。精密量取無水葡萄糖溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于20 mL具塞試管中，各加去離子水使其體積為2.0 mL，再加入硫酸蒽酮溶液6 mL，搖勻，室溫放置15 min后，置冰水浴中冷卻15 min后取出，在625 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水為空白試驗對照。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

靈芝樣品多糖含量的測定：精密量取靈芝多糖溶液1 mL，置于20 mL具塞試管中，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，在625 nm波長處測定吸光度，按照標準曲線回歸方程計算靈芝多糖樣品中多糖的含量。按干燥品計算，靈芝多糖含量以無水葡萄糖（C6H12O6）計。

1.3.2 靈芝多糖分子量測定

采用凝膠滲透色譜法（Gel Permeation Chromatography，GPC）測定多糖分子量。色譜條件如下：色譜儀：Agilent 1200；檢測器：示差折光檢測器；色譜柱：Agilent PL aquageL-OH MIXED-M、300 nm×8 μm；流動相：0.1 mol·L-1的硝酸鈉溶液；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

標準曲線的制作與樣品測定：將分子量分別為180 Da、9 kDa、30 kDa、300 kDa、2 000 kDa 的Dextran標準品用0.1 mol·L-1的硝酸鈉水溶液溶解，靈芝多糖用蒸餾水溶解（濃度為0.5 mg·mL-1），過0.22 μm的濾膜[12]，依次進樣。以保留時間為橫坐標，標準品的相對分子質量對數(shù)（lgMw）為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算靈芝多糖樣品分子量。

1.3.3 靈芝多糖的單糖組成測定

靈芝多糖的水解：分別稱取干燥后靈芝多糖樣品各 10 mg，加入 2 mL濃度 2 mol·L-1三氟乙酸（TFA）于10 mL消解管中，擰緊管口，置于105℃的烘箱中反應6 h，擰開管口，烘干，向消解管中加入500 μL無水甲醇，再次烘干，重復3次，使殘留的TFA揮發(fā)，加入3 mL去離子水復溶。

單糖衍生化：取1 mL的單糖標準溶液（0.1 mol·L-1）或多糖水解液，置于10 mL離心管中，依次加入 0.3 mol·L-1的 NaOH 溶液 600 μL，0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液600 μL，使用渦漩振蕩器混勻，70℃水浴條件下反應2 h（期間每隔15 min振蕩混勻1次），反應結束后取出，冷卻至室溫。加入0.3 mol·L-1的HCl溶液600 μL，混勻中和反應體系，再加入1 mL的三氯甲烷溶液充分振蕩，靜置，棄下層有機相，重復萃取5次，取上層水相，過0.22 μm的濾膜，進行HPLC檢測[13-14]，色譜條件為：色譜儀：島津LC-20A高效液相色譜儀；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：250 nm；流動相：20 mmol·L-1磷酸緩沖溶液（pH 6.7）-乙腈=82:18；流速：1 mL·min-1；色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS Statistics 22進行單因素方差分析，并采用LSD法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同栽培方式靈芝多糖含量

靈芝多糖含量測定結果如圖1所示。

圖1 不同栽培方式靈芝多糖含量Fig.1 The polysaccharides content of Ganoderma lucidum by different cultivation methods

不同栽培方式靈芝多糖含量由高到低依次為大段木靈芝>小段木靈芝>袋料靈芝，多糖含量分別為14.67 mg·g-1，11.96 mg·g-1，5.35 mg·g-1，通過 SPSS統(tǒng)計分析可得，3種栽培方式靈芝多糖含量之間存在極顯著的差異（P<0.01）。袁學軍等[15]研究了不同栽培方式對靈芝活性成分的影響，顯示椰糠栽培的靈芝多糖含量最高，仿野生栽培的其次，表明靈芝多糖的含量與栽培基質有直接關系。閆梅霞[16]測定了吉林地區(qū)不同基質（木屑和段木）栽培的松杉靈芝多糖含量，結果表明段木基質大棚下栽培的靈芝多糖含量較高。靈芝多糖是靈芝重要的活性成分，其含量是判斷靈芝質量高低的指標。本文的研究也表明大段木栽培靈芝多糖含量最高。

