李 想，薛 婧，陳 霆，叢 喆，魏 強(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)計委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京 100021)

唾液酸黏附素(sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins, Siglecs)是宿主最大的唾液酸結(jié)合蛋白。Siglec-1，也被稱作CD169，是第一個被發(fā)現(xiàn)的Siglecs家族的成員，主要表達于單核巨噬細胞和樹突狀細胞[1 - 2]。CD169可與病毒表面的某些糖蛋白結(jié)合，增強病毒與細胞的結(jié)合，從而促進病毒感染[3]。艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome， AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的，HIV主要分為兩種類型，即HIV-1和HIV-2，HIV-1是目前全球流行的主要病毒株。HIV-1研究中發(fā)現(xiàn)，機體感染HIV-1后，組織巨噬細胞和外周血單核細胞表面高表達CD169[4]。猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)是從靈長類動物身上分離得到的類似于HIV的病毒，SIV恒河猴模型被認為是研究艾滋病最有效的模型，而SIVmac239是常用的SIV病毒。因此，本研究觀察了SIVmac239感染前后，恒河猴外周血單核細胞的比例及其表面CD169表達量的變化，分析了引起單核細胞CD169表達量變化的主要原因，以期為HIV-1/SIV感染單核巨噬細胞的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物：SPF級中國恒河猴40只，3～4歲，3～5 kg，雌雄各半，購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所[SCXK (京) 2015-0011]。動物飼養(yǎng)及相關(guān)的實驗在生物安全三級實驗室中進行[SYXK (京) 2015-0036]。實驗前，經(jīng)血清學(xué)間接免疫熒光抗體檢查法(IFA)檢查排除猴B病毒(BV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-1)等相關(guān)病原體的感染。本實驗通過本單位實驗動物管理和使用委員會的動物倫理審查，批準(zhǔn)號為XJ16007。

病毒及動物接種：SIVmac239，由美國Aaron Diamond艾滋病研究中心Preston Marx博士惠贈。中國恒河猴PBMC擴增制備，CEMx174細胞滴定TCID50為每毫升3 × 105。病毒使用劑量為500 TCID50，靜脈接種病毒。

樣本的收集：攻毒前和靜脈攻毒后第49天，采集恒河猴外周血2 mL，進行全血流式；采集正常恒河猴外周血，分離PBMC，流式分選CD14+單核細胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

Recombinant Human IFN-alpha A protein(貨號：11100-1)購自R&D公司；流式抗體PE Mouse Anti-Human CD14(貨號：557154)，F(xiàn)ITC Mouse Anti-Human CD14(貨號：555397)，PE Mouse Anti-Human IFN-α(貨號：560097)和PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD16(貨號：560717)購自BD公司；流式抗體APC Anti-Human CD169(貨號：346008)購自BioLegend公司；Human M-CSF(貨號：300-25-10UG)和Human IL-13(貨號：200-13-10UG)購自Peprotech公司；Recombinant Rhesus Macaque IL-4 Protein(貨號：1577-IL-010/CF)購自R&D Systems公司；流式細胞洗液(PBS Ⅱ)為含2% FBS和2 mmol/L EDTA的PBS溶液。BD AccuriTMC6流式細胞儀，BD FACSAria Ⅱ流式細胞儀，日本Hitachi CF16RXII高速離心機，Dynamica臺式離心機，ESCO生物安全柜，Thermo Forma二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 流式細胞術(shù)分選恒河猴外周血CD14+單核細胞[5]

(1)恒河猴外周血PBMC分離：取40 mL正常恒河猴的外周血，2500 r/min離心10 min，棄去血漿，用RPMI-1640培養(yǎng)液等比稀釋血細胞，混勻后，每10 mL血細胞稀釋液緩慢加至5 mL Ficoll液面的上方(Ficoll與稀釋前血液的體積比為1∶1)，2800 r/min離心30 min，用吸管將中間單個核細胞層吸出，轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，用不少于PBMC體積三倍的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞兩次，2000 r/min離心10 min，適量的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸后計數(shù)。

