李賀芝，段思明，王 茜*，劉 陽(.河北女子職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊 05009； .河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 05000)

何首烏是蓼科植物何首烏的干燥塊根，分為生首烏和制首烏兩個炮制品種，其中制首烏具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨、化濁降脂的功效；生何首烏則能解毒、消癰、截瘧、潤腸通便[1]。近年來何首烏致不良反應(yīng)的事件時有報道，因此中醫(yī)藥工作者就其安全性開展了一系列研究工作，現(xiàn)已確定何首烏應(yīng)用不當有一定的肝毒性。但也有研究發(fā)現(xiàn)何首烏大劑量使用還可以損傷腎臟，并推測其對腎臟的毒害作用可能是通過引起腎小球和(或)腎小管損傷后，造成腎小球濾過率減少，腎小管重吸收功能受損所致[2]?；诤问诪踔履I損傷鮮有報道，作為排泄器官，長期使用不能確保安全性，且炮制品種和提取溶劑不同會影響化學(xué)成分變化，勢必對藥物生物活性或毒性有所影響。因此，考慮到何首烏作為烏發(fā)的養(yǎng)生保健物品，用量較小，用藥時間較長，課題選擇2015版《中華人民共和國藥典》中制首烏的最低劑量[生藥6 g/(kg·d)]，連續(xù)給藥30 d，觀察何首烏對腎功能的損傷情況，同時結(jié)合目前中藥配方顆粒應(yīng)用廣泛，為了探討其安全性，本研究設(shè)置了生首烏及制首烏配方顆粒組與水提、醇提首烏組進行比較，并從細胞凋亡的角度，通過檢測抗細胞凋亡因子Bcl-2蛋白水平、促細胞凋亡因子BAX蛋白水平的變化，揭示腎損傷的機制，為保證臨床合理安全應(yīng)用何首烏提供科學(xué)依據(jù)，完善何首烏的藥性理論。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6周齡SD大鼠，清潔級，雌雄各半，體重(160±20) g，共70只，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK (冀) 2013-1-003]。實驗動物飼養(yǎng)于河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心動物室(萬級潔凈屏障系統(tǒng))，每籠飼養(yǎng)5只大鼠，恒溫恒濕[溫度：(23±2)℃，相對濕度：60%～70%]，12 h明/暗交替，動物自由進食水[SYXK (冀) 2016-0047]。

1.2 主要試劑與儀器

生、制何首烏飲片，由山東百味堂有限公司提供(產(chǎn)品批號：150601檢64)；生、制何首烏配方顆粒劑，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供(生首烏0.5 g相當于10 g生藥，產(chǎn)品批號：15040043；制首烏1 g相當于10 g生藥，產(chǎn)品批號：15070108)。何首烏水提藥液的制備：按照中藥化學(xué)水提法的制備工藝，取何首烏藥材165 g第一次加10倍量水，第二次加8倍量水，然后將煎煮的兩次藥液合并濃縮至所需濃度(每毫升0.06 g生藥)。何首烏醇提取藥液的制備：按照中藥化學(xué)醇提法的制備工藝，取何首烏藥材165 g用70%的乙醇回流提取2次，合并兩次藥液濃縮至所需濃度(每毫升0.06 g生藥)。何首烏配方顆粒藥液的制備：稱取16.5 g制首烏，8.25 g生何首烏配方顆粒，分別用沸水溶解，配成制首烏濃度為每毫升0.006 g配方顆粒的藥液，生首烏濃度為每毫升0.003 g配方顆粒的藥液，供實驗使用。

BAX抗體(BAX antibody，批號：sc-526)，Bcl-2抗體(Bcl-2 antibody，批號：sc-783)，由Santa Cruz Biotechnology, Inc.提供；3, 3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DAB，批號：D5905)，由Sigma-Aldrich提供；免疫組化試劑盒(Vectastain ABC Kit，批號：PK-4001)，由Vector Laboratories, Inc.提供；TUNEL試劑盒(IHC，批號：11684817910)，由Roche提供；肌酐試劑盒(Crea，批號：AUZ3562)，尿素氮試劑盒(BUN，批號：AUZ3611)，尿酸試劑盒(UA，批號：AUZ3654)，均由貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)有限公司提供；β2-微球蛋白試劑盒(β2-MG，批號：L160330919)，由武漢華美生物技術(shù)有限公司提供。

