寧蕾，王曙光，琚鵬舉，柏星軒，葛林豪，齊欣，姜奇彥，孫現(xiàn)軍，陳明，孫黛珍

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過表達谷子對水稻耐鹽性的影響

寧蕾1，王曙光1，琚鵬舉1，柏星軒1，葛林豪2，齊欣2，姜奇彥2，孫現(xiàn)軍2，陳明2，孫黛珍1

（1山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷 030800；2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081）

【目的】高鹽脅迫是影響作物產(chǎn)量的主要因素之一，谷子（L.）具有耐逆性強的特點，從谷子中篩選耐鹽基因?qū)τ诶没蚬こ痰氖侄闻嘤望}作物新品種具有重要意義?！痉椒ā糠治龉茸覣P2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子類基因在豫谷一號幼苗期在高鹽、低氮、PEG模擬干旱處理條件下的表達模式；進而利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將轉(zhuǎn)入模式作物水稻品種Kitaake；分別用0.9% 鹽水和自來水浸泡過表達水稻和野生型Kitaake的種子，觀察其萌芽期的表型并統(tǒng)計發(fā)芽率；用含0.9% NaCl的Hogland營養(yǎng)液室內(nèi)處理水稻幼苗10 d，65℃烘48 h之后稱量干重；同時將其種植在大田，在水稻孕穗前用0.9%鹽水灌溉一次，統(tǒng)計成熟后過表達水稻各株系和野生型的單株籽粒重、株高、單株分蘗數(shù)，對其耐鹽性進行評價；利用定量Real time-PCR方法，驗證分析轉(zhuǎn)基因水稻株系中及其可能的下游基因的相對表達情況?！窘Y(jié)果】谷子SiANT1蛋白（XP004985124.1，SiANT1）屬于AP2亞族，與高粱（XP021318293.1，SbANT1）和玉米（XP008658933.1，ZmAP2）親緣關系較近；豫谷一號中的表達受高鹽脅迫（100 mmol·L-1NaCl）誘導；將和LP047 1118-Bar-ubi-EDLL載體連接，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將轉(zhuǎn)入到水稻基因組中，篩選得陽性T0植株，繁殖兩代得T3代種子；自來水浸泡下，過表達水稻種子萌發(fā)率和野生型相差不大，萌芽率為90%以上；0.9%鹽水浸泡下，過表達水稻種子萌發(fā)明顯受到抑制，與野生型相比，過表達水稻種子露白推遲，但最終（處理120 h）萌芽率達到80%以上；室內(nèi)水稻苗期用0.9% NaCl處理后，過表達水稻的單株干重較受體Kitaake增重14.11%—37.42%，在1%水平上呈顯著差異；大田水稻成熟后過表達株系單株籽粒重較受體Kitaake增產(chǎn)56.12%—76.58%，在5%水平上呈顯著差異，單株分蘗數(shù)增多、株高增加，但與野生型無顯著差異；半定量RT-PCR分析表明，過表達的3個水稻株系都在RNA水平上表達；定量Real time-PCR結(jié)果表明，過表達的3個水稻株系間的相對表達量有所差異，但較受體而言，都極顯著增加，并且其內(nèi)源耐鹽相關基因和的相對表達量分別較受體提高1.1—1.7倍和1.6—2.3倍。【結(jié)論】和是耐鹽相關基因已被證實，具有一定的耐鹽性，過表達水稻可能是通過增加下游基因和的表達從而提高耐鹽性。