(2)流式分選單核細胞：按20 μL抗CD14抗體/1 × 106個細胞的濃度加入抗體，混勻，4℃孵育30 min后，用PBS Ⅱ洗2次，4℃、2000 r/min離心3 min，適量PBS Ⅱ重懸后，使用BD FACSAria Ⅱ流式儀進行分選，得到CD14+單核細胞。

1.3.2 SIVmac239體外感染恒河猴外周血CD14+單核細胞[6]

取1 × 106個CD14+單核細胞置于24孔板中，1 mL完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，以100 μL的病毒用量感染細胞，混勻后置于37℃、5% CO2孵箱，培養(yǎng)48 h后，檢測細胞表面CD169的表達量。

1.3.3 細胞因子刺激恒河猴外周血CD14+單核細胞[3]

(1)細胞因子IFN-α刺激單核細胞：取1 × 106個CD14+單核細胞置于24孔板中，1 mL完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，加入細胞因子IFN-α，使得IFN-α的終濃度為500 U/mL，48 h后檢測細胞表面CD169的表達量。

(2)細胞因子M-CSF、IL-4、IL-13刺激單核細胞：取1 × 106個CD14+單核細胞置于24孔板中，1 mL完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，加入細胞因子M-CSF、IL-4和IL-13，使得M-CSF、IL-4和IL-13的終濃度均為20 ng/mL，48 h后檢測細胞表面CD169的表達量。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測細胞表面CD169分子表達量[7 - 8]

(1)全血流式：取100 μL全血，依次加入抗體PE Mouse Anti-Human CD14，PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD16，APC Anti-Human CD169，室溫下避光孵育30 min，加入1 mL終濃度為10%的紅細胞裂解液，室溫作用8 min，加入1 mL PBS，2500 r/min離心5 min，棄去上清，加入2 mL PBS，2000 r/min離心10 min，適量PBS重懸過濾后BD AccuriTMC6流式細胞儀進行樣本檢測。

(2)胞外染色：將CD14+單核細胞從培養(yǎng)板中取出后，用PBS Ⅱ洗2次，4℃、2000 r/min離心3 min，調(diào)整細胞濃度為每毫升1 × 107個細胞，輕輕混勻后加入流式管內(nèi)，每管100 μL。各流式管中加入相應(yīng)抗體，4℃避光孵育30 min，PBS Ⅱ洗1次，PBS洗1次，PBS重懸后細胞篩過濾上機檢測。

(3)胞內(nèi)染色：每個流式管內(nèi)加入100 μL IC Fixation Buffer，4℃孵育20 min，加入2 mL 1 × Permeabilization Buffer洗2次，4℃、2000 r/min離心3 min。100 μL 1 × Permeabilization Buffer重懸細胞后加入相應(yīng)抗體，混勻后4℃避光孵育30 min，1 × Permeabilization Buffer洗2次，PBS洗1次，PBS重懸后細胞篩過濾上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SIVmac239感染猴CD14+單核細胞表面分子CD169表達量分析

正常恒河猴經(jīng)SIVmac239感染后，采集外周血，流式細胞術(shù)檢測CD14+單核細胞的比例及其表面CD169分子表達量。結(jié)果顯示，正常恒河猴外周血單核細胞低表達CD169，感染后，CD14+單核細胞的比例雖出現(xiàn)下降(P< 0.01)(圖1A)，但CD14+單核細胞表面CD169的表達量卻顯著增加(P< 0.01)(圖1B)。

注：A：SIVmac239感染前后外周血單核細胞比例的變化；B：SIVmac239感染前后外周血單核細胞表面分子CD169表達量的變化。與正常組相比，** P< 0.01，*** P< 0.001；n=40。圖1 CD14+單核細胞及其表面分子CD169在SIVmac239感染后表達量的變化Note.A: Changes in the percentage of peripheral blood CD14+ monocytes before and after SIVmac239 infection. B: Changes in the expression of CD169 on the surface of peripheral blood CD14+ monocytes before and after SIVmac239 infection. Compared with the normal group,**P< 0.01,***P< 0.001. n =40.Fig.1 Changes in the percentage of CD14+ monocytes in the peripheral blood and the expression of CD169 on their surface before and after SIVmac239 infection