Humalyzer 2000半自動生化儀(德國豪邁)；DP73數(shù)碼顯微鏡(Olympus)；HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)(武漢同濟醫(yī)科大學(xué))；756MC型紫外-可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；酶標儀(Bio-Tek，ELx800)；電熱恒溫水箱(余姚市東方電工儀器廠，HH·W21·600型)；超低溫保存箱(MDF-382E，日本Sanyo)；高速冷凍離心機(1-15K，美國Sigma)；石蠟切片機(Leica)；等。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組給藥

SD大鼠，雌雄各半，分別按體重隨機分成7組，即生何首烏水提取藥液組(生藥0.6 g/kg，SW組)，制何首烏水提取藥液組(生藥0.6 g/kg，ZW組)，生何首烏醇提取藥液組(生藥0.6 g/kg，SA組)，制何首烏醇提取藥液組(生藥0.6 g/kg，ZA組)，生首烏配方顆粒組(生藥0.6 g/kg，SK組)，制首烏配方顆粒組(生藥0.6 g/kg，ZK組)，正常對照組，每組10只，雌雄各半。何首烏各組大鼠的給藥劑量按照人與大鼠體表系數(shù)法進行換算，大約相當于成人用藥量的0.1倍，故何首烏各給藥組按照生藥0.6 g/kg的劑量進行配制，給予相應(yīng)藥液灌胃，正常組給予生理鹽水灌胃，給藥體積均為1 mL/100 g，連續(xù)給藥30 d。給藥后觀察大鼠精神狀態(tài)、行為活動、飲食情況、二便情況、皮膚毛色。每隔7 d給大鼠稱重一次，自由進食水。實驗期間，按照動物實驗的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.3.2 樣本采集

給藥30 d后，禁食不禁水16 h，10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg)，腹主動脈取血，4℃，3500 r/min，離心20 min，分離血清，分裝后置于-70℃冰箱保存，待檢測血清尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、尿酸(UA)、β2-微球蛋白(β2-MG)指標變化。取血后迅速取大鼠左側(cè)腎臟置于4%多聚甲醛溶液中固定保存，待觀察腎組織病理形態(tài)、細胞凋亡狀況以及Bcl-2蛋白水平、BAX蛋白水平。因麻醉時，由于動物個體差異有過度麻醉致死的情況，故檢測血液和組織相關(guān)指標時，每組均選擇了8個標本進行檢測。

1.3.3 指標檢測

采用半自動生化分析儀檢測血清尿素氮、肌酐、尿酸水平，采用酶標儀檢測β2-微球蛋白指標變化；將多聚甲醛溶液固定的左側(cè)腎臟，石蠟包埋，切片，HE染色，采用HE染色觀察腎臟病理組織形態(tài)的變化；將多聚甲醛溶液固定的左側(cè)腎臟，石蠟包埋，切片，采用TUNEL法，按照試劑盒說明書檢測各組動物腎組織的細胞凋亡；采用免疫組化SP(streptavidin-perosidase)法，即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法，按照試劑盒說明檢測抗細胞凋亡因子Bcl-2蛋白水平、促細胞凋亡因子BAX蛋白水平。免疫組化指標采用平均光密度值來計算，分析時每組觀察8個樣本，每個樣本觀察10個視野取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 何首烏不同提取物對大鼠體重的影響

與正常對照組相比，各給藥組大鼠體重給藥前及給藥后無明顯變化(P> 0.05)；各給藥組之間體重差異亦無顯著性(P> 0.05)。見表1。

2.2 何首烏不同提取物對大鼠腎功能的影響

肌酐含量：各給藥組較正常對照組均有升高趨勢，但差異無顯著性(P> 0.05)；尿素氮含量：各給藥組尿素氮含量較正常對照組均有所降低(P< 0.05，P< 0.01)，但各給藥組之間差異無顯著性(P> 0.05)；尿酸含量：各給藥組較正常對照組均有升高趨勢，但差異無顯著性(P> 0.05)；β2-微球蛋白含量：各給藥組較正常對照組均有升高趨勢，其中以SA組和ZA組升高較為明顯，ZA組差異有顯著性(P> 0.05)。見表2。

表1 何首烏不同提取物對大鼠體重的影響Tab.1 Effects of Polygonum multiflorum extracts prepared with different processing methods and extraction solvents on the body weight of SD rats

表2 何首烏不同提取物對大鼠腎功能的影響Tab.2 Effects of Polygonum multiflorum extracts prepared with different processing methods and extraction solvents on the renal function of SD rats

注：與正常對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與生首烏水提組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note.Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the SW group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.3 何首烏不同提取物對大鼠腎臟病理組織形態(tài)的影響