谷子；；AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子；耐鹽性；耐鹽脅迫相關基因

0 引言

【研究意義】植物在生長發(fā)育過程中不可避免的會受到干旱、高溫、土壤鹽堿化等非生物脅迫因素的影響，其中鹽脅迫是影響作物生長發(fā)育并最終導致減產(chǎn)的主要因素之一[1]。植物為了減少土壤中高鹽離子濃度脅迫對自身造成的傷害，通過感知環(huán)境中離子濃度變化，精確調(diào)控相關基因表達，產(chǎn)生一系列的應答反應以應對鹽脅迫。逆境脅迫誘導的相關基因表達主要通過轉(zhuǎn)錄因子進行調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子抑制或激活逆境脅迫相關基因的表達是植物響應逆境脅迫的重要過程[1]。谷子起源于中國，是耐貧瘠、抗逆性強的單子葉作物，已成為研究單子葉作物抗逆機制的重要材料[2]，因此，研究谷子相關抗逆基因的功能對于篩選優(yōu)良抗逆基因用于作物抗逆遺傳改良具有重要意義。【前人研究進展】AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的主要特征是蛋白序列中含有一個高度保守的58或59個氨基酸的AP2結(jié)構域[3]。Sakuma等[4]根據(jù)AP2/ERF結(jié)構域?qū)M南芥基因組中的AP2/ERF類蛋白分為5個亞家族，分別為AP2、RAV、DREB、ERF亞家族及一個特異蛋白AL079349[5]。作為蛋白質(zhì)，AP2亞家族調(diào)節(jié)生長發(fā)育系統(tǒng)中的糖含量，并且涉及運輸、信號傳遞[6]。擬南芥AP2類蛋白在花發(fā)育的ABC模型中起著重要的作用，其中ANT（AINTEGUMENTA）類轉(zhuǎn)錄因子，是植物特有的一類DNA結(jié)合蛋白，由與乙烯應答元件結(jié)合的2個AP2結(jié)構域組成[7]，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因的表達。ANT類基因是器官生長的關鍵調(diào)節(jié)劑，參與胚珠發(fā)育、花器官生長發(fā)育和器官大小的調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的過程中起著非常重要的作用[7-12]。擬南芥突變體顯示多效的作用，包括減少花器官和葉子的大小[7-8,11]，過表達導致細胞增殖的持續(xù)時間增加，并增大葉、花和長角果中的器官[11]。在擬南芥轉(zhuǎn)錄因子RAV1中，N端AP2結(jié)構域結(jié)合5′-CAACA-3′序列，而C端高度保守的B3結(jié)構域結(jié)合5′-CACCTG-3′序列[13]，參與響應生物脅迫和非生物脅迫[14]。DREB亞家族成員可以識別干旱和冷誘導響應元件（DRE/ CRT，A/GCCGAC），在植物抵抗非生物脅迫過程中起著非常重要的作用[15-16]，如水稻顯著影響轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性[17]。ERF亞家族成員能識別GCC盒（AGCCGCC）[18]，在水稻中過表達增加了其對鹽脅迫的敏感性[19]，水稻ERF轉(zhuǎn)錄因子OsERF922負調(diào)控稻瘟病菌的耐藥性和耐鹽性[20]。從谷子中克隆到ABA響應DREB（脫水響應元件結(jié)合）蛋白基因，谷子過表達增強了抗旱性，擬南芥組成型表達增強了其種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育期的抗旱性和耐鹽性[21]。目前關于谷子耐旱性的報道，還有NAC類基因等，如谷子轉(zhuǎn)錄因子SiNAC18通過ABA信號途徑正向調(diào)控干旱條件下的種子萌發(fā)[22]。在功能標記開發(fā)方面，谷子受激素誘導表達、參與器官大小控制的基因，從其啟動子區(qū)開發(fā)的SSR標記AP-2，可用于谷子穗重和穗粒重等產(chǎn)量性狀相關優(yōu)異等位變異的鑒定和篩選[23]?！颈狙芯壳腥朦c】中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所馬有志課題組從谷子品種豫谷一號中克隆ANT類轉(zhuǎn)錄因子基因（Si034722m.g，XP 004985124.1），位于第9染色體，全長4 196 bp，包含相間分布的6個外顯子和5個內(nèi)含子，cDNA序列長1 863 bp，編碼620個氨基酸，蛋白質(zhì)等電點為6.82，分子量為66.86 kD，該蛋白有2個AP2的DNA結(jié)合區(qū)，分別在280—346和382—440區(qū)域，長度為67個和59個氨基酸，即有一個ANT結(jié)構域。目前，關于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長發(fā)育和增強抗逆性的報道較多，而ANT類轉(zhuǎn)錄因子是否參與植物脅迫響應過程，尚不清楚?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過在水稻中過表達，分析過表達水稻與野生型水稻分別在萌芽期、室內(nèi)苗期、田間成熟期經(jīng)0.9%NaCl處理后的表型及部分農(nóng)藝性狀的差異，確定過表達提高了水稻的耐鹽性，進一步通過分子試驗驗證其可能的耐鹽過程。

1 材料與方法

1.1 谷子SiANT1的分析及進化樹構建

使用生物信息學工具、在線網(wǎng)站Phytozome（https:// phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）分析在search in搜索框中選中，并且keywords搜索框中輸入序列號Si034722m.g，查找到基因組序列、CDS序列、蛋白質(zhì)序列，2個AP2結(jié)構域的位置。使用DNAMAN軟件查詢該蛋白分子量大并預測等電點。在NCBI（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/）中的Protein blast比對該蛋白序列，下載比對結(jié)果中同源性較高并含有ERF、AP2、DREB、RAV結(jié)構域的蛋白序列，用MEGA6軟件打開蛋白序列并使用Neighbor- joining方法構建進化樹。

