陳 醒，毛樂樂，周應(yīng)芳*，白文佩(.北京大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 00034； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 00038)

宮腔粘連(intrauterine adhesion，IUA)又稱Asherman綜合征，是由于各種原因?qū)е碌淖訉m內(nèi)膜基底層破壞，進(jìn)而產(chǎn)生瘢痕修復(fù)，造成的宮頸管或?qū)m腔部分或完全閉鎖的一類疾病。宮腔粘連臨床上主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常(閉經(jīng)和月經(jīng)稀發(fā))，繼發(fā)性不孕，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等。隨著人工流產(chǎn)和宮腔內(nèi)手術(shù)數(shù)量的增加，宮腔粘連的發(fā)病率也不斷上升，嚴(yán)重影響了育齡期女性的身心健康和生活質(zhì)量[1 - 2]。宮腔粘連的發(fā)生機(jī)制目前尚未完全闡明。我們根據(jù)宮腔粘連的發(fā)生機(jī)制，使用刀片機(jī)械性刮宮的方法制作了大鼠宮腔粘連模型，并通過病理學(xué)常用的纖維組織染色方法Masson染色、van Gieson染色和天狼猩紅(Sirius red)染色法來評價(jià)大鼠宮腔粘連的纖維化程度，并對三種方法進(jìn)行組織學(xué)評價(jià)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究使用24只SPF級8周齡(成年)雌性SD大鼠，體重(210±10) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK (京) 2016-0006]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：11400700197806。大鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施[SYXK (京) 2014-0010]，大鼠自由飲水和攝食，適應(yīng)環(huán)境至少1周后開始實(shí)驗(yàn)。無菌手術(shù)在北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

HE染色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Masson染色試劑盒(甲苯胺藍(lán))購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Masson染色試劑盒(亮綠)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，van Gieson染色試劑盒和天狼猩紅染色試劑盒購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。主要儀器為倒置顯微鏡(ECLIPSE TS100，Nikon，Japan)和偏振光顯微鏡(DM4P，Leica，Germany)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作

24只大鼠根據(jù)染色方法隨機(jī)分為4組，每組6只。大鼠使用10%水合氯醛麻醉后打開腹腔，找到“Y”型子宮，左側(cè)子宮切開后暴露宮腔，用刀片對子宮內(nèi)膜進(jìn)行搔刮，直至宮腔表面有粗糙感為止，6-0線縫合子宮，逐層關(guān)腹。右側(cè)子宮不做處理，作為對照。術(shù)后14 d取材，制作大鼠子宮組織石蠟切片。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會審批(編號：f201242)。

1.3.2 切片染色方法

(1)HE染色：①切片脫蠟至水；②蘇木精染色3～5 min；③自來水返藍(lán)15～30 min；④伊紅染色2 min；⑤梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

(2)Masson染色：①切片脫蠟至水；②Masson復(fù)合染色液滴染5 min，蒸餾水沖掉染液；③磷鉬酸染液滴染5 min，甩干；④滴加苯胺藍(lán)染色液(或亮綠染色液)染色5 min，蒸餾水沖洗；⑤滴加分化液分化30～60 s；⑥梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片。

(3)van Gieson染色：①切片脫蠟至水；②天青石藍(lán)染色液染2～3 min；③水洗后Mayer蘇木精染液染2～3 min；④水洗后酸性乙醇分化液分化1～2 s；⑤自來水沖洗10 min；⑥麗春紅-苦味酸染液染1～2 min；⑦梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片。

(4)天狼猩紅染色：①切片脫蠟至水；②天狼猩紅染色液滴染1 h，流水沖洗；③Mayer蘇木素染色液染細(xì)胞核8～10 min，自來水沖洗10 min；④梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片。