正常對照組大鼠腎皮、髓質(zhì)分界清楚。腎皮質(zhì)內(nèi)腎小球未見萎縮、纖維化及肥大，腎近曲小管、遠曲小管及集合管的上皮細胞均未見顆粒樣變性、空泡變性及壞死改變，管腔內(nèi)未見細胞管型和蛋白管型。其中以生首烏醇提藥液組和配方顆粒組最為嚴重，出現(xiàn)大面積細胞空泡變性(損傷面積3/4以上)；其次為生首烏水提藥液組，制首烏醇提藥液組，出現(xiàn)局灶性細胞空泡變性(損傷面積1/2～3/4之間)；而制首烏水提藥液組病變最輕，偶見細胞空泡變性。見圖1。

注：A：正常對照組；B：生首烏水提組；C：制首烏水提組；D、E：生首烏醇提組；F：制首烏醇提組；G：生首烏免煎組；H：制首烏免煎組。圖1 何首烏不同提取物對腎組織病理形態(tài)的影響(HE染色，× 400)Note.A: Normal control group. B: Traditional water extract of raw Polygonum multiflorum group (SW group). C: Traditional water extract of prepared Polygonum multiflorum group (ZW group). D and E: 70% alcohol extract of raw Polygonum multiflorum group (SA group). F: 70% alcohol extract of prepared Polygonum multiflorum group (ZA group). G: Raw Polygonum multiflorum without decoction group (SK group). H: Prepared Polygonum multiflorum without water decoction group (ZK group).Fig.1 Effects of Polygonum multiflorum extracts prepared with different processing methods and extraction solvents on the histopathology of renal tissues in SD rats. HE staining

2.4 何首烏不同提取物對大鼠腎細胞凋亡的影響

細胞凋亡程度：各給藥組相對于正常對照組細胞凋亡程度均有顯著升高(P< 0.01)，SW組和SK組升高最明顯；與SW組相比，其他各實驗組平均光密度值均降低，其中SA組和ZK組降低最明顯，差異有顯著性(P< 0.01)。BAX蛋白表達：與正常對照組比較，SA組升高最明顯，差異有顯著性(P< 0.01)；與SW組相比，其他給藥組蛋白表達均升高，其中SA組和ZK組升高最明顯，差異有顯著性(P< 0.01)。Bcl-2蛋白表達：各組之間差異無顯著性(P> 0.05)。見表3、圖2～4。

表3 何首烏不同提取物對大鼠腎細胞凋亡及Bcl-2、BAX表達的影響Tab.3 Effects of Polygonum multiflorum extract prepared with different processing methods and extraction solvents on cell apoptosis and expression of Bcl-2 and BAX in renal tissues of the SD rats

注：與正常對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與生首烏水提組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note.Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the SW group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

注：A：正常對照組；B：生首烏水提組；C：制首烏水提組；D：生首烏醇提組；E：制首烏醇提組；F：生首烏免煎組；G：制首烏免煎組。圖2 何首烏不同提取物對腎組織細胞凋亡的影響(SP法，× 400)Note.A: Normal control group. B: Traditional water extract of raw Polygonum multiflorum group (SW group). C: Traditional water extract of prepared Polygonum multiflorum group (ZW group). D: 70% alcohol extract of raw Polygonum multiflorum group (SA group). E: 70% alcohol extract of prepared Polygonum multiflorum group (ZA group). F: Raw Polygonum multiflorum granules without water decocting extraction group (SK group), and G: Prepared Polygonum multiflorum granules without water decocting extraction group (ZK group).Fig.2 Effects of Polygonum multiflorum extract prepared with different processing methods and extraction solvents on cell apoptosis in renal tissues of the SD rats. SP method

注：A：正常對照組；B：生首烏水提組；C：制首烏水提組；D：生首烏醇提組；E：制首烏醇提組；F：生首烏免煎組；G：制首烏免煎組。圖3 何首烏不同提取物對腎組織細胞Bcl-2表達的影響(SP法，× 400)Note.A: Normal control group. B: Traditional water extract of raw Polygonum multiflorum group (SW group). C: Traditional water extract of prepared Polygonum multiflorum group (ZW group). D: 70% alcohol extract of raw Polygonum multiflorum group (SA group). E: 70% alcohol extract of prepared Polygonum multiflorum group (ZA group). F: Raw Polygonum multiflorum granules without water decocting extraction group (SK group). G: Prepared Polygonum multiflorum granules without water decocting extraction group (ZK group).Fig.3 Effects of Polygonum multiflorum extract prepared with different processing methods and extraction solvents on the expression of Bcl-2 in renal tissues of SD rats. SP method