1.2 不同脅迫條件下谷子幼苗中SiANT1的表達分析

將豫谷一號種子（由山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院孫黛珍課題組贈送）25℃清水浸泡4 d后（每天換2次水）移栽至配制的營養(yǎng)土（營養(yǎng)土﹕蛭石=2﹕1）中，置于地下溫室（22℃，相對濕度65%、光照周期16 h/8 h）培養(yǎng)2周，然后取生長健康并且大小一致的幼苗分別用100 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)液、0.2 μmol·L-1低氮培養(yǎng)液、10% PEG培養(yǎng)液進行脅迫處理，并于處理后的0、1、6、12、24和48 h分別取樣，液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用RNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過NCBI的Primer Blast設計和引物（F：5′-CAAGTCT GGTGGCGTCAACT-3′，R：5′-AAAGGGAGG TGGGAAACGAC-3′；-F：5′-GGCAAACAGGGA GAAGATGA-3′，-R：5′-GAGGTTGTCGGTAAG GTCACG-3′）。反應體系為10 μl 2×Super Mix、0.5 μl 50×reference Dye Ⅱ、正反向引物各0.5 μl、7.5μl ddH2O和1μl cDNA。采用三步法反應程序：95℃ 15 min；95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃ 32 s后收集熒光信號，40個循環(huán)。Real-time PCR使用Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒，ABI7500進行擴增。采用2-△△Ct法根據(jù)各樣品在特定熒光閾值下的Ct值計算基因在不同樣品中的相對表達量。

1.3 谷子SiANT1的表達載體構建及水稻的遺傳轉(zhuǎn)化

使用HⅠ酶切體系將適量LP047 1118-Bar- ubi-EDLL載體質(zhì)粒30℃恒溫酶切5 h以上，以豫谷一號的cDNA為模板，設計引物進行擴增含有HⅠ接頭的CDS序列。用In-Fusion連接法將上述2個片段連接（50℃、20 min），轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌感受態(tài)，篩選陽性克隆測序。使用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，在農(nóng)桿菌感受態(tài)中加入1.5 μl上述質(zhì)粒，冰浴45 min，液氮中速凍1 min，并在37℃恒溫水浴3 min。加800 μl的LB，28℃，200 r/min，培養(yǎng)3 h。涂于含利福平（50 mg·L-1）和卡那霉素（50 mg·L-1）的LB固體培養(yǎng)基上。篩選陽性菌落測序。按照蔗糖﹕siwet=5%﹕0.03%（v/v）配制農(nóng)桿菌懸浮液。取5 μl的陽性菌液與1.5 mlLB液體培養(yǎng)基（含50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素）混合，28℃ 250 r/min培養(yǎng)10—12 h。按1﹕100轉(zhuǎn)移到三角瓶中。培養(yǎng)至OD600=0.6—0.8，6 000 r/min室溫離心15 mim。再用懸浮液懸浮菌液調(diào)至OD600=0.8，用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法[22]，將剝?nèi)さ乃境墒旆N子消毒、洗凈后，利用組織培養(yǎng)的方法，經(jīng)過誘導培養(yǎng)基-繼代培養(yǎng)基-共培養(yǎng)培養(yǎng)基-選擇培養(yǎng)基-生根培養(yǎng)基-移植到花盆，得到T0代植株，繁種后收獲T1種子，本研究過表達水稻是T3代種子。

1.4 過表達SiANT1水稻的耐鹽性鑒定

1.4.1 萌芽期鹽處理試驗 用濃度為0.9%的NaCl溶液分別浸泡過表達水稻3個株系及野生型Kitaake種子，各50粒。同時設空白對照，自來水浸泡上述種子。期間每天換2次相應溶液，直至0.9%的NaCl溶液處理的水稻開始露白，統(tǒng)計發(fā)芽率，每隔12 h統(tǒng)計1次，取5個時間點，并拍照記錄相應差異。

1.4.2 培養(yǎng)室內(nèi)水稻鹽處理 將過表達水稻各株系及受體發(fā)芽至5 cm左右移至多孔板上，每個株系40株，Hogland營養(yǎng)液培養(yǎng)10 d，之后用含有0.9%NaCl的Hogland營養(yǎng)液培養(yǎng)10 d，將各株系每5株烘干稱重、重復3組并記錄數(shù)據(jù)。試驗于2016年在中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所品種資源樓進行。