1.3.3 切片分析

所有切片在光學(xué)顯微鏡下觀察。對于每種染色方法，每只大鼠子宮選取4個(gè)高倍鏡(high power field，HPF)(× 100)視野，計(jì)算子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目(個(gè)數(shù)/HPF)和子宮內(nèi)膜纖維化面積比(膠原纖維面積占總子宮內(nèi)膜面積的面積比)，使用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行分析。天狼猩紅染色切片在偏振光顯微鏡下觀察，以區(qū)分I型和III型膠原。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各染色方法的纖維化面積比和腺體計(jì)數(shù)采用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行分析，使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

子宮組織HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠子宮內(nèi)膜上皮，腺上皮和宮腔結(jié)構(gòu)可見。刮除子宮內(nèi)膜后，子宮內(nèi)膜上皮和宮腔結(jié)構(gòu)消失，代之以大量紅染的纖維組織(圖1)。

2.2 Masson染色

子宮組織Masson染色中的甲苯胺藍(lán)可將膠原纖維染成藍(lán)色，肌纖維和腺體上皮染成紅色。亮綠可將膠原纖維染成綠色，肌纖維和腺體上皮染成紫紅色，細(xì)胞核為紫色。刮除子宮內(nèi)膜后，子宮內(nèi)膜上皮和宮腔結(jié)構(gòu)消失，代之以大量藍(lán)色或綠色的膠原纖維(圖2)。Masson染色(甲苯胺藍(lán))對照組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量(個(gè)數(shù)/HPF)為(10.04±0.50)，刮宮后為(3.79±0.27)，差異有顯著性(P< 0.01)；對照組纖維化面積比為(26.48±1.23)%，刮宮后的纖維化面積比為(52.06±1.46)%，差異有顯著性(P< 0.01)。Masson染色(亮綠)對照組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量(個(gè)數(shù)/HPF)為(10.25±0.55)，刮宮后為(3.83±0.25)，差異有顯著性(P< 0.01)；對照組纖維化面積比為(21.23±0.91)%，刮宮后的纖維化面積比為(47.50±1.56)%，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：A：對照組子宮，可見子宮內(nèi)膜上皮和腺體，有宮腔結(jié)構(gòu)，可見紅染的膠原纖維；B：刮宮后子宮，子宮內(nèi)膜上皮消失，宮腔結(jié)構(gòu)消失，有較多紅染的纖維組織。比例尺：50 μm。圖1 刮宮前后子宮組織的HE染色(× 100)Note.A: Control uteri. Cavity stricture, and endometrial epithelia and glands were observed. B: Scraped uteri. Cavity stricture and endometrial epithelia were absent, with red stained fibers observed. Scale bars=50 μm.Fig.1 HE staining of uteri before and after scraping

注：A：對照組子宮Masson染色(甲苯胺藍(lán))，子宮內(nèi)膜上皮、腺體上皮、肌層均染為紅色，膠原纖維為藍(lán)色；B：刮宮后子宮組織Masson染色(甲苯胺藍(lán))，可見子宮內(nèi)膜上皮和宮腔結(jié)構(gòu)消失；C：對照組子宮Masson染色(亮綠)，子宮內(nèi)膜上皮、腺體上皮、肌層為紫紅色，細(xì)胞核為紫色，膠原纖維為綠色；D：刮宮后子宮組織Masson染色(亮綠)，子宮內(nèi)膜上皮和宮腔結(jié)構(gòu)消失。比例尺：50 μm。圖2 刮宮前后子宮組織的Masson染色(× 100)Note.A: Control uteri (toluidine blue). Endometrium, endometrial glands and muscular layers were stained red while fibers were stained blue. B: Scraped uteri (toluidine blue). Endometrial epithelia and cavity stricture were absent. C: Control uteri (light green). Endometrium, endometrial glands and muscular layers were stained purple-red, the nucleus was stained purple, and fibers stained green. D: Scraped uteri (light green). Endometrial epithelia and cavity structure were absent. Scale bars=50 μm.Fig.2 Masson staining of uteri before and after scraping