注：A：正常對照組；B：生首烏水提組；C：制首烏水提組；D：生首烏醇提組；E：制首烏醇提組；F：生首烏免煎組；G：制首烏免煎組。圖4 何首烏不同提取物對腎組織細胞BAX表達的影響(SP法，× 400)Note.A: Normal control group. B: Traditional water extract of raw Polygonum multiflorum group (SW group). C: Traditional water extract of prepared Polygonum multiflorum group (ZW group). D: 70% alcohol extract of raw Polygonum multiflorum group (SA group). E: 70% alcohol extract of prepared Polygonum multiflorum group (ZA group). F: Raw Polygonum multiflorum granules without water decocting extraction group (SK group). G: Prepared Polygonum multiflorum granules without water decocting extraction group (ZK group).Fig.4 Effects of Polygonum multiflorum extract prepared with different processing methods and extraction solvents on the expression of BAX in renal tissues of the SD rats. SP method

3 討論

血清肌酐和尿素氮是臨床常用的內(nèi)源性腎功能評價指標。尿酸是嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，機體產(chǎn)生的尿酸通過腎小球濾過，經(jīng)腎小管重吸收，約有10%排出體外，若腎功能異常則尿酸水平升高[3 - 4]。β2-微球蛋白可自由通過腎小球毛細血管壁，經(jīng)過腎小球過濾后，幾乎全部由腎小管重吸收，并迅速分解。正常人β2-微球蛋白的合成和釋放相當恒定，體內(nèi)含量極其微小，故血β2-微球蛋白可用于評估腎小球的濾過功能，且在一定程度上甚至較肌酐、尿素氮更敏感[5]。本實驗結(jié)果顯示，何首烏不同提取方法、不同炮制品種均能影響大鼠腎功能指標，其中肌酐、尿酸、β2-微球蛋白水平均較正常對照組有升高趨勢，制首烏醇提藥液組β2-微球蛋白水平升高明顯，差異有顯著性；而血清尿素氮各給藥組水平較正常對照組顯著降低，提示機體可能處于代償階段。

細胞凋亡是細胞在生理或病理條件下，通過一些因子的調(diào)控自動結(jié)束生命的過程。生理情況下，老化細胞通過細胞凋亡得以清除；病理狀態(tài)下細胞凋亡參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[6 - 7]。若毒性藥物致臟器損傷，組織細胞會發(fā)生變性或壞死，對細胞凋亡有誘導(dǎo)作用。已有研究顯示，何首烏對人L02細胞有一定的誘導(dǎo)凋亡作用[8 - 11]。本實驗TUNEL染色顯示，各給藥組的平均光密度值均較正常對照組顯著提高，提示何首烏有助于誘導(dǎo)細胞的程序性死亡，但不同炮制品種和提取方法對凋亡的誘導(dǎo)作用無明顯差異。在細胞凋亡的調(diào)控方面，Bcl-2家族成員主要調(diào)控線粒體途徑，該家族成員包括抗凋亡因子和促凋亡因子。其中存在于線粒體外膜的Bcl-2是抗凋亡因子，存在于細胞質(zhì)或線粒體膜中的BAX是促凋亡因子，在細胞凋亡過程中，首先促凋亡因子被激活，通過線粒體途徑引起細胞凋亡，此時凋亡因子保護細胞不進入凋亡程序[12]。本實驗中各給藥組抗凋亡因子Bcl-2的平均光密度值與正常對照組比較有一定的上升趨勢，但無明顯差異，而促凋亡因子BAX的平均光密度值除生首烏醇提藥液組和制首烏配方顆粒組顯著升高外，其他給藥組有一定的降低趨勢，以水提藥液組降低最明顯，提示生首烏醇提取物和制首烏配方顆粒有一定的誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，可能是其導(dǎo)致腎臟損傷的作用機制。