1.4.3 田間水稻鹽處理 2016年在河北唐海自然鹽堿地上進行耐鹽性鑒定，土壤鹽堿度相對均勻。每個株系20粒種子，旱播，待水稻苗長到30 cm左右開始灌水（60 d），在水稻孕穗前進行一次鹽處理，正常水（545 μs·cm-1）﹕海水（59 ms·cm-1）=4﹕1，約為0.9% NaCl濃度，處理后，同一地塊鹽堿度提高。待水稻成熟后調(diào)查水稻籽粒產(chǎn)量，評價轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽能力，篩選耐鹽株系。每個株系收取5株，統(tǒng)計每株的單株分蘗數(shù)、株高、單株籽粒重，篩除各株系極端值，即每個株系統(tǒng)計3株。

1.5 谷子SiANT1及可能的下游基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達分析

將過表達水稻株系和野生型Kitaake種子在30℃條件下，用清水浸泡3 d后（每天換2次水），移至截去底部的96孔板上，置于22℃、相對濕度65%、光照周期16 h/8 h的溫室水培至三葉一心期，取生長健康且大小一致的幼苗，液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆?。過表達水稻和野生型Kitaake種子均來自于中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所馬有志課題組。

在DNA水平上檢測過表達水稻各株系是否屬于陽性。設計水稻（F：5′-GAAGATCA CTGCCTTGCTCC-3′，R：5′-CGATAACAGCTCCTC TTGGC-3′[25]）和的RT-PCR引物。利用半定量RT-PCR的方法檢測過表達水稻的3個株系是否在RNA水平上表達，進一步做Real time-PCR確定3個株系間相對表達量是否有差異。

通過在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找相關的鹽脅迫基因并下載相應CDS序列（salt overly sensitive 1、protein kinase complex、calcium sensing protein、cation transporter、mitogen-activated protein kinases、zinc finger protein等），設計引物進行Real-time PCR分析，明確過表達水稻與受體Kitaake中的上述鹽脅迫相關內(nèi)源基因的相對表達情況。

2 結(jié)果

2.1 谷子SiANT1蛋白與AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子各亞族間親緣關系

谷子全長4 196 bp，CDS長為1 863 bp，編碼620個氨基酸，蛋白質(zhì)等電點為6.82，分子量為66.86 kD，該蛋白有2個AP2的DNA結(jié)合區(qū)，分別在280—346和382—440區(qū)域，長度為67個和59個氨基酸，即有一個ANT結(jié)構域。

利用MEGA6軟件分析谷子SiANT1蛋白在AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子各亞族間的進化位置結(jié)果表明，水稻、小麥、玉米、高粱、谷子的AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子分為DREB、ERF、AP2、RAV等4個亞族（圖1），其中DREB亞族和ERF亞族之間親緣關系較近。谷子SiANT1蛋白（XP004985124.1，SiANT1）屬于AP2亞族，與高粱（XP021318293.1，SbANT1）和玉米（XP008658933.1，ZmAP2）親緣關系較近。

2.2 逆境脅迫下谷子SiANT1的表達模式

通過對100 mmol·L-1NaCl、0.2 μmol·L-1低氮、10% PEG處理的豫谷一號幼苗進行實時熒光定量PCR分析，結(jié)果表明，在100 mmol·L-1NaCl處理下（圖2-A），與對照相比，谷子在1和6 h時的表達量明顯下降，在12 h時的表達量顯著上升，在24 h時的表達量達到100倍以上，之后在48 h谷子的表達量明顯下降，說明谷子受到高鹽脅迫誘導上調(diào)表達。在0.2 μmol·L-1低氮（LN）處理下（圖2-B），與對照相比，谷子在1 h時表達量有所下降，在6 h時表達量達到1.5倍，之后12和48 h下降明顯，并且24 h之后表達量幾乎不變。在10%PEG處理下（圖2-C），與對照相比，谷子表達量在1 h時明顯下降，6 h稍微上升，但仍遠低于0 h，12 h之后相對表達量幾乎不隨處理時間變化，說明在10%PEG6000條件下表達下調(diào)。

圖1 利用部分植物AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子構建的進化樹

** 在0.01水平上差異顯著（n=3）；***在0.001水平上差異顯著（n=3）。下同

** indicates significantly different at 0.01 level (n = 3); *** indicates significantly different at 0.001 level (n =3). The same as below