2.2 SIVmac239感染前后恒河猴外周血不同單核細胞亞群CD169分子表達量分析

根據(jù)外周血單核細胞CD14和CD16表達量的差異，可將單核細胞分為三種亞型，經(jīng)典型CD14++CD16-、中間過渡型CD14++CD16+和非經(jīng)典型CD14+CD16++單核細胞。SIVmac239感染恒河猴前后，流式檢測不同亞群單核細胞比例及其表面分子CD169表達量的變化。結(jié)果顯示，感染后經(jīng)典型CD14++CD16-和非經(jīng)典型CD14+CD16++單核細胞的比例未發(fā)生明顯的變化，中間過渡型CD14++CD16+單核細胞的比例出現(xiàn)下降(P< 0.01)(圖2 A)。三種亞型單核細胞表面CD169的表達量均出現(xiàn)不同程度的增高(P< 0.01)(圖2B)。其中，經(jīng)典型CD14++CD16-和非經(jīng)典型CD14+CD16++單核細胞表面CD169表達量升高較為明顯，分別為感染前的10倍和11倍(圖2C)。進一步分析可知，SIVmac239感染后，非經(jīng)典型CD14+CD16++單核細胞表面分子CD169的表達量明顯高于經(jīng)典型CD14++CD16-單核細胞(P< 0.01)(圖2D)。

注：A：SIVmac239感染前后外周血不同亞群單核細胞比例的變化；B：SIVmac239感染前后外周血不同亞群單核細胞表面分子CD169表達量的變化；C：SIVmac239感染前后不同亞群單核細胞表面分子CD169表達量的比較；D：SIVmac239感染后經(jīng)典型和非經(jīng)典型單核細胞表面分子CD169表達量的比較。與正常組相比，*** P< 0.001，ns：差異無顯著性；與CD14++CD16-CD169+相比，△△P< 0.01；n=40。圖2 不同單核細胞亞群比例及其表面分子CD169在SIVmac239感染后表達量的變化Note.A: Changes in the percentage of different subsets of peripheral blood monocytes. B: Changes in the expression of CD169 on the surface of different subsets of peripheral blood monocytes. C: Comparison of the relative expression of CD169 on the surface of different subsets of monocytes. D: Comparison of the expression of CD169 on the surface of classical and non-classical monocytes after SIVmac239 infection. Compared with the normal group,***P< 0.001, ns: not significant. Compared with CD14++CD16-CD169+,△△P< 0.01. n=40.Fig.2 Changes in the percentage of different subsets of monocytes and the expression of CD169 on their surface after SIVmac239 infection

2.3 SIVmac239直接感染和不同細胞因子刺激CD14+單核細胞后CD169分子表達量的變化

正常恒河猴外周血流式分選CD14+單核細胞，細胞因子M-CSF、IL-4和IL-13等不能刺激CD14+單核細胞表面表達CD169(圖3A)，但經(jīng)細胞因子IFN-α刺激48 h后，細胞表面高表達CD169，陽性率達到(98.9±0.89)%(圖3B)。SIVmac239體外直接感染CD14+單核細胞，未能檢測到CD169表達的變化(圖3C)，同時細胞內(nèi)也未能檢測到細胞因子IFN-α的表達(圖3D)。