另一方面，化學(xué)成分是藥物發(fā)揮作用或產(chǎn)生毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，而炮制方法及提取溶劑不同，會導(dǎo)致藥材所含化學(xué)成分有所變化。已有化學(xué)研究表明，生首烏主要含二苯乙烯類、蒽醌類、類磷脂類、多糖、鞣質(zhì)、無機元素等化學(xué)成分；而制首烏二苯乙烯苷、結(jié)合型蒽醌類物質(zhì)、卵磷脂、鞣制含量降低，多糖含量增加，并產(chǎn)生新的物質(zhì)；就提取溶劑而言，何首烏水提取液中水溶性成分較多，主要以鞣質(zhì)及多糖為主；醇提取液中主要是溶于乙醇的物質(zhì)，本研究中用70%的乙醇提取，而70%醇部分主要以結(jié)合蒽醌為主；配方顆粒是現(xiàn)代制劑，經(jīng)檢測以二苯乙烯苷及蒽醌類成分為主[13 - 16]。本研究中何首烏醇提組毒性最大，提示結(jié)合型蒽醌類物質(zhì)可能是何首烏腎毒性表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜合以上結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：何首烏長期使用對腎臟產(chǎn)生一定的損傷，主要表現(xiàn)為腎小管功能受損，而炮制方法和提取溶劑的不同對腎臟損傷有所不同。生首烏對腎臟的損傷大于制首烏，用乙醇提取何首烏對腎臟的損傷最大。因此，使用何首烏時需結(jié)合患者病情體質(zhì)根據(jù)醫(yī)囑用藥，建議腎

功能不全者需謹慎用藥，嚴重者應(yīng)禁用。當日常保健時不宜泡藥酒，建議用制首烏水煎服，且服用時最好定時監(jiān)測腎功能，尤其是β2-微球蛋白含量，避免長期使用出現(xiàn)不可逆的腎損傷。本研究僅對何首烏致腎損傷做了初步探討，該損傷是否可逆，還有待結(jié)合給藥劑量、時間的不同以及藥物洗脫時間的不同進一步探討，且針對醇提液對腎臟損傷程度較重，還需設(shè)計系統(tǒng)試驗，篩選精確指標，深入研究其損傷情況及機制。

參考文獻：

[1] 鐘贛生. 中藥學(xué) [M]. 第九版. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2012: 404.

[2] 楊德全. 何首烏致重癥肝損傷 [J]. 藥物不良反應(yīng)雜志, 2005, 7(6): 449.

[3] Mount DB, Kwon CY, Zandi-Nejad K. Renal urate transport [J]. Rheum Dis Clin North Am, 2006, 32(2): 313-331.

[4] 張云靜, 鄒作君, 于龍麗. 早期腎功能損害患者腎臟排泄尿酸各指標的比較與分析 [J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志, 2012, 13(1): 54-56.

[5] 黃翠瑤, 楊漢勤, 張松權(quán). 老年高血壓腎病血、尿微球蛋白的改變及其意義 [J]. 實用老年醫(yī)學(xué), 1993, 7(1): 40.

[6] Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease [J]. Science, 1995, 267(5203): 1456-1462.

[7] 皇甫冰, 高繼萍, 楊霞, 等. 氧化應(yīng)激與腎臟細胞凋亡 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 25(2): 54-60.

[8] 賈歌劉暢, 龐晶瑤, 柏兆方, 等. 何首烏及其成分對人正常肝細胞凋亡的影響 [J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2015, 22(11): 46-49.

[9] 衛(wèi)培峰, 黨艷麗, 焦晨莉, 等. 何首烏不同成分與肝細胞凋亡的相關(guān)性研究 [J]. 陜西中醫(yī), 2009, 30(2): 238-239.

[10] 孫雪東, 嚴一核, 劉芳, 等. 血必凈對膿毒性急性腎損傷大鼠腎小管細胞凋亡和相關(guān)蛋白表達的影響 [J]. 中華危重癥醫(yī)學(xué)雜志(電子版), 2016, 9(5): 315-320.

[11] 羅康, 樸尚國, 金英順, 等. 細胞凋亡和細胞自噬在慢性環(huán)孢素A腎毒性中的作用 [J]. 中國老年學(xué)雜志, 2014, 34(11): 3051-3053.

[12] Su E, Han X, Jiang G. The transforming growth factor beta 1/SMAD signaling pathway involved in human chronic myeloid leukemia [J]. Tumori, 2010, 96(5): 659-666.

[13] 王亭, 龔千鋒. 何首烏炮制后化學(xué)成分及藥理作用的研究進展 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2017, 23(2): 220-226.

[14] 龔彥勝, 張亞囡, 黃偉, 等. 與功效、毒性相關(guān)的何首烏化學(xué)成分研究進展 [J]. 中國藥物警戒, 2012, 9(8): 472-475.

[15] 胥愛麗, 董玉娟, 江潔怡, 等. 何首烏配方顆粒的UPLC指紋圖譜及化學(xué)成分歸屬 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2016, 22(2): 47-50.

[16] 林龍飛. 何首烏致肝損傷成分及作用機制研究 [D]. 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2016: Ⅰ.