圖2 不同脅迫處理三葉一心期豫谷一號后的相對表達量

Fig. 2 The expression profile ofgene in Yugu 1 under various stresses conditions including 100 mmol·L-1NaCl, 0.2 μmol·L-1LN, 10% PEG6000

2.3 谷子SiANT1的表達載體構建與水稻遺傳轉(zhuǎn)化

經(jīng)過HⅠ酶切的基因和LP047 1118-Bar-ubi-EDLL載體連接，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因片段轉(zhuǎn)移到水稻的基因組中，通過組織培養(yǎng)最終篩選過表達水稻陽性T0植株，進而繁殖兩代得到T3代種子。

圖3 LP047 1118-Bar-ubi-EDLL載體的T-DNA區(qū)段

2.4 過表達SiANT1水稻株系的鑒定與表現(xiàn)

2.4.1 過表達水稻各株系萌芽期表型及發(fā)芽率 通過對0.9%NaCl處理后的種子發(fā)芽率進行統(tǒng)計。0.9%NaCl處理66 h時，野生型Kitaake的發(fā)芽率（以露白為準）明顯高于過表達水稻株系（圖4-A）。0.9%NaCl處理120 h時，野生型Kitaake的發(fā)芽率與過表達水稻株系發(fā)芽率相差不大，但形態(tài)大小上差異明顯（圖4-C）。種子發(fā)芽120 h時，用自來水萌發(fā)的種子芽部大小整體大于相應的0.9%鹽水處理（圖4-D）。過表達水稻株系和野生型Kitaake用自來水發(fā)芽時無太大差異，各株系發(fā)芽率隨時間變化幾乎一致（圖4-B和圖4-F）。然而，用0.9%NaCl鹽水萌發(fā)種子54 h時，野生型Kitaake發(fā)芽率明顯高于此時自來水浸泡下的萌發(fā)率，說明高鹽脅迫加快了野生型Kitaake的萌發(fā)；但是，過表達水稻株系的發(fā)芽率明顯低于此時自來水浸泡下的萌發(fā)率，表明高鹽脅迫抑制了過表達水稻株系的萌發(fā)，即對高鹽脅迫是敏感的、有響應的。

2.4.2 過表達水稻各株系幼苗干重的變化過表達水稻各株系及受體苗期室內(nèi)鹽脅迫處理后，統(tǒng)計各株系地上部干重、根干重，并計算出單株干重（表1），重復3組，從表中可看出：過表達水稻各株系地上部干重較受體野生型增加0.49%—21.07%，其中M30103-15株系與受體野生型之間無顯著差異；過表達水稻各株系根干重較受體野生型增加57.07%—100.51%（＜0.01）；過表達水稻各株系單株干重較受體野生型增加14.11%—37.42%（＜0.01）。這說明過表達在一定程度上提高了水稻苗期的耐鹽性，根部差異更為突出。

2.4.3 過表達水稻各株系的田間表現(xiàn) 由表2可看出，在田間土樣離子濃度差異不顯著的前提下，過表達水稻株系M30103-13、M30103-14的單株分蘗數(shù)增多，而M30103-15減少但與受體野生型差異不顯著；3個株系株高較受體野生型增加3.33%—7.67%，與受體野生型株高差異不顯著；過表達水稻株系單株籽粒重較受體野生型增加56.12%—76.58%，且呈顯著水平。表明過表達水稻在田間相對于受體水稻耐鹽性顯著提高。

表1 培養(yǎng)室內(nèi)過表達SiANT1水稻各株系及受體Kitaake苗期鹽處理后數(shù)據(jù)統(tǒng)計

表中數(shù)據(jù)為均值±標準差，同列不同大寫字母表示不同材料之間在0.01水平差異顯著（n=3）

The data in the table are Means±SD, with different capital letters in the same column indicating significant differences (0.01) between the different materials (n=3)

A：0.9%NaCl處理66 h；B：自來水處理66h；C：0.9%NaCl處理120h；D：自來水處理120 h；E、F：分別表示0.9%NaCl和自來水處理的發(fā)芽率

表2 田間全生育期農(nóng)藝性狀調(diào)查

表中數(shù)據(jù)為均值±標準差，同列不同小寫字母表示不同材料之間在0.05水平差異顯著（n=3）

The data in the table are Means±SD, with different normal letters in the same column indicating significant differences (0.05) between the different materials (n=3)