2.2 不同栽培方式靈芝多糖分子量

不同栽培方式靈芝多糖的分子量和組分含量存在差異，如表1所示。

表1 不同栽培方式靈芝多糖分子量Tab.1 Molecular weight of Ganoderma lucidum polysaccharides by different cultivation methods

大段木靈芝多糖組分不均一，2個組分的分子量為4 688 kDa和10 kDa，峰面積占比分別為88.5%和11.5%；小段木靈芝多糖組分不均一，主要多糖組分分子量為2 462 kDa，峰面積占比為85.6%，次要多糖組分分子量約為7 kDa；袋料靈芝多糖組分均一，分子量為105 kDa。研究顯示靈芝多糖具有抗腫瘤等藥理活性，Zhang等[17]從靈芝中分離純化出1種靈芝多糖GLIS（分子量為2 000 kDa左右），試驗證明該靈芝多糖能選擇性刺激B細胞，增強免疫球蛋白的產(chǎn)生，還可以刺激小鼠的巨噬細胞分泌活性物質[18]，具有增強機體免疫力和抗腫瘤的藥理活性。本研究從大段木靈芝中提取的靈芝多糖分子量較大，推測其可能具有相應的藥理活性。

2.3 不同栽培方式單糖組成

不同栽培方式靈芝多糖的單糖種類和比例存在差異，如圖2所示。

從圖2和表2看出，大段木靈芝多糖主要由葡萄糖、木糖、巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖和甘露糖8種單糖組成，其摩爾比為19.62∶3.80∶3.00∶1.95∶1.83∶1.07∶1.06∶1.00，其中葡萄糖為主要成分，含量為58.87%；小段木靈芝多糖含有5種單糖，阿拉伯糖含量（28.75%）最高，其次是木糖（23.59%）和鼠李糖（21.80%）；袋料靈芝多糖由7種單糖組成，其中葡萄糖的含量最高，半乳糖和阿拉伯糖的含量也較高。

前期研究表明，木糖有助于提高多糖的抗氧化活性[19]，王海燕等[20]從赤靈芝子實體提取多糖經(jīng)分離純化得到3個多糖級分GLMP1（462 kDa）、GLMP2（65 kDa）和GLMP3（6 kDa），多糖的單糖摩爾比各異，其中分子最大的GLMP1中單糖組成種類更多，試驗表明高生物活性的木糖含量越高，相關的抗氧化活性也越高。本研究中3種栽培方式中大段木栽培靈芝多糖的單糖組成種類最多，木糖含量較高，推測其可能具有更高的生理活性。

圖2 不同栽培方式靈芝多糖單糖組成HPLC色譜圖Fig.2 Monosaccharide composition of Ganoderma lucidum polysaccharides from different cultivation methods by HPLC chromatogram

表2 不同栽培方式靈芝多糖的單糖組成Tab.2 Monosaccharide composition of Ganoderma lucidum polysaccharides by different cultivation methods

3 結論

本試驗研究表明不同栽培方式靈芝多糖的含量、分子量和單糖組成存在差異。大段木靈芝多糖含量最高，為14.67 mg·g-1。大段木栽培靈芝含有2個不同分子量段的多糖，分子量最高達4 688 kDa，小段木靈芝多糖主要成分分子量為2 462 kDa，袋料靈芝多糖分子量為105 kDa。單糖組成方面，大段木靈芝多糖含8種單糖，葡萄糖、木糖和巖藻糖的含量較高，與甘露糖的摩爾比為 19.62∶3.80∶3.00∶1.00，小段木靈芝多糖含5種單糖，袋料靈芝多糖含7種單糖。綜合各方面，本試驗研究顯示大段木栽培靈芝的多糖含量最高，分子量最高，單糖組成更豐富，推測其可能具有更高的生理活性，為不同栽培方式靈芝多糖的選擇和應用提供了基礎。

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