2.3 van Gieson染色

van Gieson染色結(jié)果顯示，肌纖維、上皮胞質(zhì)等非膠原纖維成分被染為黃色，細(xì)胞核為棕色或黑色，膠原纖維被染為紅色。刮除子宮內(nèi)膜后，子宮內(nèi)膜上皮層消失。對照組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量(個(gè)數(shù)/HPF)為(10.29±0.40)，刮宮后為(3.71±0.25)，差異有顯著性(P< 0.01)。對照組纖維化面積比為(21.40±1.21)%，刮宮后的纖維化面積比為(47.49±1.54)%，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：A：對照組子宮的van Gieson染色，子宮內(nèi)膜上皮、腺體上皮、肌纖維被染為黃色，細(xì)胞核為棕色或黑色，膠原纖維染為紅色；B：刮宮后子宮的van Gieson染色，刮除子宮內(nèi)膜后，子宮內(nèi)膜上皮層消失。比例尺：50 μm。圖3 刮宮前后的子宮van Gieson染色(× 100)Note.A: Control uteri. Endometrium, endometrial glands and muscular layers were stained yellow, the nucleus was stained brown or black, and fibers stained red. B: Scraped uteri. Endometrial epithelia and cavity structure were absent. Scale bars=50 μm.Fig.3 van Gieson staining of uteri before and after scarping

2.4 天狼猩紅染色

天狼猩紅染色結(jié)果顯示，肌纖維、上皮胞質(zhì)、細(xì)胞核等非膠原纖維成分被染為紫色，膠原纖維被染為紅色。刮除子宮內(nèi)膜后，子宮內(nèi)膜上皮層消失，子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量(個(gè)數(shù)/HPF)為(10.08±0.44)，刮宮后為(3.79±0.26)，差異有顯著性(P< 0.01)；對照組纖維化面積比為(20.17±0.69)%，刮宮后的纖維化面積比為(46.88±0.92)%，差異有顯著性(P< 0.01)。偏振光顯微鏡下，I型膠原呈亮紅色或強(qiáng)橙黃色，III型膠原呈綠色。對照組I型膠原在子宮組織中所占的面積比為(11.88±0.70)%，刮宮組為(32.68±1.17)%；對照組III型膠原在子宮組織中所占的面積比為(8.65±0.37)%，刮宮組為(17.32±0.69)%。差異均有顯著性(P< 0.01)(圖4)。

本研究的各種染色方法中，Masson染色(亮綠)、van Gieson染色、天狼猩紅染色計(jì)算出的對照組和刮宮組纖維化面積比均無明顯差異(P> 0.05)，但均顯著低于Masson染色(甲苯胺藍(lán))(P< 0.01)。

注：A：對照組子宮的天狼猩紅染色，肌纖維、子宮內(nèi)膜上皮、腺體上皮、肌層、細(xì)胞核被染為紫色，膠原纖維被染為紅色；B：刮宮后子宮的天狼猩紅染色，刮除子宮內(nèi)膜后，子宮內(nèi)膜上皮層消失；C，D：對照組(C)和刮宮后(D)子宮偏振光顯微鏡鏡下圖，可見亮紅色或強(qiáng)橙黃色的I型膠原和綠色的III型膠原。比例尺：50 μm。圖4 刮宮前后子宮組織的天狼猩紅染色(× 100)Note: A: Control uteri. Endometrium, endometrial glands, muscular layers, and the nucleus were stained purple while fibers were stained red. B: Scraped uteri. Endometrial epithelia and cavity structure were absent. C, D: Control uteri (C) and scraped uteri (D) under polarized light microscopy. Collagen type I ranged from orange to red, while collagen type III ranged from green to yellow. Scale bars=50 μm.Fig.4 Sirius red staining of uteri before and after scarping