2.5 過表達SiANT1水稻的分子檢測及相關基因表達模式分析

2.5.1 過表達水稻株系陽性植株檢測 通過對過表達水稻株系和野生型水稻進行PCR檢測（圖5）。結(jié)果顯示，過表達水稻3個株系都是陽性，即谷子已轉(zhuǎn)入水稻中。

M：marker；1：陽性質(zhì)粒對照；2：陰性H2O對照；3：Kitaake；4：M30103-13；5：M30103-14；6：M30103-15

2.5.2 過表達水稻的半定量和定量PCR分析 通過對轉(zhuǎn)基因株系中進行半定量RT-PCR分析（圖6-A），在亮度一致的前提下，過表達株系（M30103-13、M30103-14和M30103-15）均擴增出大小一致的條帶，但受體野生型無帶，說明野生型水稻中不存在谷子基因，并且這三個過表達水稻株系都在RNA水平上表達。進一步定量PCR檢測（圖6-B），過表達水稻中的相對表達量為受體的178—10 615倍，其中M30103-13株系的相對表達量最高，M30103-15次之，M30103-14最低，該結(jié)果與半定量結(jié)果一致。

利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將轉(zhuǎn)入水稻中，但是，是否插入水稻DNA中并形成重組DNA，插入位點及插入個數(shù)均不確定。已證明水稻株系M30103-13、M30103-14、M30103-15的DNA內(nèi)含有，并且都在RNA水平上表達，只是RNA相對表達量有所差異，因此，推測3個過表達水稻株系之間相對表達量的差異可能是由于拷貝數(shù)不同造成的。

A：轉(zhuǎn)基因水稻的RT-PCR分析；B：轉(zhuǎn)基因水稻的Real-time PCR分析。***與野生型水稻Kitaake相比，該過表達SiANT1水稻株系SiANT1的相對表達量在0.001水平上差異顯著（n=3）

2.5.3 可能的下游基因的表達 根據(jù)前面的推測，進一步檢測細胞分裂素等植物激素形成和耐鹽性相關基因在轉(zhuǎn)基因株系中的表達水平。通過對水稻和進行實時熒光定量PCR檢測（圖7-A和圖7-B），與受體Kitaake比較，水稻的相對表達量在M30103-13、M30103-14提高1.5倍以上，M30103-15提高1.1倍（圖7-A）；在M30103-13、M30103-14和M30103-15中的相對表達量均提高1.6倍以上（圖7-B），呈顯著增加水平。結(jié)果表明，在過表達水稻株系和的相對表達量相對于受體野生型顯著提高，結(jié)合水稻和[26-28]已被前人驗證可以提高作物耐鹽性，說明過表達水稻株系可能增強了內(nèi)源和的表達，進而提高了耐鹽性。

A：OsSOS1；B：OsZFP182。*在0.05水平上差異顯著（n=3）* significantly different at 0.05 level (n = 3)

3 討論

鹽脅迫增加了土壤中Na+和Cl-濃度，使植物受到滲透脅迫和離子毒害，造成植物生長發(fā)育遲緩甚至死亡。形態(tài)方面：葉面積減小、葉片卷曲干枯、植株矮?。簧砩矫妫簡沃旮芍亟档?，光合作用受抑制、營養(yǎng)物質(zhì)攝取受阻、活性氧增多、質(zhì)膜解體、代謝毒物積累等[29]。植物為了降低鹽脅迫對自身的傷害，增加糖類、脯氨酸、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，這起到保護細胞膜表面的作用，提高了細胞的耐逆性；大量的膜蛋白被激活將Na+最終轉(zhuǎn)移到液泡中，重建胞內(nèi)、胞外、液泡的離子平衡[29-30]。植物鹽應答的分子包括兩類：一類是直接參與代謝變化等生化應答過程，產(chǎn)生耐鹽效應的效應分子；另一類是位于效應分子上游，介導信號傳遞，包括轉(zhuǎn)錄因子和信號級聯(lián)系統(tǒng)中各種激酶的調(diào)控分子[29,31]。轉(zhuǎn)錄因子是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異相互作用的結(jié)合蛋白，通過它們之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄，進而激活或抑制下游基因表達[32]。轉(zhuǎn)錄因子在植物對逆境的應答過程中起著重要的調(diào)控作用，通過它可以精細地調(diào)控下游功能基因適時適量地表達，從而實現(xiàn)自身生長發(fā)育和繁殖的需要以及對各種生物或非生物逆境的應答[32-33]。MYB、MYC、bZIP、AP2/ERF and zinc finger protein等轉(zhuǎn)錄因子都參與逆境脅迫相關基因表達[32]。