注：A：M-CSF、IL-4和IL-13誘導(dǎo)的CD14+單核細胞表面分子CD169表達量的變化；B：IFN-α誘導(dǎo)的CD14+單核細胞表面分子CD169表達量的變化；C：SIVmac239感染CD14+單核細胞后CD169表達量的變化；D：SIVmac239感染CD14+單核細胞后胞內(nèi)細胞因子IFN-α表達量的變化。“……”：同型對照；“——”：CD169/IFN-α。圖3 SIVmac239直接感染和不同細胞因子刺激的CD14+單核細胞表面分子CD169的變化Note.A: Changes in the expression of CD169 on the surface of CD14+ monocytes induced by M-CSF, IL-4 and IL-13. B: Changes in the expression of CD169 on the surface of CD14+ monocytes induced by IFN-α. C: Changes in the expression of CD169 on the surface of CD14+ monocytes after direct infection with SIVmac239. D: Changes in the expression of intracellular cytokine IFN-α of CD14+ monocytes after direct infection with SIVmac239. “……”: Isotype; “——”: CD169/IFN-α.Fig.3 Changes in the expression of CD169 on the surface of CD14+ monocytes after stimulated by different cytokines or directly infected with SIVmac239

3 討論

單核巨噬細胞可以被HIV-1感染，成為HIV-1的潛伏感染細胞，其感染機制目前尚不完全明確。表達于單核巨噬細胞表面的CD169由于可以與病毒表面某些糖蛋白結(jié)合而促進病毒感染，從而成為HIV-1感染機制研究中的一個新的關(guān)注點。

本研究中發(fā)現(xiàn)，恒河猴外周血CD14+單核細胞在SIVmac239感染后比例略降低，這可能與外周血單核細胞向不同的組織遷徙分化為巨噬細胞有關(guān)[9]。同時，感染猴外周血CD14+單核細胞表面CD169的表達量顯著增加，這與HIV-1感染后，組織巨噬細胞和外周血單核細胞高表達CD169的結(jié)果一致[4]。由此可見，單核巨噬細胞上表達的CD169分子確實和病毒的感染有關(guān)。

Ziegler-Heitbrock[10]根據(jù)外周血單核細胞CD14和CD16表達量的差異，將單核細胞分為三種亞型，經(jīng)典型CD14++CD16-，中間過渡型CD14++CD16+和非經(jīng)典型CD14+CD16++單核細胞。外周血單核細胞來源于骨髓，剛進入外周血時為經(jīng)典型CD14++CD16-單核細胞，其中的一小部分分化為中間過渡型CD14++CD16+單核細胞，這類細胞最終可能分化為非經(jīng)典型CD14+CD16++單核細胞，進入不同的組織，產(chǎn)生不同類型的終末分化巨噬細胞[11]。研究發(fā)現(xiàn)，非經(jīng)典型CD14+CD16++單核細胞相比經(jīng)典型CD14++CD16-單核細胞具有更強的吞噬能力和抗原提呈能力[9, 12]，是發(fā)育更為成熟的細胞。恒河猴經(jīng)SIVmac239感染后，非經(jīng)典型CD14+CD16++單核細胞中CD169表達量的升高最為明顯，其表達量明顯高于經(jīng)典型CD14++CD16-單核細胞，推測CD14+CD16++單核細胞更強的吞噬能力和抗原提呈能力可能與CD169具有吞噬和介導(dǎo)抗原提呈的作用[13 - 14]有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，SIVmac239體外直接感染正常恒河猴外周血CD14+單核細胞并不能引起CD169表達的增加，而使用IFN-α刺激可誘導(dǎo)單核細胞高表達CD169分子。但是，SIVmac239直接感染單核細胞并不能引起其本身分泌IFN-α，而使用其它細胞因子也不能引起單核細胞表達CD169。說明恒河猴外周血單核細胞CD169表達的增加不是病毒感染直接引起的，而是體內(nèi)其它免疫細胞分泌的細胞因子IFN-α引起的。

綜上所述，在HIV-1/SIV感染過程中，單核巨噬細胞表面CD169的表達量發(fā)生明顯變化，其表達與病毒感染機體后其它細胞釋放的細胞因子IFN-α相關(guān)，因此，對CD169的進一步研究可能為HIV-1感染機制的研究提供新的思路。

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