3 討論

宮腔粘連的主要病理變化是子宮內(nèi)膜組織的瘢痕修復(fù)及纖維化，異常增生的膠原纖維填塞宮腔。HE染色是最基本的組織學(xué)染色方法，但是其只能顯示最基本的病理變化，纖維組織為紅色，但是沒有特異性。膠原纖維含有堿性氨基酸，能與酸性染料進(jìn)行結(jié)合而著色。Masson染色、van Gieson染色以及天狼猩紅染色都是利用此特點(diǎn)對膠原纖維著色。目前，上述染色方法主要用于各種纖維化疾病的研究中。

Masson染色法是經(jīng)典的顯示結(jié)締組織的三色染色方法，光鏡下膠原纖維呈藍(lán)色(甲苯胺藍(lán))或綠色(亮綠)，肌纖維、紅細(xì)胞被麗春紅染成紅色。由于操作步驟較為復(fù)雜，因此實(shí)際染色過程中，染色影響因素較多。Masson染色鏡下細(xì)胞核可以表現(xiàn)為黑色、褐色或藍(lán)色。因此，如果用甲苯胺藍(lán)染膠原纖維，在圖像分析時(shí)，容易將細(xì)胞核所在區(qū)域計(jì)入膠原纖維中，容易產(chǎn)生膠原纖維“過染”的假象，造成分析誤差[1]，而使用亮綠染膠原纖維則不會出現(xiàn)此現(xiàn)象，因此從該角度來看，亮綠可能比甲苯胺藍(lán)更適合染膠原纖維[2]。

van Gieson染色也是一種經(jīng)典的膠原纖維染色方法。該法使用麗春紅將膠原纖維染為紅色，苦味酸將其他肌纖維等非膠原纖維部位染成黃色，天青石藍(lán)和蘇木精將細(xì)胞核染為紫色，因此在光鏡下較容易區(qū)分膠原纖維，計(jì)算纖維化面積時(shí)與Masson(亮綠)染色和天狼猩紅染色相比并無明顯差異，是一種較好的膠原纖維染色方法。

天狼猩紅是一種陰離子強(qiáng)酸性染料，每個(gè)分子內(nèi)含有6個(gè)磺酸基，容易與膠原纖維中的堿性基團(tuán)結(jié)合。天狼猩紅又是一種長形展開的分子，與膠原分子吸附后極穩(wěn)定，染色后不易褪色。在普通光鏡下能使膠原纖維染成紅色，而非膠原纖維部分不見紅色背景。在偏振光顯微鏡下觀察，膠原纖維有正的單軸雙折射光的屬性，與天狼猩紅染液結(jié)合后，可增強(qiáng)雙折射，提高分辨率。在正常的子宮組織中，主要分布I型和III型膠原。在纖維化過程中，各種膠原纖維的量和構(gòu)成比會發(fā)生顯著的改變，而這種改變與纖維化的程度密切相關(guān)。在纖維化過程中，I型和III型是主要參與的膠原纖維，其表達(dá)都增高[3 - 4]。在偏振光顯微鏡下，I型膠原顯示出很強(qiáng)的雙折光性，為亮紅色或強(qiáng)橙黃色；III型膠原雙折光性弱，為綠色，借此在鏡下可區(qū)分I型和III型膠原并使用圖像分析軟件進(jìn)行定量分析[5]。雖然I型和III型膠原也可以通過其他方法如免疫組織化學(xué)、蛋白印跡法、聚合酶鏈反應(yīng)等方法檢測，但所用抗體昂貴，操作繁瑣費(fèi)時(shí)。天狼猩紅染色法則更為直觀、快捷、經(jīng)濟(jì)。此外，本研究中使用的Mayer蘇木素染液，可將細(xì)胞核染為紫色，使染色更為清晰，并避免將細(xì)胞核染色計(jì)入膠原纖維中計(jì)算纖維化面積比。