本文在水稻中過表達，SiANT1蛋白屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子里的AP2亞家族。目前關于AP2亞族的報道，大多與植物生長發(fā)育相關[7]。本文主要研究是否響應鹽脅迫，是否可以提高作物耐鹽性，如若可以，可能是通過怎樣的方式調(diào)控。SiANT1是一個轉(zhuǎn)錄因子，將谷子利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)到水稻中，隨著載體質(zhì)粒的T-DNA區(qū)進入水稻，是否轉(zhuǎn)入、插入位置、以及插入個數(shù)等都是不確定的，后續(xù)通過DNA檢測篩選陽性植株，并篩選在RNA水平上表達的植株，本文未對表達的蛋白進行研究。本文在高鹽脅迫條件下，過表達水稻種子萌芽期受抑制，然而，在自來水中過表達水稻種子正常發(fā)芽，說明谷子對高鹽敏感。萌芽期的高鹽脅迫試驗結(jié)果，過表達水稻種子萌芽受抑制，這說明可能在萌芽期不具有耐鹽性，但是，與野生型水稻種子相比，最終（0.9%NaCl處理120 h）兩者發(fā)芽率相差不大，又說明可能過表達水稻種子露白推遲是一種耐鹽脅迫應答反應。過表達水稻株系苗期干重和田間籽粒重相對于受體水稻顯著增加，證明過表達可以提高轉(zhuǎn)基因水稻苗期及成熟期耐鹽性。苗期干重和田間籽粒重都屬于生物量，較野生型而言，在0.9%NaCl處理下，過表達水稻株系生物量增加，可能是由于的過表達導致細胞分裂素增多、細胞數(shù)目增加，葉莖器官增大、側(cè)根形成增加[10,34]，在此基礎上，由于表達的蛋白是轉(zhuǎn)錄因子，過表達可能也通過增強相關下游耐鹽基因表達來提高水稻耐鹽性。本文中可能的下游基因Os、Os的相對表達量在過表達水稻中較野生型增加。SOS1蛋白是一種質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，是一個重要的耐逆決定簇，參與Na+從細胞中排出[35-36]。Martínez-Atienza等[26]和SCHMIDT等[27]證明了OsSOS1水稻轉(zhuǎn)運蛋白在酵母細胞的質(zhì)膜囊泡中具有Na+/H+交換能力，降低了細胞中Na+凈含量，減輕了Na+對細胞造成的離子毒害。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白SOS1是迄今為止植物質(zhì)膜上唯一的Na+流出蛋白[26]。缺少SOS1的擬南芥突變體對鹽是極其敏感的，其Na+排出和將該離子從根部長距離運輸?shù)角o都有缺陷[36-37]。SOS1蛋白主要表達于植物根尖表皮和木質(zhì)部共質(zhì)體邊界的木質(zhì)部薄壁組織[36]。在根-土壤界面處，SOS1將從根表皮細胞排出過量的Na+離子。此外，突變體中Na+根冠分配的分析表明，在不同鹽度條件下SOS1也以復雜的方式參與Na+在根和莖之間的重新分配[36]。在適度的鹽（25 mmol·L-1NaCl）脅迫下，突變體植株在其地上部中積累的Na+比野生型低，這表明SOS1的功能是將Na+裝載到木質(zhì)部用于控制傳遞至莖。相反，在高鹽（100 mmol·L-1NaCl）脅迫下，突變體植株的根和地上部分比野生型植物積累更多的Na+，這可能是由于根表皮Na+排出以及Na+穿過木質(zhì)部-共質(zhì)體邊界的電化學梯度受到破壞[36,38]。鋅指蛋白（zinc finger Protein）是一類具有“手指狀”結(jié)構域的轉(zhuǎn)錄因子，負責調(diào)控基因的表達[32]。鋅指蛋白的共同特征是通過結(jié)合Zn2+來穩(wěn)定一種很短的可自我折疊成“手指”的蛋白結(jié)構[32]。ZFP182蛋白大小為18.2 kD，含有2個C2H2型鋅指基序，一個核定位信號和一個富含Leu的結(jié)構域。大多數(shù)植物的C2H2型鋅指蛋白中存在DLN-box/EAR-motif結(jié)構域，但是ZFP182中不存在[28]。在成年稻的葉，莖，根和穗中組成型表達，并且水稻幼苗分別在冷（4℃）、150 mmol·L-1NaCl和0.1 mmol·L-1ABA處理下，明顯被誘導表達[28]。將水稻的的啟動子區(qū)約1.4 kb融合到報告基因中并轉(zhuǎn)化煙草，組織化學分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草幼苗在正常條件下不能檢測到GUS的表達，但在用NaCl或KCl處理后的煙草葉片和根的維管組織中強烈觀察到GUS的表達[28]。Huang等[28]研究表明水稻中過表達提高了鹽脅迫的耐受性。目前關于ZFP182的作用機理仍不清楚。本研究證明過表達提高了水稻的耐鹽性，可能是通過增強水稻中下游內(nèi)源基因和Os的表達實現(xiàn)的，為證明谷子具有耐鹽性進一步提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

谷子受100 mmol·L-1NaCl誘導上調(diào)表達，在24 h時相對表達量最高。過表達提高水稻耐鹽性，其通過增強可能的下游基因和的表達提高耐鹽性。

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（責任編輯 李莉）

Rice Overexpression of MilletGene Increases Salt Tolerance

NING Lei1, WANG ShuGuang1, JU PengJu1, BAI XingXuan1, GE LinHao2, QI Xin2, JIANG QiYan2, SUN XianJun2, CHEN Ming2, SUN DaiZhen1

(1College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030800, Shanxi;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【Objective】High salt stress is one of the main factors affecting crop yield.L. is characterized by its strong tolerance to stress. Therefore, screening salt tolerant related genes from millet is important for salt stress tolerant improvement of crops through genetic transformation.【Method】The expression profile of AP2/ERF like genewere analyzed in Yugu 1 at seedling stage under high salt, low nitrogen and PEG simulated drought conditions. Millet genewas transformed into rice Kitaake by agrobacterium-mediated transformation method. overexpressingrice seeds and wild type Kitaake were digested with 0.9% saline and tap water, respectively. The phenotypes of germinating stage and germination rate were observed. Rice seedlings were treated with 0.9% NaCl in Hogland nutrient solution for 10 days and then dried at 65℃ for 48 hours dry weights of all the rice overexpressingand wild type (WT) plants were analyzed. At the same time, phenotype of all plants was analyzed in the field and all plants were irrigated once with 0.9% saline before rice pregnancy. Under the similar salt treatment condition, single seed grain weigh plant height and tiller number per plant of the overexpressingrice lines and wild type were also analyzed.The real time-PCR method was used to verify the expression ofand its possible downstream genes in transgenic rice lines.【Result】L. SiANT1 protein (XP004985124.1, SiANT1) belongs to the AP2 subfamily and has a close genetic relationship with sorghum (XP021318293.1, SbANT1) and maize (XP008658933.1, ZmAP2).The gene ofwas induced by high salt stress (100 mmol·L-1NaCl) in Yugu 1. Thewas ligated to LP047 1118-Bar-ubi-EDLL vector, Agrobacterium transformation method was used to transferinto rice genome, positive T0plants were screened, thenbreeded two generations and got T3seeds. Under water immersion, the germination rate ofoverexpression rice was similar to that of wild type. Germination rate was more than 90%. Under 0.9% saline immersion, the overexpression ofwas significantly inhibited.Compared with the wild type, over-expression ofrice seeds dew white was delayed, but finally(treatmented for 120h) germination rate was more than 80% .After treatment with 0.9% NaCl at seedling stage in greenhouse, the dry weight of single plant overexpressingincreased 14.11%-37.42% more than that of WT, which had significant difference at the 1% level. the grain weight of transgenic rice overexpressionwhich had significant difference at the 5% level,the number of tillers per plant and plant height increased, but there was no significant difference with the wild-type. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that all three rice lines overexpressingexpressedat the RNA level. Real time-PCR results showed that the relative expression level ofwas different but significantly increased compared with that of the recipient, and the relative expression levels of endogenous salt-tolerance-related genesandwere 1.1-1.7 fold and 1.6-2.3 fold respectively higher than that of the recipient.【Conclusion】It has been confirmed thatandare salt tolerance related genes.gene has certain salt tolerance. Overexpression ofand.

millet (L.);gene; AP2 / ERF transcription factor; salt tolerance; salt tolerant related genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.002

2017-12-01；

2018-02-02

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2016ZX08002005）、谷子氮素高效利用重要基因克隆及育種價值評估（2018ZX0800924B）

寧蕾，E-mail：ninglei02@163.com。通信作者孫黛珍，E-mail：sdz64@126.com。通信作者陳明，E-mail：chenming02@caas.cn