天狼猩紅染色也有其他證據(jù)證實(shí)其比Masson染色效果更好。在一項(xiàng)肝纖維化研究中發(fā)現(xiàn)，天狼猩紅能夠顯示肝小葉周圍含量很小的膠原纖維，而Masson染色不能。該研究中同時(shí)發(fā)現(xiàn)天狼猩紅染色計(jì)算出的纖維化面積比也小于Masson染色的纖維化面積比，提示天狼猩紅染色對膠原纖維有更好的特異性[1]。在關(guān)于腎臟、心臟、肝臟纖維化的研究中，也有研究發(fā)現(xiàn)天狼猩紅染色法和Masson染色

法雖然都能顯示膠原纖維，但天狼猩紅染色能進(jìn)一步區(qū)分膠原類型[6 - 9]。

在天狼猩紅染色過程中，也可以通過其他方法改進(jìn)染色效果。如將天狼猩紅溶于飽和苦味酸溶液中并用乙醇分色，以降低背景染色，提高染色效率，使膠原纖維顯色更為清晰。也有報(bào)道在苦味酸-天狼猩紅染色液基礎(chǔ)上加入亮綠染色液后染色效果更強(qiáng)，對比更明顯[10]。

綜上所述，Masson染色法、van Gieson染色法在光鏡下也可用于觀察宮腔粘連組織中的膠原纖維及分布特征，但天狼猩紅染色法較Masson和van Gieson染色法不僅能夠反映宮腔粘連組織纖維化的分布，還在膠原纖維的分型中發(fā)揮重要作用。所以在實(shí)際工作中，天狼猩紅染色法具有更大的優(yōu)勢。

參考文獻(xiàn)：

[1] Huang Y, de Boer WB, Adams LA, et al. Image analysis of liver collagen using sirius red is more accurate and correlates better with serum fibrosis markers than trichrome [J]. Liver Int, 2013, 33(8): 1249-1256.

[2] 魏勝男, 曾翔俊, 李匯華. 小鼠腎臟纖維化Masson染色方法的改進(jìn) [J]. 解剖學(xué)報(bào), 2013, 44(4): 576-579.

[3] Zhu Y, Hu J, Yu T, et al. High molecular weight hyaluronic acid inhibits fibrosis of endometrium [J]. Med Sci Monit, 2016, 22: 3438-3445.

[4] Li J, Cen B, Chen S, et al. MicroRNA-29b inhibits TGF-β1-induced fibrosis via regulation of the TGF-β1/Smad pathway in primary human endometrial stromal cells [J]. Mol Med Rep, 2016, 13(5): 4229-4237.

[5] Rittié L. Method for picrosirius red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections [J]. Methods Mol Biol, 2017, 1627: 395-407.

[6] 黃波, 肖影群, 鐘青梅, 等. 苦味酸-天狼猩紅偏振光法在肝纖維化研究中的應(yīng)用 [J]. 現(xiàn)代診斷與治療, 2015, 26(20): 4569-4572.

[7] 張哲, 王偉, 商建峰, 等. 膠原纖維特殊染色法在心肌纖維化診斷中的應(yīng)用比較 [J]. 診斷病理學(xué)雜志, 2016, 23(8): 578-580.

[8] 沈薔, 陳莉, 李昊, 等. 苦味酸-天狼猩紅染色和MASSON染色評價(jià)心臟纖維化的比較 [J]. 中國分子心臟病學(xué)雜志, 2012, 12(2): 118-120.

[9] 羅燦嶠, 莫木瓊, 鐘覺民. 天狼星紅苦味酸染色法和MASSON染色法在顯示大鼠腎臟膠原纖維的比較應(yīng)用 [J]. 臨床醫(yī)學(xué)工程, 2009, 16(8): 15-16.

[10] Cristina S, Chiara I, Luca A, et al. Histochemical detection of collagen fibers by Sirius Red/Fast Green is more sensitive than van Gieson or Sirius Red alone in normal and inflamed rat colon [J]. PLoS One, 2015, 10(12): e0144630.